Chorion और Vitelline झिल्ली यांत्रिक हटाने: प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए ड्रोसोफिला Oocytes तैयार करने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो पहले से तय परिपक्व ड्रोसोफिला ओसाइट्स से कोरियोन और विटेलिन झिल्ली को यांत्रिक रूप से हटाने की एक विधि का वर्णन करता है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल सीटू संकरण परख में फ्लोरोसेंट के साथ संगत ओसाइट्स उपज प्रक्रिया का एक विस्तृत प्रदर्शन दिखाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल पर्किंस और बिकेल का एक अंश है, जो प्रोमेटाफेज और मेटाफेज आई ड्रोसोफिला ओसाइट्स, जे विस एक्सपीमें आर्म सामंजस्य की स्थिति की निगरानी करने के लिए सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) में फ्लोरेसेंस का उपयोग कर रहा है। (2017).

1. कोरियोन्स और विटेललाइन झिल्ली को हटाना

नोट: आवश्यक उपकरणों के लिए चित्रा 1 देखें।

1. अलग देर चरण oocytes
   1. उथले विच्छेदन पकवान में 1 एमएल पीबीएसबीटीएक्स जोड़ें। उथले पकवान में निश्चित अंडाशय (~ 150 μL में) स्थानांतरित करने के लिए बीएसए लेपित टिप के साथ एक P200 का उपयोग करें। कम परिपक्व ओसाइट्स से परिपक्व ओसाइट्स को उखाड़ फेंकने के लिए बीएसए कोटेड पिपेट टिप के साथ पिपेट अंडाशय ऊपर और नीचे।
   2. जब देर से चरण oocytes पर्याप्त रूप से अलग कर रहे हैं, एक ५०० μL माइक्रोफ्यूज ट्यूब के लिए सभी ऊतकों को स्थानांतरित । एक खींचा पाश्चुर पिपेट के साथ अतिरिक्त तरल निकालें, ट्यूब में लगभग 150 - 200 माइक्रोन छोड़ दें। शेष जीनोटाइप के लिए धारा 1.1 दोहराएं।
2. रोलिंग के लिए तैयार
   1. PBSBTx के 200 μL के साथ एक गहरी अच्छी तरह से पकवान को प्री-गीला करें। कवर करें और अलग सेट करें। 3 पाले से ओढ़लिया ग्लास स्लाइड प्राप्त करें और स्लाइड #3 को अलग सेट करें। धीरे-धीरे स्लाइड के पाले से ओढ़े हुए ग्लास क्षेत्रों को रगड़ें #1 और #2 एक साथ करें। किसी भी ग्लास शार्ड्स को हटाने और डिस्पोजेबल पोंछ के साथ सूखने के लिए उन्हें डिओनाइज्ड पानी में कुल्ला करें।
   2. स्लाइड के पाले से ओढ़े हुए क्षेत्रों को एक स्लाइड में पीबीएसबीटीएक्स के 50 माइक्रोन जोड़कर पीबीएसबीटीएक्स के #1 और #2 और दूसरी स्लाइड के साथ इस क्षेत्र को रगड़कर कोट करें। डिस्पोजेबल वाइप के साथ लिक्विड निकालें।
   3. चित्रा 2एमें दिखाए गए विन्यास में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइड्स रखें । स्लाइड के पाले से ओढ़े हुए क्षेत्रों को #1 और #2 संपर्क में रखें, स्लाइड #3 सहायक स्लाइड #2 के साथ।
3. रोल oocytes; सुनिश्चित करें कि रोलिंग की दिशा हमेशा एक सीधी रेखा में होती है और कभी भी गोलाकार गति नहीं होती है।
   1. PBSBTx में एक P200 पिपेट टिप को प्रीवेट करें और माइक्रोफ्यूज ट्यूब में ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ओसाइट्स को तितर-बितर करें। स्लाइड #1 के पाले से ओढ़े हुए कांच के हिस्से के केंद्र में ओसाइट्स युक्त तरल के 50 माइक्रोन को स्थानांतरित करें। लिफ्ट स्लाइड #2 ऐसा करने के लिए ।
