라발 림프 선교: 드로소필라 혈청 생성 장기 분리

Overview

이 비디오는 플라이 애벌레에 있는 혈토포이스의 주요 사이트인 Drosophila 림프선에 대해 설명하고 면역 조직 화학 및 형광 화상 진찰을 위해 기관을 해부하고 장착하는 예제 프로토콜을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 레이멜스와 Pfleger에서 발췌, 드로소필라 애벌레에서 림프선과 혈구를 검사하는 방법, J. Vis. Exp. (2016).

1. 라발 림프선 면역 히스토케

참고: 림프선은 등쪽 측의 뇌 아래 약간 아래 애벌레의 전방 끝에서 약 1/3 길이에 위치합니다. (그림 1B에서화살표 참조.) 림프선은 등쪽 혈관을 측면으로 하며 입 후크 나 뇌에 부착된 가장 쉽게 해부됩니다. 야생 형, 세 번째 인스타 림프선은 매우 작은 구조입니다. 기본 엽은 길이가 약 100 ~200 μm이다. (그림 2A를참조하십시오.)

1. 이 분석기에 대해 대략 동일한 발달 단계의 애벌레를 얻으려면 여성이 2 - 6 시간의 고정 된 기간 동안 계란을 낳을 수 있도록하여 계란 수집을 제한하십시오.
2. 림프선 해부
   1. 각 실험 조건에 대해, 24웰 플레이트의 1웰에 1ml 1x PBS(표1)를추가합니다.
   2. 일회용 이송 파이펫을 사용하여 각 웰에 0.1 % PBST(표 1)의1 방울을 추가합니다.
      참고: Tween 20과 같은 세제는 표면 장력을 낮추기 위해 첨가되어 조직이 우물 바닥으로 가라 앉을 수 있게 합니다.
   3. 접시를 얼음 위에 평평하게 놓습니다.
   4. 1x PBS로 채워진 해부 접시 우물에서 애벌레를 수집합니다.
   5. 조명이 켜진 스테레오현미경 베이스에 깨끗한 해부 패드를 놓습니다. 일회용 이송 파이프를 사용하여 패드에 0.01 % PBST(표 1)의작은 방울을 놓습니다. 해부에 대한 PBST 드롭에 하나의 애벌레를 전송합니다.
   6. 후면 끝에서 약 1/1 길이의 포셉 한 쌍으로 애벌레를 잡아, 등쪽 측을 위로.
   7. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 유충을 들고있는 집게에 즉시 앞쪽으로 큐티클을 잡습니다. 입 후크가 노출될 때까지 큐티클을 앞쪽 끝으로 부드럽게 당깁니다.
      참고: 목표는 내부 구조를 방해하지 않고 표피를 벗기는 것입니다.
   8. 큐티클을 방출하고 두 개의 애벌레를 잘라 두 개의 집게를 사용합니다. PBST 드롭에서 후부 끝을 제거합니다.
      참고: 큐티클이 입 후크까지 벗겨지지 않으면 애벌레를 2개로 자르고 뒤쪽 끝을 제거합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 큐티클의 가장자리를 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 개구부를 밀어 넣습니다. 이것은 표피를 반전시키고 입 후크를 노출합니다. 이것은 또한 대체 해부 방법으로 사용할 수 있습니다.
   9. 한 쌍의 집게를 사용하여 큐티클(복부 표기, 등쪽 큐티클 플랩 또는 둘 다)을 고정하여 안정성을 제공합니다.
   10. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 노출 된 입 후크를 잡고 부드럽게 꺼냅니다.
       참고: 이렇게 하면 큐티클이 내부 구조와 분리됩니다. 이상적으로, 눈/안테나 상상 디스크, 두뇌, 링 선, 및 등류 혈관 측면 림프선은 입 갈고리에 부착 된 상태로 유지됩니다.
   11. 여전히 입 후크를 들고있는 동안 침샘, 지방 몸 및 장과 같은 원치 않는 구조를 조심스럽게 제거하십시오.
       참고: 뇌가 입 후크에서 분리되면 림프선이 뇌에 부착되어 수집 될 수 있습니다. 이 경우, 입 후크 대신 복부 신경 코드를 잡으십시오.
   12. 마우스 후크 또는 복부 신경 코드를 손잡이로 사용하여 림프선이 함유된 해부 된 복합체를 얼음 우물로 옮겨. 고정하기 전에 30 분 이상하지 마십시오.
3. 고정 및 면역 히스토케스화학
   1. 24웰 플레이트를 스테레오현미경 베이스에 놓습니다.
   2. p200 파이펫을 사용하여 우물에서 PBST를 조심스럽게 제거합니다.
      참고: 비어 있는 인접한 우물은 일시적으로 폐기물을 입금하는 데 유용합니다.
