Dissection larvaire des glandes lymphatiques : isoler l’organe producteur d’hémocytes de Drosophila

Overview

Cette vidéo décrit la glande lymphatique de Drosophila — le site principal de l’hématopoïèse dans la larve volante — et montre un protocole d’exemple pour disséquer et monter l’organe pour l’immunohistochimie et l’imagerie fluorescente.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Reimels et Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).

1. Immunohistochimie larvaire de glande lymphatique

REMARQUE: La glande lymphatique est située à environ un tiers de longueur de l’extrémité antérieure d’une larve légèrement en dessous du cerveau sur le côté dorsal. (Voir flèche dans la figure 1B.) La glande lymphatique flanque le vaisseau dorsal et est plus facilement disséquée attachée aux crochets buccaux ou au cerveau. Les glandes lymphatiques de type sauvage et de troisième stade sont de très petites structures; les lobes primaires mesurent environ 100 à 200 μm de longueur. (Voir la figure 2A.)

1. Pour obtenir des larves d’à peu près au même stade de développement pour cet essai, limitez la collecte des œufs en permettant aux femelles de pondre des œufs pendant une période déterminée de 2 à 6 heures.
2. Dissection des glandes lymphatiques
   1. Pour chaque condition expérimentale, ajouter 1 ml 1 x PBS (tableau 1) à un puits d’une plaque de 24 puits.
   2. Ajouter 1 goutte de 0,1 % de PBST(tableau 1)à chaque puits à l’aide d’un tuyau de transfert jetable.
      REMARQUE: Le détergent, comme le préadolescent 20, est ajouté pour abaisser la tension de surface, ce qui permet au tissu de couler au fond du puits.
   3. Placer la plaque à plat sur la glace.
   4. Recueillir les larves dans des puits de vaisselle disséquants remplis de 1x PBS.
   5. Placez un tampon de dissecting propre sur une base de stéréomicroscope illuminée. Utilisez un pipet de transfert jetable pour placer de petites gouttes de 0,01% PBST (Tableau 1) sur le pad. Transférer une larve dans une goutte PBST pour la dissection.
   6. Tenez la larve avec une paire de forceps à environ un quart de longueur de l’extrémité postérieure, côté dorsale vers le haut.
   7. Utilisez une autre paire de forceps pour saisir la cuticule immédiatement antérieure aux forceps qui tiennent la larve. Tirez doucement la cuticule vers l’extrémité antérieure jusqu’à ce que les crochets de la bouche soient exposés.
      REMARQUE: L’objectif est d’éplucher la cuticule sans perturber les structures internes.
   8. Relâchez la cuticule et utilisez les deux forceps pour couper la larve en deux. Retirez l’extrémité postérieure de la goutte PBST.
      REMARQUE: Si la cuticule ne se décolle pas jusqu’aux crochets buccaux, couper la larve en deux et retirer l’extrémité postérieure. Utilisez une paire de forceps pour tenir le bord de la cuticule, et utilisez l’autre paire de forceps pour pousser les crochets de la bouche à travers l’ouverture. Ceci inversera la cuticule et exposera les crochets de bouche. Cela peut être utilisé comme une méthode de dissection alternative ainsi.
   9. Utilisez une paire de forceps pour épingler la cuticule (soit la cuticule ventrale, le rabat cuticule dorsale, ou les deux) pour la stabilité.
   10. Utilisez une autre paire de forceps pour saisir les crochets de la bouche exposés et retirez-les doucement.
       REMARQUE: Cela séparera la cuticule des structures internes. Idéalement, les disques imaginaux d’oeil/antenne, le cerveau, la glande d’anneau, et la glande lymphatique flanquant le vaisseau dorsal resteront attachés aux crochets de bouche.
   11. Tout en tenant les crochets de bouche, retirez soigneusement les structures non désirées telles que les glandes salivaires, le corps gras, et l’intestin.
       REMARQUE: Si le cerveau se sépare des crochets buccaux, la glande lymphatique peut encore être attachée et recueillie avec le cerveau. Dans ce cas, maintenez le cordon nerveux ventral au lieu des crochets de la bouche.
   12. À l’aide des crochets buccaux ou du cordon nerveux ventral comme poignée, transférez le complexe disséqué contenant la glande lymphatique au puits sur glace. Ne pas dépasser 30 min avant la fixation.
3. Fixation et immunohistochimie
   1. Placez la plaque de 24 puits sur la base du stéréomicroscope.
   2. Utilisez une pipette p200 pour retirer soigneusement le PBST du puits.
      REMARQUE: Les puits vides et voisins sont utiles pour déposer temporairement les déchets.
   3. Ajouter délicatement 200 μl de formaldéhyde à 3,7 %(tableau 1)sur le côté du puits et faire tourbillonner la plaque pour s’assurer que les tissus disséqués sont complètement submergés.
   4. Remettre la plaque sur la glace pendant 30 min. Si les glandes lymphatiques expriment des protéines fluorescentes, gardez la plaque couverte pour éviter le photobleaching.
   5. Utilisez une pipette p200 pour enlever soigneusement le fixatif.
   6. Lavez-le en ajoutant 200 μl 1x PBS au puits et en plaçant la plaque sur un shaker orbital pendant 5 min à température ambiante. Utilisez une pipette p200 pour retirer soigneusement le PBS.
      REMARQUE: Les glandes lymphatiques fixes peuvent être laissées sur la glace dans PBS jusqu’à ce que les glandes lymphatiques pour toutes les conditions expérimentales soient disséquées et fixées.
   7. Répétez les étapes de lavage deux fois de plus.
   8. Ajouter une solution de perméabilisation de 200 μl(tableau 1)au puits. Placez la plaque sur un shaker orbital pendant 45 min à RT.
      NOTE : 45 min est l’étalon-or pour la permeabilization de glande lymphatique mais les auteurs ont le succès après seulement 20 min.
   9. Retirez la solution avec une pipette p200.
   10. Diluer l’anticorps primaire avec la solution d’anticorps (tableau 1) selon les spécifications du fournisseur. Ajouter 300 μl de solution d’anticorps primaires au puits et s’assurer que les tissus disséqués sont complètement submergés. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
   11. Utilisez une pipette p200 pour enlever l’anticorps primaire.
   12. Lavez-le en ajoutant 200 μl 1x PBS au puits et en plaçant la plaque sur un shaker orbital pendant 10 min à température ambiante. Utilisez une pipette p200 pour retirer soigneusement le PBS.
   13. Répétez les étapes de lavage deux fois de plus.
   14. Diluer les anticorps secondaires avec la solution d’anticorps selon les spécifications du fournisseur. Ajouter une solution d’anticorps secondaire de 300 μl au puits et s’assurer que les tissus disséqués sont complètement submergés. Incuber sur un shaker orbital pendant au moins 2 heures chez RT.
   15. Utilisez une pipette p200 pour enlever l’anticorps secondaire et laver tel que décrit dans les étapes 1.3.12 et 1.3.13. N’enlevez pas le PBS après le lavage final.
4. Montée de glande lymphatique
   1. Lame de microscope en verre propre à l’aide de 70 %d’éthanol (tableau 1)et de lingettes tissulaires.
   2. Pour chaque condition expérimentale, placez une goutte de tampon de montage (Tableau 1) sur la glissière de verre.
      REMARQUE: Deux conditions s’adaptent sur une diapositive. Le volume tampon croissant dépend du nombre de glandes lymphatiques à monter. Utilisez 2 μl pour environ 18 à 20 glandes lymphatiques, 1 μl pour 10 à 12 et 0,5 μl pour 5 ou moins.
   3. Placez la lame de microscope sur une base stéréomicroscope illuminée.
   4. Pour un total de deux conditions à la fois, transférez toutes les glandes lymphatiques du puits au tampon de montage avec des forceps, en utilisant les crochets buccaux ou le cordon nerveux ventral comme poignée.
   5. Espacez les tissus disséqués uniformément dans une forme circulaire ou rectangulaire, en répandant le tampon de montage dans le processus.
   6. Pour chacun des tissus disséqués, individuellement, faites glisser une pince des forceps sous le vaisseau dorsal et tirez doucement vers la périphérie du tampon de montage.
      REMARQUE: Ceci tirera la glande lymphatique du reste des tissus disséqués et aplatira la glande lymphatique sur le verre.
   7. À l’aide d’une pince des forceps et d’un mouvement de sciage, couper le vaisseau dorsal entre la glande lymphatique et le cerveau.
   8. Déplacez le reste des tissus disséqués de l’autre côté de la glande lymphatique, à l’extrémité extérieure du tampon.
      REMARQUE: Les tissus disséqués indésirables finiront par former un périmètre autour des glandes lymphatiques et serviront de support sur lequel le coverslip reposera.
   9. Répétez jusqu’à ce que toutes les glandes lymphatiques soient séparées des tissus disséqués, en réservant l’un des tissus disséqués indésirables à placer au centre.
   10. Prenez un coverslip entre deux doigts. Vérifiez que le coverslip est exempt de poussière et d’empreintes digitales. Si nécessaire, utilisez un lingette tissulaire et 70% d’éthanol pour nettoyer le coverslip.
   11. S’assurer que le bord du coverslip est parallèle au bord de la glissière de verre, abaissez soigneusement le coverslip au-dessus du tampon de montage.
       REMARQUE: Les diapositives au microscope peuvent être stockées à 4 °C avant l’imagerie. Le temps de stockage maximum dépend de la stabilité des anticorps utilisés. Les plaques de 24 puits peuvent être rincées et réutilisées.

