Larval Filet Forberedelse: En metode for å visualisere intakte sensoriske nevroner og tilknyttede epidermale celler

Overview

Denne videoen beskriver hvordan du lager larvalfileter som brukes til å visualisere sensorisk dendritisk arborisering (da) nevroner og deres tilknyttede epidermale celler. Den omtalte protokollen viser i detalj hvordan du fjerner muskelvev fra kroppsveggen samtidig som cellenes morfologi bevares, noe som forbedrer immunoppnåelse og visualisering av de ellers skjulte da nevronene og epidermale cellene.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Tenenbaum og Gavis, Fjerning av Drosophila Muscle Tissue fra Larval Fileets for Immunofluorescence Analyse av sensoriske nevroner og epidermale celler, J. Vis. Exp. (2016).

MERK: Prosedyren for muskelfjerning (figur 1) er en modifikasjon av tidligere beskrevne metoder for å forberede larvalfileter. Trinnene som går foran og følger muskelfjerning er skissert kort og leseren er referert til tidligere arbeid i Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) og Karim og Moore, J. Vis. Exp. (2011) for mer detaljerte beskrivelser.

1. Disseker larve i kald saltvann

1. Forbered en arbeidsfortynning av kald HL3.1 saltvann eller kald Ca²⁺-fri HL3.1 saltvann (Tabell 1). Legg larven i en silikonelastomerfat med akkurat nok kald saltvann til å dekke bunnen av parabolen.
   MERK: Vi anbefaler å eksperimentere med bruk av Ca²⁺-fri HL3.1 saltvann versus standard HL3.1 saltvann under larval disseksjon. I fravær av kalsium reduseres larvemuskelsammentrekninger sterkt. Dermed kan larvalfileter være lettere å manipulere når de dissekeres i Ca^{2 +}- gratis HL3.1 saltvann. Vi finner imidlertid at muskelkontraksjon skaper plass mellom muskelen og epidermis, og dette kan lette innsetting av tang mellom disse vevene samtidig som risikoen for skade på epidermis minimeres. Som et resultat kan standard HL3.1 være å foretrekke for å bevare integriteten til epidermis og da nevroner. Vi oppnår gode resultater med enten saltvann og valget er overlatt til brukeren.
2. Plasser larven med ventralsiden opp. Larvens ventrale overflate kan identifiseres av buk dentiske belter og dorsalsiden av de primære larval trakealrørene som går fra fremre til bakre. Strekk larven i den fremre bakre retningen og fest hodet og halen til en silikonelastomer dissekeringsfat ved hjelp av insektpinner. Bruk fin dissekering saks for å kutte langs ventral midtlinje, begynner i den ene enden og går mot den andre.
   MERK: Denne orienteringen bevarer den ofte studerte dorsale klyngen av da nevroner.
3. Etter at larven er kuttet åpen, fest de fire hjørnene til dissekeringsfatet som om du åpner en bok. Bruk tang til å gripe og fjerne indre organer, inkludert CNS, tarm og luftrør. Juster insektpinner slik at fileten er stram, men ikke maksimalt strukket.
   MERK: Muskler er forankret til kroppsveggen ved segmentale grenser. Selv om musklene dekker det meste av kroppsveggen, er de fraværende i et smalt område nær dorsal midtlinjen.

2. Fjerning av muskler

1. Finn larvens dorsale midtlinje, hvor muskelvev er fraværende. Plasser en enkelt tang slik at den kan settes inn under muskelvevet i flatest mulig retning.
2. Fra den dorsale midtlinjen, nær den fremre grensen til segmentet, skyv forsiktig tangen mellom muskelen og epidermis, og pass på å minimere kontakten mellom tang og epidermis.
3. Trekk tangene oppover for å bryte muskelfestet til kroppsveggen på ett ankerpunkt. Gjenta denne prosessen for de resterende interesserte hemisegmentene.
   MERK: Denne protokollen optimaliserer bevaring av bakre av hvert da neuron dendrite felt. For å bevare den fremre delen av dendritfeltet, er det best å sette tangpinnen på den bakre enden av hvert segment.
4. Juster insektpinnene slik at larvalfileten er maksimalt strukket i alle retninger.
5. Fest fileten mens den fortsatt er festet til dissekeringsfatet ved hjelp av kald, nylaget 4% formaldehyd i PBS i 25 minutter.
6. Skyll 5 ganger i PBS.
7. Bruk tang for å forsiktig trekke bort muskelvev fra de resterende ankerpunktene, og pass på å minimere kontakten med epidermis.
8. Løsne og fjern fileten fra dissekeringsfatet til et 1,5 ml mikrosenterrør. Utfør alle etterfølgende flekktrinn for vasking, blokkering og immunfluorescens, som tidligere beskrevet i Karim og Moore, J. Vis. Exp. (2011).

Representative Results

Figur 1: Oversikt over muskelfjerningsprosedyren. En larve dissekeres og festes til en silikonelastomer dissekeringsfat. For å fjerne muskelvev settes det inn en tang mellom muskel- og epidermalt cellelag, fra den dorsale midtlinjen nær en segmentgrense (2,2). Tangene trekkes oppover for å bryte koblingen mellom muskelen og kroppsveggen (2.3). Dette gjentas for segmenter av interesse, og deretter er larven festet i formaldehyd (2,5). Etter fiksering brukes tang til å skille det gjenværende muskelvevet fra kroppsveggen (2,7 - 2,8) Larvalkarakler og epidermis er avbildet i oransje, klasse IV da nevroner i grønt og muskler i rødt. Innfelt i (2.2) og (2.7) representerer tverrsnittsvisninger av et enkelt larval hemi-segment. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1x HL3.1 saltvann (pH 7.2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mM CaCl2 (utelate for Ca2 +-fri saltvann)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

5 mM trehalose

115 mM sukrose

Filtrer steriliser og oppbevar ved 4 °C

Merk: Sammensetningen etterligner insekt hemolymfe

Tabell 1: Sammensetning av kald saltvann.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4