   3. 부드럽게 200 μl 3.7 % 포름알데히드(표 1)우물의 측면에 추가하고 해부 된 조직이 완전히 침수되도록 플레이트를 소용돌이.
   4. 접시를 얼음으로 30분 동안 되돌려 놓습니다. 림프선이 형광 단백질을 표현하는 경우, 광표백을 방지하기 위해 플레이트를 덮어 두십시오.
   5. p200 파이펫을 사용하여 고정을 조심스럽게 제거합니다.
   6. 우물에 200 μl 1x PBS를 추가하고 실온에서 5 분 동안 궤도 셰이커에 플레이트를 배치하여 세척하십시오. P200 파이펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
      참고: 고정 림프선은 모든 실험 조건에 대한 림프선이 해부되고 고정 될 때까지 PBS의 얼음에 남아있을 수 있습니다.
   7. 워시 단계를 두 번 더 반복합니다.
   8. 우물에 200 μl permeabilization 용액(표 1)을추가합니다. RT에서 45분 동안 궤도 셰이커에 판을 놓습니다.
      참고: 45분은 림프선 투과화를 위한 "금 본위제"이지만 저자는 20분 만에 성공을 거두었습니다.
   9. p200 파이펫으로 용액을 제거합니다.
   10. 공급자의 사양에 따라 항체 용액(표 1)으로1 차 항체를 희석시하십시오. 300 μl 1차 항체 용액을 우물에 추가하고 해부된 조직이 완전히 침수되도록 합니다. 하룻밤 동안 4 °C에서 배양하십시오.
   11. p200 파이펫을 사용하여 1차 항체를 제거합니다.
   12. 우물에 200 μl 1x PBS를 추가하고 실온에서 10 분 동안 궤도 셰이커에 플레이트를 배치하여 세척하십시오. P200 파이펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
   13. 워시 단계를 두 번 더 반복합니다.
   14. 공급자의 사양에 따라 항체 용액으로 이차 항체를 희석시하십시오. 300 μl 이차 항체 용액을 우물에 추가하고 해부된 조직이 완전히 침수되도록 하십시오. RT에서 적어도 2 시간 동안 궤도 셰이커에 인큐베이션.
   15. p200 파이펫을 사용하여 이차 항체를 제거하고 1.3.12 단계 및 1.3.13 단계에 설명된 대로 세척한다. 최종 세척 후 PBS를 제거하지 마십시오.
4. 림프선 장착
   1. 70% 에탄올(표1)과티슈 와이프를 사용하여 깨끗한 유리 현미경 슬라이드.
   2. 각 실험 조건에 대해 유리 슬라이드에 장착버퍼(표 1)를1방울씩 놓습니다.
      참고: 하나의 슬라이드에 두 가지 조건이 적합합니다. 장착 버퍼 볼륨은 장착할 림프선 수에 따라 달라집니다. 약 18 - 20 림프선에 2 μl, 10 - 12, 5 이하의 경우 0.5 μl을 사용합니다.
   3. 조명된 스테레오현미경 베이스에 현미경 슬라이드를 놓습니다.
   4. 한 번에 최대 2개의 조건에 대해, 모든 림프선을 양모로 장착 버퍼로 옮기고, 마우스 후크 또는 복부 신경 코드를 손잡이로 사용한다.
   5. 해부된 조직을 원형 또는 직사각형 모양으로 균등하게 공간화하여 프로세스의 장착 버퍼를 분산시합니다.
   6. 해부된 각 조직에 대해 개별적으로, 등대 용기 아래에 집게의 한 통을 밀어 내고 장착 버퍼의 주변쪽으로 부드럽게 당깁니다.
      참고: 이것은 해부된 조직의 나머지 부분에서 림프선을 그리고 유리에 있는 림프선을 평평하게 합니다.
   7. 집게의 통한과 톱질 동작을 사용하여 림프선과 뇌 사이의 등간 혈관을 잘라냅니다.
   8. 완충의 가장 바깥쪽 가장자리에 있는 림프선의 반대쪽으로 해부된 조직의 나머지 부분을 이동합니다.
      참고: 원치 않는 해부 조직은 결국 림프선 주위의 경계를 형성하고 커버 슬립이 휴식하는 지원 역할을합니다.
   9. 모든 림프선이 해부된 조직과 분리될 때까지 반복하여 원치 않는 해부된 조직 중 하나를 중앙에 배치할 자격이 있습니다.
   10. 두 손가락 사이에 덮개 슬립을 가져 가라. 커버슬립이 먼지와 지문이 없는지 확인합니다. 필요한 경우 티슈 티슈와 70% 에탄올을 사용하여 커버슬립을 청소하십시오.
   11. 커버슬립의 가장자리가 유리 슬라이드의 가장자리와 평행하게 되도록 하여 장착 버퍼 위로 덮개 슬립을 조심스럽게 낮춥니까.
       참고: 현미경 슬라이드는 이미징 전에 4 °C에서 저장할 수 있습니다. 최대 저장 시간은 사용되는 항체의 안정성에 따라 달라집니다. 24웰 플레이트는 헹구고 재사용할 수 있습니다.

