लार्वा पट्टिका तैयारी: बरकरार संवेदी न्यूरॉन्स और एसोसिएटेड एपिडर्मल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो संवेदी डेंड्रिटिक आर्बोराइजेशन (दा) न्यूरॉन्स और उनके संबद्ध एपिडर्मल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लार्वा पट्टिकाओं को कैसे तैयार करता है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल विस्तार से दिखाता है कि कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हुए शरीर की दीवार से मांसपेशियों के ऊतकों को कैसे हटाया जाए, जो अन्यथा अस्पष्ट दा न्यूरॉन्स और एपिडर्मल कोशिकाओं के इम्यूनोस्टेटिंग और विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार करता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल टेनेनबॉम और गाविस का एक अंश है, जो संवेदी न्यूरॉन्स और एपिडरमल कोशिकाओं, जे विस एक्सपी (2016) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए लार्वा फिलेट्स से ड्रोसोफिला मांसपेशी ऊतक को हटाना है।

नोट: मांसपेशियों को हटाने की प्रक्रिया(चित्रा 1)लार्वा पट्टिका तैयार करने के लिए पहले वर्णित तरीकों का एक संशोधन है। कदम है कि पहले और मांसपेशियों को हटाने का पालन संक्षेप में उल्लिखित है और पाठक ब्रेंट, एट अल, जे विस Exp. (२००९) और करीम और मूर, जे विस Exp में पिछले काम करने के लिए भेजा जाता है । (2011) अधिक विस्तृत विवरण के लिए।

1. शीत खारा में लार्वा विच्छेदन

1. कोल्ड एचएल 3.1 नमकीन या कोल्ड सीए^{2 +}-फ्री एचएल 3.1 नमकीन(टेबल 1)का एक कामकाजी कमजोर पड़ने की तैयारी करें। डिश के नीचे को कवर करने के लिए बस पर्याप्त ठंड खारा के साथ एक सिलिकॉन इलास्टोमर डिश में लार्वा रखें।
   नोट: हम लार्वा विच्छेदन के दौरान सीए^{2 +}मुक्त एचएल 3.1 नमकीन बनाम मानक एचएल 3.1 नमकीन के उपयोग के साथ प्रयोग करने की सलाह देते हैं। कैल्शियम के अभाव में, लार्वा मांसपेशियों के संकुचन बहुत कम हो जाते हैं। इस प्रकार, सीए 2 + -मुक्त एचएल^3.1नमकीन में विच्छेदित होने पर लार्वा पट्टिका में हेरफेर करना आसान हो सकता है। हालांकि, हम पाते हैं कि मांसपेशियों में संकुचन मांसपेशियों और एपिडर्मिस के बीच जगह बनाता है और यह एपिडर्मिस को नुकसान के जोखिम को कम करते हुए इन ऊतकों के बीच संदंश के सम्मिलन की सुविधा प्रदान कर सकता है। नतीजतन, मानक HL3.1 एपिडर्मिस और दा न्यूरॉन्स की अखंडता को बनाए रखने के लिए बेहतर हो सकता है। हम या तो खारा के साथ अच्छे परिणाम प्राप्त करते हैं और विकल्प उपयोगकर्ता के लिए छोड़ दिया जाता है।
2. वेंट्रल साइड अप के साथ लार्वा को रखें। लार्वा की वेंट्रल सतह को पेट के दांतेकल बेल्ट और पृष्ठीय पक्ष द्वारा पूर्वकाल से पीछे तक चलने वाली प्राथमिक लार्वा श्वास नलियों द्वारा पहचाना जा सकता है। पूर्वकाल-पीछे की दिशा में लार्वा को फैलाएं और कीट पिनों का उपयोग करके सिर और पूंछ को सिलिकॉन इलास्टोमर विच्छेदन पकवान में पिन करें। वेंट्रल मिडलाइन के साथ काटने के लिए ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करें, एक छोर पर शुरू होते हैं और दूसरे की ओर प्रगति करते हैं।
   नोट: यह अभिविन्यास दा न्यूरॉन्स के आमतौर पर अध्ययन पृष्ठीय क्लस्टर को बरकरार रखता है।
3. लार्वा को खुला काटने के बाद, चार कोनों को विच्छेदन पकवान पर पिन करें जैसे कि एक किताब खोलना। सीएनएस, आंत और श्वासनली सहित आंतरिक अंगों को हड़पने और हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। कीट पिनों को समायोजित करें ताकि पट्टिका तना हुआ हो लेकिन अधिकतम रूप से फैला न हो।
   नोट: मांसपेशियों को खंडीय सीमाओं पर शरीर की दीवार पर लंगर डाले जाते हैं। हालांकि मांसपेशियों शरीर की दीवार के अधिकांश कवर, वे पृष्ठीय मिडलाइन के पास एक संकीर्ण क्षेत्र में अनुपस्थित हैं ।

