Larva Fileto Hazırlama: Bozulmamış Duyusal Nöronları ve İlişkili Epidermal Hücreleri Görselleştirmek için Bir Yöntem

Overview

Bu videoda duyusal dendritik arborizasyon (da) nöronlarını ve ilişkili epidermal hücrelerini görselleştirmek için kullanılan larva filetolarının nasıl hazırlanacağı açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, hücrelerin morfolojisini korurken kas dokusunun vücut duvarından nasıl çıkarılacağını ayrıntılı olarak gösterir, bu da aksi halde gizlenen da nöronların ve epidermal hücrelerin immünostaining ve görselleştirilmesini geliştirir.

Protocol

Bu protokol Tenenbaum ve Gavis'ten bir alıntıdır, Duyusal Nöronların ve Epidermal Hücrelerin İmmünofluoresans Analizi için Drosophila Kas Dokusunun Larva Filetolarından Çıkarılması, J. Vis. Exp. (2016).

NOT: Kas çıkarma prosedürü (Şekil 1) larva filetolarını hazırlamak için daha önce açıklanan yöntemlerin bir modifikasyonudur. Kas çıkarılmasından önceki ve sonraki adımlar kısaca özetlenmiştir ve okuyucu Brent, vd., J. Vis. Exp. (2009) ve Karim ve Moore, J. Vis. Exp'teki önceki çalışmalara atıfta bulunulmuştır. (2011) daha ayrıntılı açıklamalar için.

1. Soğuk Tuzlu Suda Larvaları Diseksiyon

1. Soğuk HL3.1 salin veya soğuk Ca²⁺içermeyen HL3.1 salin(Tablo 1)çalışma seyreltme hazırlayın. Larvaları, yemeğin altını kaplayacak kadar soğuk salin içeren silikon bir elastomer kabına yerleştirin.
   NOT: Larva diseksiyonu sırasında standart HL3.1 salinine karşı Ca²⁺içermeyen HL3.1 salin kullanımını denemenizi öneririz. Kalsiyum yokluğunda, larva kas kasılmaları büyük ölçüde azalır. Bu nedenle, larva filetolarının Ca^{2+ içermeyen HL3.1}salininde parçalandığında manipüle edilmesi daha kolay olabilir. Bununla birlikte, kas kasılmasının kas ve epidermis arasında boşluk yarattığını ve bunun epidermisin hasar riskini en aza indirirken bu dokular arasına kümes uçlarının yerleştirilmesini kolaylaştırabileceğini görüyoruz. Sonuç olarak, epidermis ve da nöronların bütünlüğünü korumak için standart HL3.1 tercih edilebilir. Her iki salin ile de iyi sonuçlar elde ediyoruz ve seçim kullanıcıya bırakılıyor.
2. Larvayı ventral tarafı yukarı olacak şekilde konumlandırın. Larvaların ventral yüzeyi karın dentik kemerleri ve dorsal tarafı önden posterior'a uzanan birincil larva trakeal tüpleri ile tanımlanabilir. Larvayı ön-arka yönde uzatın ve başı ve kuyruğu böcek pimleri kullanarak silikon bir elastomer diseksiyon kabına sabitlayın. Ventral orta hat boyunca kesmek için ince diseksiyon makası kullanın, bir ucundan başlayıp diğerine doğru ilerleyin.
   NOT: Bu yönelim, yaygın olarak çalışılan da nöron dorsal kümesini korur.
3. Larva kesildikten sonra, dört köşeyi bir kitap açar gibi kesme kabına sabitlayın. CNS, bağırsak ve trakea dahil olmak üzere iç organları kapmak ve çıkarmak için tokmak kullanın. Böcek pimlerini fileto gergin olacak şekilde ayarlayın, ancak maksimum şekilde gerilmez.
   NOT: Kaslar segmental sınırlarda vücut duvarına tutturulmuş. Kaslar vücut duvarının çoğunu kaplamasına rağmen, sırt orta çizgisine yakın dar bir bölgede yoktur.

2. Kas Kaldırma

1. Kas dokusunun bulunmadığı larvaların dorsal orta çizgisini bulun. Mümkün olan en düz yönde kas dokusunun altına yerleştirilebilecek şekilde tek bir yaban arısı prong yerleştirin.
2. Dorsal orta çizgiden başlayarak, segmentin ön sınırına yakın, kas ve epidermis arasındaki prong'u dikkatlice kaydırın, epus ve epidermis arasındaki teması en aza indirmeye özen göstererek.
3. Bir çapa noktasında kasın vücut duvarına bağlanmasını kırmak için tokmakları yukarı doğru çekin. İlgi alanı kalan hemi segmentleri için bu işlemi yineleyin.
   NOT: Bu protokol, her da nöron dendrit alanının arka kısmının korunmasını optimize eder. Dendrit alanının ön kısmını korumak için, her segmentin arka ucuna ön uçları eklemek en iyisidir.
4. Böcek pimlerini larva filetosunda her yöne maksimum şekilde gerilmesi için yeniden ayarlayın.
5. Filetoyu, 25 dakika boyunca PBS'de soğuk, taze hazırlanmış% 4 formaldehit kullanarak hala diseksiyon kabına sabitlenmişken sabitlayın.
6. PBS'de 5 kez durulayın.
7. Epidermis ile teması en aza indirmeye özen göstererek, kalan bağlantı noktalarından kas dokusunu dikkatlice çekmek için epans kullanın.
8. Filetoyu diseksiyon kabından 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın ve çıkarın. Daha önce Karim ve Moore, J. Vis. Exp'te açıklandığı gibi, sonraki tüm yıkama, engelleme ve immünoresans boyama adımlarını gerçekleştirin. (2011).

Representative Results

Şekil 1: Kas Çıkarma Prosedürüne Genel Bakış. Bir larva parçalanır ve silikon bir elastomer diseksiyon kabına sabitlenir. Kas dokusunu çıkarmak için, kas ve epidermal hücre tabakası arasına, bir segment sınırına yakın dorsal orta çizgiden başlayarak bir epan uç uç yerleştirilir (2.2). Kas ve vücut duvarı arasındaki bağı kırmak için tokmaklar yukarı doğru çekilir (2.3). Bu, ilgi segmentleri için tekrarlanır ve daha sonra larva formaldehitte sabitlenir (2.5). Fiksasyondan sonra, geri kalan kas dokusunu vücut duvarından ayırmak için epans kullanılır (2.7 - 2.8) Larva kütikül ve epidermisi turuncu, sınıf IV da nöronlar yeşil ve kaslar kırmızı ile tasvir edilir. (2.2) ve (2.7) insets, tek bir larva hemi segmentinin kesitsel görünümlerini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1x HL3.1 salin (pH 7.2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mM CaCl2 (Ca2+içermeyen salin için atla)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

5 mM trehaloz

115 mM sakaroz

Filtre sterilize ve 4 °C'de saklayın

Not: Kompozisyon böcek hemolimfini taklit eder

Tablo 1: Soğuk Salin bileşimi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4