2. 이미징

1. 제조업체의 작동 매뉴얼에 따라 20배 이상의 배율로 적절한 표준 형광 또는 공초점 현미경에 헤모사이클및 림프선에 장착된 심플란드를 이미지. 제조업체의 작동 매뉴얼에 따라 2배 배율의 표준 스테레오 현미경에 대한 이미지 전체 애벌레.
2. 원하는 경우 소프트웨어 공급자의 분출 지침을 따르십시오.

Representative Results

그림 1: 비보 크리스탈 셀 멜라늄화. A) 애벌레는 가열하기 전에 PCR 튜브에 개별적으로 배치되었다. 빨간색 화살표는 튜브의 바닥에없는 애벌레를 나타냅니다. B) 가열 후 전형적인 결정 세포 멜라늄 패턴이 있는데, 이는 때때로 림프선(화살표; 등쪽이 도시됨, 전방이 남습니다)을 드러낸다. 배율 막대는 1mm를 나타냅니다.

그림 2: 라발 림프선 면역 히스토케스화학. A) 등쪽 용기(dv), 1차 엽(1°), 보조 엽(2°)을 보여주는 제3의 항성 애벌레 림프선의 DIC 이미지. 스케일 바는 100 μm. B) 후방 신호 센터에서 수질 영역 및 GFP에서 EBFP2를 유전적으로 표현하는 애벌레의 대표적인 세 번째 인스타 애벌레 림프선. 림프선은 노치 세포 내 도메인 (빨간색)에 대한 항체로 염색되었다. 형광 현미경으로 촬영 된 변경되지 않은 이미지 (상단). deconvolution (아래)후 동일한 이미지. 배율 막대는 20 μm을 나타냅니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1