Larvfilépreparat: En metod för att visualisera intakta sensoriska nervceller och tillhörande epidermala celler

Overview

Denna video beskriver hur man förbereder larvfiléer som används för att visualisera sensoriska dendritiska arborization (da) nervceller och deras associerade epidermal celler. Det presenterade protokollet visar i detalj hur man tar bort muskelvävnad från kroppsväggen samtidigt som cellernas morfologi bevaras, vilket förbättrar immunostaining och visualisering av de annars dolda da-nervcellerna och epidermala cellerna.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Tenenbaum och Gavis, avlägsnande av Drosophila muskelvävnad från larvfiléer för immunofluorescensanalys av sensoriska nervceller och epidermala celler, J. Vis. Exp. (2016).

OBS: Förfarandet för muskelborttagning (figur 1) är en ändring av tidigare beskrivna metoder för att förbereda larvfiléer. Stegen som föregår och följer muskelborttagning beskrivs kortfattat och läsaren hänvisas till tidigare arbete i Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) och Karim och Moore, J. Vis. Exp. (2011) för mer detaljerade beskrivningar.

1. Dissekera Larva i kall saltlösning

1. Bered en arbetsspädning av kall HL3.1 saltlösning eller kall Ca²⁺-fri HL3.1 saltlösning(tabell 1). Placera larven i en silikon elastomer skål med precis tillräckligt med kall saltlösning för att täcka botten av skålen.
   OBS: Vi rekommenderar att du experimenterar med användning av Ca²⁺-fri HL3.1 saltlösning jämfört med standard HL3.1 saltlösning under larv dissekering. I avsaknad av kalcium reduceras larvmuskelsammandragningar kraftigt. Larvfiléer kan således vara lättare att manipulera när de dissekeras i Ca^{2 +}-fri HL3.1 saltlösning. Vi finner dock att muskelkontraktion skapar utrymme mellan muskeln och epidermis och detta kan underlätta införandet av tång mellan dessa vävnader samtidigt minimera risken för skador på epidermis. Som ett resultat kan standard HL3.1 vara att föredra för att bevara integriteten hos epidermis och da nervceller. Vi får bra resultat med antingen saltlösning och valet lämnas till användaren.
2. Placera larven med ventralsidan uppåt. Larvens ventrala yta kan identifieras av buken dentical bälten och dorsala sidan av de primära larv trakeal rör som går från främre till bakre. Sträck larven i den främre bakre riktningen och fäst huvudet och svansen på en silikon elastomer dissekeringsform med insektsstift. Använd fin dissekerande sax för att skära längs den ventrala mittlinjen, börja i ena änden och gå mot den andra.
   OBS: Denna orientering bevarar det ofta studerade dorsala klustret av da nervceller.
3. När larven har skurits upp, fäst de fyra hörnen på dissekeringsrätten som om de öppnade en bok. Använd tång för att ta tag i och ta bort inre organ inklusive CNS, tarm och luftstrupe. Justera insektsstiften så att filén är spänd men inte maximalt sträckt.
   OBS: Musklerna är förankrade i kroppsväggen vid segmentgränser. Även om muskler täcker det mesta av kroppsväggen, är de frånvarande i en smal region nära den dorsala mittlinjen.

2. Muskelborttagning

1. Lokalisera larvens dorsala mittlinje, där muskelvävnad saknas. Placera en enda tång så att den kan sättas in under muskelvävnaden i den plattaste möjliga orienteringen.
2. Börja vid dorsala mittlinjen, nära segmentets främre gräns, skjut försiktigt tången mellan muskeln och epidermis, var noga med att minimera kontakten mellan tången och epidermis.
3. Dra tången uppåt för att bryta fastsättningen av muskeln på kroppsväggen vid en ankarpunkt. Upprepa den här processen för de återstående hemisegmenten av intresse.
   OBS: Detta protokoll optimerar bevarandet av bakre av varje da neuron dendrite fält. För att bevara den främre delen av dendritfältet är det bäst att sätta in tången i den bakre änden av varje segment.
4. Justera insektsstiften så att larvfilén är maximalt sträckt i alla riktningar.
5. Fixera filén medan den fortfarande är fastsatt på dissekeringsformen med kall, nylagad 4% formaldehyd i PBS i 25 min.
6. Skölj 5 gånger i PBS.
7. Använd tång för att försiktigt dra bort muskelvävnad från de återstående ankarpunkterna, var noga med att minimera kontakten med epidermis.
8. Ta bort och ta bort filén från dissekeringsformen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Utför alla efterföljande tvätt-, blockerings- och immunofluorescensfärgningssteg, som tidigare beskrivits i Karim och Moore, J. Vis. Exp. (2011).

Representative Results

Figur 1: Översikt över muskelborttagningsproceduren. En larva dissekeras och fästs på en silikon elastomer dissekeringsfat. För att avlägsna muskelvävnad sätts en tång mellan muskel- och epidermalcellskiktet, med början från den dorsala mittlinjen nära en segmentgräns (2.2). Tången dras uppåt för att bryta fästet mellan muskeln och kroppsväggen (2.3). Detta upprepas för segment av intresse och sedan är larven fixerad i formaldehyd (2,5). Efter fixering används tång för att separera den återstående muskelvävnaden från kroppsväggen (2,7 - 2,8) Larv nagelband och epidermis avbildas i orange, klass IV da nervceller i grönt och muskler i rött. Insets i (2.2) och (2.7) representerar tvärsnittsvyer av ett enda larv hemi-segment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

1x HL3.1 saltlösning (pH 7.2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mM CaCl2 (utelämna för Ca2+-fri saltlösning)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

5 mM trehalos

115 mM sackaros

Filtrera sterilisera och förvara vid 4 °C

Obs: Kompositionen efterliknar insekts hemolymf

Tabell 1: Sammansättning av kall saltlösning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4