2. Imagerie

1. Image fixe ourmocytes et glandes lymphatiques montées sur une fluorescence standard appropriée ou microscope confocal à 20X ou grossissement plus élevé selon le manuel d’exploitation du fabricant. Image larves entières sur un stéréomicroscope standard au grossissement 2X selon le manuel d’exploitation du fabricant.
2. Suivez les instructions du fournisseur de logiciels pour la déconvolution, si vous le souhaitez.

Representative Results

Figure 1 : Mélanisation in vivo des cellules cristallines. A) Les larves ont été placées individuellement dans des tubes PCR avant le chauffage. Les flèches rouges indiquent les larves qui ne sont pas au fond des tubes. B) Un modèle typique de mélanine de cellules cristallines après chauffage, qui révèle parfois la glande lymphatique (flèche ; côté dorsal montré, l’antérieur est laissé). Barre d’échelle représente 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Immunohistochimie des glandes lymphatiques larvaires. A) Une image DIC d’une troisième glande lymphatique larvaire de stade montrant le vaisseau dorsal (dv), lobes primaires (1°), et lobes secondaires (2°). La barre d’échelle représente 100 μm. B) Une troisième glande lymphatique larvaire de stade représentative d’une larve exprimant génétiquement EBFP2 dans la zone médullaire et GFP dans le centre postérieur de signalisation. La glande lymphatique a été tachée d’un anticorps contre le domaine intracellulaire notch (rouge). Image inchangée prise avec un microscope de fluorescence (dessus). La même image après la déconvolution (en bas). Les barres d’échelle représentent 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1