Floresan Mikroskopi için Böcek Bacaklarının İşleniş: Görüntüleme için Nöromüsküler Yapıları Koruma Yöntemi

Overview

Bu videoda, Drosophila yetişkin bacağını görüntüleme analizi için nöromuskülatını sağlam tutarken parçalamak, düzeltmek ve monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Protocol

Bu protokol Guan ve ark.,Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018)'den bir alıntıdır.

1. Bacak Diseksiyonu ve Fiksasyonu

1. Bir cam çok kuyulu plaka alın ve uygun sayıda kuyuyu% 70 etanol ile doldurun. Her kuyuya 15-20 CO₂-uyuşturulmış sinek (her iki cinsiyet ve herhangi bir yaşta) ekleyin ve bir fırça kullanarak, sinekler tamamen batırılana kadar sinekleri hafifçe etanol çözeltisine ekleyin.
   NOT: Bu adım, oksikül hidrofobikliğini gidermektir. 1 dakikadan fazla yıkamayın, çünkü bu lütikalenin otomatik floresanını arttırır.
2. Sinekleri 1x fosfat tamponlu salinde (PBS) % 0,3 noyonik yüzey aktif deterjan çözeltisi ile 3 kez durulayın. Sinekleri bu çözeltide en az 10 dakika tutun.
   NOT: Bacaklar deterjan dahil edildiğinde daha iyi sabitlenir, bu da fiksatifin bacak içindeki penetrasyonunu artırması muhtemeldir.
3. %4 paraformaldehit (PFA) tüpü ile birlikte buza çok kuyulu bir plaka yerleştirin.
   NOT: %16 PFA etanol içermeyen stok çözümünden taze %4 PFA hazırlanması kritik öneme sahiptir.
4. Torasik segmente veya bacaklara zarar vermeden sineklerin başını ve karnını çıkarmak için ön ayaklar kullanın.
   NOT: Karnın çıkarılması, sineği tutmayı ve bacakları parçalamayı kolaylaştırır.
5. Bacakları torasik segmentten tosplarla ayırın ve bacakları% 4 PFA içeren kuyulara yerleştirin. Bunun için, bacak kopana kadar ince forseps ucunu kullanarak coxa-thorax kavşağında hafifçe ama sıkıca itin.
6. Bacakları bir gecede %4 PFA'da 4 °C'de (toplam yaklaşık 20 saat) sabitle.
7. Bacakları 1x PBS'de% 0.3 noniyonik yüzey aktif deterjan çözeltisi ile yıkayın, her biri 20 dakika boyunca 5x.
8. Yıkama tamponu montaj ortamı ile değiştirin. Bacağı, bacağa tam penetrasyonunu sağlamak için montajdan önce en az bir gün boyunca montaj ortamında tutun.
   NOT: Montaj ortamı oldukça viskoz ise, montaj ortamını 1x PBS ile% 80'e seyreltin, çünkü viskozitedeki ani değişiklik lütisin çökmesine ve bacağın genel yapısına zarar verebilir. Gal4 sürücüsüne bağlı olarak, sinekler montaja kadar montaj ortamlarında 4 °C'de 1 ila 3 hafta korunabilir.

2. Bacak Montajı

1. Mikroskop kaydırağın sol tarafına yaklaşık 20 μL%70 gliserol yerleştirin ve kare 22 x 22 mm² kapaklı örtü(Şekil 1A,B). Pipet, bu kapak çizgisinin sağ kenarına paralel ve küçük bir mesafedeki bir hat boyunca yaklaşık 10 μL montaj ortamı. Slaydın sağ tarafına 30 μL daha montaj ortamı ekleyin(Şekil 1C).
   NOT: Bacakların üzerine bir kapak kılıfı uygularken (aşağıya bakın) montaj ortamı, örtünün altına ve bacakların etrafına onları yerinden etmeden hafifçe yayılacaktır.
2. İnce forseps kullanarak bacağı çözeltiden kaldırın ve yavaşça sol kapak kılıfına yakın montaj ortamına koyun. Her bacak için aynı şeyi yapın ve yukarıdan aşağıya hizalayın (Şekil 1D).
   1. Bacakları, her iki uç arasında tutulan bir orta damlada kaldırın ve aktarın. Bacakları iki şekilde yönlendirin: dış taraf yukarı veya aşağı.
3. Tüm bacaklar (6-8 ayağa kadar monte edilebilir) düzgün bir şekilde hizalandıktan sonra, bacakların üzerine ikinci bir kapak zarı koyun, böylece bu kapak kapağı, kapakla doku arasında boşluk sağlamak ve bacakların zarar görmesini önlemek için daha önce yerleştirilmiş kapak kılıfı Şekil 1E'ye hafifçe dayanır(Şekil 1G).
   NOT: Alternatif olarak, kapakçık ve slayt arasında boşluk oluşturmak için çıkartma kuyuları veya ortodontik balmumu kullanın.
4. Her köşedeki kapakların konumunu sabitlemek için bir oje kullanın (Şekil 1F).
   NOT: Doku artık görüntü vermeye hazır.

Representative Results

Şekil 1: Bacakları mikroskop slaytlarına monte etme prosedürü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium