拉瓦尔淋巴腺解剖：分离 德罗索菲拉 血细胞产生器官

Overview

这段视频描述了飞幼虫中造血的主要部位——果 蝇 淋巴腺，并展示了解剖和安装免疫化学和荧光成像器官的示例协议。

Protocol

本协议摘自雷梅尔斯和普弗莱格，方法检查淋巴腺和血细胞在 德罗索菲拉 拉瓦，J.Vis.Exp.（2016 年）。

1. 拉瓦尔淋巴腺免疫化学

注：淋巴腺距离后部略低于大脑的幼虫前端大约三分之一的长度。（见图1B中的箭头。淋巴腺侧翼的躯干血管，最容易解剖连接到嘴钩或大脑。野生型，第三星淋巴腺是非常小的结构：主叶长约100-200微米。（见图2A。）

1. 为了获得这种测定大致相同的发育阶段的幼虫，通过允许雌性在2-6小时的固定时间段内产卵来限制卵子的收集。
2. 淋巴腺解剖
   1. 对于每个实验条件，在24井板的一口井中加入1毫升1x PBS（表1）。
   2. 使用一次性输送管道向每口油井添加 1 滴0.1%PBST （表 1 ）。
      注： 洗涤剂，如Tween 20，被添加，以降低表面张力，使组织沉入井底。
   3. 将盘子平放在冰上。
   4. 收集幼虫在解剖盘井充满了1倍PBS。
   5. 将干净的解剖垫放在照明立体显微镜底座上。使用一次性传输管道将 0.01% PBST （表1）的小滴放在垫子上。将一个幼虫转移到PBST滴进行解剖。
   6. 用一对钳子抱住幼虫，从后端约四分之一长，后侧向上。
   7. 使用另一对钳子立即抓住夹紧幼虫的钳子前部的皮质层。轻轻地将皮质层拉向前端，直到嘴钩暴露。
      注： 目的是在不干扰任何内部结构的情况下剥开皮质层。
   8. 释放切片，并使用两个钳子将幼虫切成两截。从PBST掉落中删除后端。
      注： 如果皮质层没有一直剥到嘴钩上，将幼虫切成两截，并去除后端。使用一对钳子来保持皮质层的边缘，并使用另一对钳子将嘴钩推入开口。这将反转内质层并暴露嘴钩。这也可以用作替代解剖方法。
   9. 使用一对钳子固定角质层（无论是腹腔角质层、多头角质层皮瓣，或两者兼有）以获得稳定性。
   10. 用另一对钳子抓住裸露的嘴钩，轻轻地把它们拉出来。
       注： 这将将内层从内部结构中分离。理想情况下，侧身血管侧翼的眼睛/天生假想盘、大脑、环状腺和淋巴腺将保持附着在嘴钩上。
   11. 在保持口钩的同时，小心地去除不需要的结构，如唾液腺、脂肪体和肠道。
       注： 如果大脑与嘴钩分离，淋巴腺可能仍然附着在大脑上并收集。在这种情况下，保持心室神经线，而不是嘴钩。
   12. 使用口钩或心室神经线作为手柄，将含有淋巴腺的解剖复合物转移到冰上的井中。 固定前不超过 30 分钟。
3. 修复和免疫化学
   1. 将 24 井板放在立体显微镜底座上。
   2. 使用 p200 移液器小心地从井中取出 PBST。
      注： 空的，邻近的井是有用的暂时存放废物。
   3. 轻轻地在井边加入200微克3.7%的甲醛（表1），然后旋转板，以确保解剖的组织完全被淹没。
   4. 将盘子返回冰上30分钟。如果淋巴腺表达荧光蛋白，请保持板盖，以防止光漂白。
   5. 使用 p200 移液器小心地去除固定性。
   6. 将 200 μl 1x PBS 添加到井中，并在室温下将板放在轨道摇床上 5 分钟进行清洗。使用 p200 移液器小心地移除 PBS。
      注： 固定淋巴腺可以留在PBS的冰上，直到淋巴腺的所有实验条件被解剖和修复。
   7. 再重复两次洗涤步骤。
   8. 将 200μl 渗透溶液 （表 1）添加到井中。在 RT 将板放在轨道摇床上 45 分钟。
      注：45 分钟是淋巴腺渗透的"黄金标准"，但作者在20分钟后就取得了成功。
   9. 用 p200 移液器拆下解决方案。
   10. 根据供应商的规格，用抗体溶液（表1）稀释原抗体。在井中加入 300 μl 原抗体溶液，确保解剖组织完全被淹没。在4°C的夜间孵化。
   11. 使用 p200 移液器去除主要抗体。
   12. 将 200μl 1x PBS 添加到井中，并在室温下将板放在轨道摇床上 10 分钟进行清洗。使用 p200 移液器小心地移除 PBS。
   13. 再重复两次洗涤步骤。
   14. 根据供应商的规格，用抗体溶液稀释二次抗体。在井中加入 300 μl 二次抗体溶液，确保解剖组织完全被淹没。在RT的轨道摇床上孵育至少2小时。
   15. 使用p200移液器去除二次抗体，并按步骤1.3.12和1.3.13描述进行清洗。不要在最后洗涤后删除 PBS。
4. 淋巴腺安装
   1. 使用 70% 乙醇 （表 1）和纸巾进行清洁玻璃显微镜滑动。
   2. 对于每个实验条件，在玻璃滑梯上放置一滴安装缓冲器（表 1）。
      注： 两个条件适合一张幻灯片。安装缓冲体量取决于要安装淋巴腺的数量。使用 2 μl 约 18 - 20 淋巴腺， 1μl 为 10 - 12， 和 0.5 μl 为 5 或更少。
   3. 将显微镜幻灯片放在照明立体显微镜底座上。
   4. 一次最多两种情况，使用口钩或腹神经线作为手柄，将所有淋巴腺从井中转移到安装缓冲器。
   5. 以圆形或矩形形状均匀地将解剖的组织展开，在此过程中展开安装缓冲区。
   6. 对于每个被解剖的组织，单独滑动一钳的钳子在后轮下，轻轻地拉向安装缓冲器的外围。
      注： 这将从其他解剖组织中提取淋巴腺，并将玻璃上的淋巴腺压平。
   7. 使用钳子的一钳子和锯子运动，切断淋巴腺和大脑之间的躯干血管。
   8. 将其他解剖组织移到淋巴腺的另一侧，位于缓冲的最外缘。
      注： 不需要的解剖组织最终会在淋巴腺周围形成一个周长，并作为盖片赖以休息的支撑物。
   9. 重复，直到所有的淋巴腺从解剖组织分离，保留一个不需要的解剖组织放置在中心。
   10. 在两根手指之间滑一下盖子。检查盖片是否没有灰尘和指纹。如有必要，使用组织擦拭和 70% 乙醇清洁盖片。
   11. 确保盖片边缘与玻璃滑梯边缘平行，小心地降低安装缓冲器上的盖片。
       注： 显微镜幻灯片可在成像前存储在 4 °C。最大存储时间取决于所用抗体的稳定性。24井板可以冲洗和重复使用。

