הכנת פילה זחל: שיטה לדמיין נוירונים חושיים שלמים ותאי אפידרמיס הקשורים

Overview

וידאו זה מתאר כיצד להכין פילה זחל המשמש לדמיין עצבי arborization דנדריטי חושי (da) נוירונים ותאי האפידרמיס הקשורים שלהם. הפרוטוקול המוצג מראה בפירוט כיצד להסיר רקמת שריר מקיר הגוף תוך שמירה על המורפולוגיה של התאים, אשר משפר immunostaining והדמיה של נוירונים da מוסתרים אחרת ותאי אפידרמיס.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך טננבאום וגוויס, הסרת רקמת השריר של דרוזופילה מפילה זחל לניתוח כשל חיסוני של נוירונים חושיים ותאי אפידרמיס, J. Vis. Exp. (2016).

שים לב: ההליך להסרת שרירים (איור 1) הוא שינוי של שיטות שתוארו קודם לכן להכנת פילה זחל. השלבים שקדמו להסרת השרירים ועקביהם מתוארים בקצרה והקורא מתייחס לעבודות קודמות בברנט, ואח ', J. Vis. Exp. (2009) וקארים ומור, J. Vis. Exp. (2011) לתיאורים מפורטים יותר.

1. לנתח זחלים מלוחים קרים

1. הכן דילול עבודה של מלוחים קרים HL3.1 או קר Ca^{2 +}- תמיסת מלח ללא HL3.1 (טבלה 1). מניחים את הזחל בצלחת אלסטומר סיליקון עם מלוחים קרים מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של המנה.
   שים לב: אנו ממליצים להתנסות בשימוש במים מלוחים מסוג Ca²⁺ללא HL3.1 לעומת מלוחים סטנדרטיים מסוג HL3.1 במהלך ניתוח הזחל. בהיעדר סידן, התכווצויות שריר הזחל מופחתות מאוד. לכן, פילה זחל עשוי להיות קל יותר לתפעל כאשר מנותח Ca^{2 +}- חינם HL3.1 מלוחים. עם זאת, אנו מוצאים כי התכווצות שרירים יוצרת רווח בין השריר לאפידרמיס וזה יכול להקל על החדרת מלקחיים בין רקמות אלה תוך מזעור הסיכון לנזק לאפידרמיס. כתוצאה מכך, HL3.1 סטנדרטי עשוי להיות עדיף לשמירה על שלמות האפידרמיס והנוירונים da. אנו משיגים תוצאות טובות עם מלוחים או והבחירה נשארת למשתמש.
2. מקם את הזחל עם הצד הגחוני למעלה. ניתן לזהות את פני השטח הגחוניים של הזחל על ידי חגורות הבטן הדנטיות ואת הצד הגבי על ידי צינורות קנה הנשימה הזחל הראשי פועל מן הקדמון לחלק האחורי. מתחו את הזחל בכיוון האחורי-שני והצמידו את הראש והזנב לצלחת ניתוח אלסטומר סיליקון באמצעות סיכות חרקים. השתמש מספריים ניתוח עדין לחתוך לאורך קו האמצע הגחוני, החל בקצה אחד ומתקדם לכיוון השני.
   שים לב: אוריינטציה זו משמרת את האשכול הגבי הנפוץ של נוירונים דה.
3. לאחר שהזחל נחתך, הצמד את ארבע הפינות למנה המנותחת כאילו פתח ספר. השתמש במלקחיים כדי לתפוס ולהסיר איברים פנימיים, כולל מערכת העצבים המרכזית, המעיים וקנה הנשימה. התאימו את סיכות החרקים כך שהפילה יהיה מתוח אך לא נמתח בצורה מקסימלית.
   שים לב: השרירים מעוגנים לקיר הגוף בגבולות סגמנטיים. למרות שהשרירים מכסים את רוב דופן הגוף, הם נעדרים באזור צר ליד קו האמצע הגבי.

2. הסרת שרירים

1. אתר את קו האמצע הגבי של הזחל, שבו רקמת השריר נעדרת. מקם דונג מלקחיים יחיד כך שניתן להכניס אותו מתחת לרקמת השריר בכיוון השטוח ביותר האפשרי.
2. החל מקו האמצע הגבי, ליד הגבול האמצעי של הקטע, להחליק בזהירות את המלקחיים דונג בין השריר ואפידרמיס, דואג למזער את המגע בין המלקחיים ואפידרמיס.
3. משוך את המלקחיים כלפי מעלה כדי לשבור את החיבור של השריר לקיר הגוף בנקודת עיגון אחת. חזור על תהליך זה עבור מקטעי ההמי הנותרים המעניינים.
   שים לב: פרוטוקול זה ממטב את השימור של החלק האחורי של כל שדה דנדריט של נוירון דה. כדי לשמר את החלק האחורי של שדה הדנדריט, עדיף להכניס את דונג המלקחיים בקצה האחורי של כל מקטע.
4. התאם מחדש סיכות חרקים כך שפילה הזחל נמתח באופן מקסימלי לכל הכיוונים.
5. תקן את הפילה בזמן שהוא עדיין מוצמד לצלחת הניתוח באמצעות קר, טרי מוכן 4% פורמלדהיד ב PBS במשך 25 דקות.
6. יש לשטוף 5 פעמים ב-PBS.
7. השתמש מלקחיים כדי למשוך בזהירות את רקמת השריר מנקודות העיגון הנותרות, מקפיד למזער את המגע עם האפידרמיס.
8. מוציאים ומוציאים את הפילה מהצלחת הנתיחה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. בצע את כל צעדי הכביסה, החסימה והכשל החיסוני הבאים, כפי שתואר קודם לכן בכרים ומור, J. Vis. Exp. (2011).

Representative Results

איור 1: סקירה כללית של הליך הסרת שרירים. זחל מנותח ומוצמד לצלחת ניתוח אלסטומר סיליקון. כדי להסיר רקמת שריר, אחד מלקחיים שיניים מוכנס בין השריר ואת שכבת התא האפידרמיס, החל מקו האמצע הגבי ליד גבול קטע (2.2). המלקחיים נמשכים כלפי מעלה כדי לשבור את הקשר בין השריר לקיר הגוף (2.3). זה חוזר על עצמו עבור קטעים של עניין ולאחר מכן הזחל קבוע פורמלדהיד (2.5). לאחר הקיבעון, מלקחיים משמשים כדי להפריד את רקמת השריר הנותרת מקיר הגוף (2.7 - 2.8) קוטיקל הזחל ואפידרמיס מתוארים בכתום, מחלקה IV da נוירונים בירוק, ושרירים באדום. הכניסות פנימה (2.2) ו- (2.7) מייצגות תצוגות חתך של מקטע חמי זחל יחיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1x HL3.1 מלוחים (עמ' 7.2)

5 מ"מ HEPES

70 מ"מ NaCl

5 מ"מ KCl

1.5 mM CaCl2 (השמטת מלוחים נטולי Ca2+)

4 מ"מ MgCl2

10 מ"מ NaHCO3

5 מ"מ טרהלוז

סוכרוז 115 מ"מ

מסנן לעקר ולאחסן ב 4 °C (69 °F)

הערה: הרכב מחקה המולמף חרקים

טבלה 1: הרכב מלוחים קרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4