2. मांसपेशियों को हटाना

1. लार्वा के पृष्ठीय मिडलाइन का पता लगाएं, जहां मांसपेशियों के ऊतक अनुपस्थित हैं। एक एकल संदंश शूल की स्थिति ऐसी है कि इसे फ्लैटटेस्ट संभव अभिविन्यास में मांसपेशियों के ऊतकों के नीचे डाला जा सकता है।
2. इस सेगमेंट की पूर्ववर्ती सीमा के पास, पृष्ठीय मिडलाइन से शुरू, बलदंश और एपिडर्मिस के बीच संपर्क को कम करने के लिए ध्यान रखते हुए, मांसपेशियों और एपिडर्मिस के बीच शूल को सावधानी से स्लाइड करें।
3. एक लंगर बिंदु पर शरीर की दीवार के लिए मांसपेशी के लगाव को तोड़ने के लिए संदंश ऊपर की ओर खींचो। ब्याज के शेष हेमी-सेगमेंट (एस) के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
   नोट: यह प्रोटोकॉल प्रत्येक दा न्यूरॉन डेंड्राइट क्षेत्र के पीछे के संरक्षण का अनुकूलन करता है। डेंड्राइट क्षेत्र के पूर्वकाल के हिस्से को संरक्षित करने के लिए, प्रत्येक खंड के पीछे के छोर पर संदंश को डालने के लिए सबसे अच्छा है।
4. कीट पिनों को फिर से समायोजित करें ताकि लार्वा पट्टिका सभी दिशाओं में अधिकतम रूप से फैला हो।
5. पट्टिका को ठीक करें, जबकि यह अभी भी ठंड का उपयोग कर विच्छेदन पकवान पर टिकी है, 25 मिनट के लिए PBS में हौसले से तैयार 4% फॉर्मलडिहाइड।
6. पीबीएस में 5 बार कुल्ला।
7. एपिडर्मिस के संपर्क को कम करने के लिए ध्यान से शेष लंगर बिंदुओं से मांसपेशियों के ऊतकों को दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
8. विच्छेदन पकवान से पट्टिका को 1.5 मिली माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में अनपिन करें और हटा दें। सभी बाद में धोने, अवरुद्ध, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला कदम प्रदर्शन, जैसा कि पहले करीम औरमूर, जे विस Exp में वर्णित है । (2011).

Representative Results

चित्रा 1: मांसपेशियों को हटाने की प्रक्रिया का अवलोकन। एक लार्वा विच्छेदन और सिलिकॉन इलास्टोमर विच्छेदन पकवान पर टिकी है। मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए, एक सेगमेंट सीमा (2.2) के पास पृष्ठीय मिडलाइन से शुरू होने वाली मांसपेशियों और एपिडर्मल सेल परत के बीच एक संदंश शूल डाला जाता है। मांसपेशियों और शरीर की दीवार (2.3) के बीच लगाव को तोड़ने के लिए संदंश को ऊपर की ओर खींचा जाता है। यह ब्याज के खंडों के लिए दोहराया जाता है और फिर फॉर्मलडिहाइड (2.5) में लार्वा तय किया जाता है। निर्धारण के बाद, शरीर की दीवार (2.7 - 2.8) से शेष मांसपेशियों के ऊतकों को अलग करने के लिए संदंश का उपयोग किया जाता है लार्वा क्यूटिकल और एपिडर्मिस को नारंगी, चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स में हरे रंग में और लाल रंग में मांसपेशियों में चित्रित किया जाता है। (2.2) और (2.7) में इंसेट एकल लार्वा हेमी-सेगमेंट के क्रॉस-सेक्शनल दृश्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1x HL3.1 खारा (पीएच 7.2)

5 एमएम एचईपी

70 एमएमएम एनएसीएल

5 एमएमएम केसीएल

1.5 mM CaCl2 (Ca2+-मुक्त खारा के लिए छोड़)

4 एमएमएम एमजीसीएल2

10 एमएमएम एनएएचसीओ3

5 m trehalose

115 एमएम सुक्रोज

4 डिग्री सेल्सियस पर स्टरलाइज और स्टोर करें

नोट: संरचना कीट हीमोलिम्फ की नकल करती है

तालिका 1: कोल्ड नमकीन की संरचना।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4