2. 成像

1. 图像固定血细胞，并安装淋巴腺在适当的标准荧光或对焦显微镜在20倍或更高的放大倍数根据制造商的操作手册。根据制造商的操作手册，在标准立体显微镜上以 2 倍的放大倍数对整个幼虫进行成像。
2. 如果需要，请按照软件提供商的下放说明操作。

Representative Results

图1：在活体晶体细胞黑色素化。A）拉瓦在加热前被单独放置在 PCR 管中。红色箭头表示不在管子底部的幼虫。B）加热后典型的晶体细胞黑色素化模式，有时显示淋巴腺（箭头;显示的后侧，前部左侧）。比例栏表示 1 毫米。请单击此处查看此图的较大版本。

图2：拉瓦尔·淋巴·格兰免疫化学。A）第三个星内幼虫淋巴腺的DIC图像，显示后部血管（dv）、主叶（1°）和次生叶（2°）。比例杆表示 100 μm. B）来自幼虫的第三个星幼虫淋巴腺，在静修区遗传上表示 EBFP2，在后信号中心表示 GFP。淋巴腺被一种抗体染色，对抗细胞内的缺口域（红色）。用荧光显微镜拍摄的未更改图像（顶部）。解体后相同的图像（底部）。比例栏表示 20μm。请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1