   2. धीरे-धीरे कम स्लाइड #2 जब तक तरल की सतह तनाव दो पाले से ओढ़े हुए ग्लास क्षेत्रों के बीच एक सील बनाता है। पाले से ओढ़े हुए क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त तरल होना चाहिए लेकिन किसी को भी बाहर रिसाव नहीं होना चाहिए । यदि तरल बह रहा है, तो अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक खींचा पाश्चुर पिपेट का उपयोग करें।
   3. एक हाथ से नीचे की स्लाइड (#1) को पकड़ें और दूसरे हाथ का उपयोग एक क्षैतिज दिशा में शीर्ष स्लाइड (#2) को आगे और पीछे ले जाने के लिए करें, स्लाइड #2 स्तर को ध्यान में रखते हुए और स्लाइड #3 पर समर्थित रहें। ओसाइट आंदोलनों और प्रगति के आसान दृश्य के लिए माइक्रोस्कोप के तहत प्रदर्शन करें।
      नोट: यह आंदोलन घर्षण उत्पन्न करेगा और ओसाइट्स को "रोल" करने और अपने कोशन खोने का कारण बनेगा। न्यूनतम दबाव का उपयोग किया जाना चाहिए और आंदोलनों को छोटा और त्वरित होना चाहिए।
   4. क्षैतिज दिशा में कुछ आंदोलनों के बाद, आंदोलन के कोण को थोड़ा बदलें(चित्रा 2बी)। कई वेतन वृद्धि में, धीरे-धीरे इस कोण को 90 डिग्री तक बढ़ाएं जब तक कि शीर्ष स्लाइड (#2) का आंदोलन प्रारंभिक दिशा(चित्रा 2बी)के लंबवत न हो जाए। ध्यान दें कि खाली कोशन तरल में दिखाई देंगे और कोरियोन की कमी वाले ओसाइट्स लंबे और पतले दिखाई देंगे।
   5. जब तक समाधान थोड़ा बादल न हो जाए तब तक चरण 1.3.3 - 1.3.4 के बारे में 7 - 10 बार दोहराएं। जब ओसाइट्स का बहुमत (75 - 85%) ऐसा प्रतीत होता है कि उनकी विटेललाइन झिल्ली खो गई है।
      नोट: एक विशिष्ट नुकीला अंत अक्सर ऊसाइट्स पर दिखाई देता है जिसमें विटेलिन झिल्ली की कमी होती है। विटेललाइन झिल्ली को कोन्स की तुलना में हटाना अधिक कठिन होता है। विटेललाइन झिल्ली को हटाने को प्राप्त करने के लिए रोलिंग करते समय शीर्ष स्लाइड (स्लाइड #2) पर हल्का दबाव लागू किया जा सकता है। सभी ओसाइट्स से विटेलिन झिल्ली को हटाने की कोशिश करने से अक्सर अन्य ओसाइट्स का विनाश होता है।
   6. धीरे-धीरे शीर्ष स्लाइड (#2) उठाएं, अपने कोनों में से एक को नीचे स्लाइड (#1) के पाले से ओढ़े हुए क्षेत्र के केंद्र में खींचते हैं ताकि लुढ़का हुआ ओसाइट्स पाले से ओसाइट्स के केंद्र में जमा हो। PBSBTx युक्त गहरी अच्छी तरह से पकवान में PBSBTx के साथ दोनों स्लाइड से oocytes कुल्ला ।
   7. साफ स्लाइड #1 और अल्ट्रापुरे पानी के साथ #2, एक डिस्पोजेबल पोंछ के साथ सूखी, और रीसेट । एक ही जीनोटाइप के सभी oocytes लुढ़का दिया गया है जब तक कदम 1.3.1 - 1.3.6 दोहराएं। इसके लिए आमतौर पर प्रति जीनोटाइप रोलिंग के 3 - 4 राउंड की आवश्यकता होती है।
4. रोलिंग के बाद मलबा हटाएं
   1. 15 एमएल शंकु नली में 1 एमएल पीबीएसबीटीएक्स जोड़ें। ट्यूब के किनारों को कोट करने के लिए तरल को भंवर करें।
   2. PBSBTx कोटेड P1000 पिपेट टिप का उपयोग करके, रोल्ड ओसाइट्स को डीप वेल डिश से पीबीएसबीटीएक्स के 1 मिलियन 1 एमएल युक्त शंकु नली में स्थानांतरित करें। oocytes युक्त शंकु ट्यूब में PBSBTx का एक अतिरिक्त 2 मिलियनल जोड़ें।
   3. ओसाइट्स को नीचे बसने दें, फिर एक P1000 के साथ मलबे (कोरियोन्स, विटेलिन्स, आदि)वाले समाधान के शीर्ष 2 एमएल को हटा दें और त्यागें। यदि आवश्यक हो, तो अपारदर्शी ओसाइट्स देखने के लिए अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ शंकु नली पकड़ें क्योंकि वे डूबते हैं।
   4. oocytes के लिए PBSBTx के एक अतिरिक्त 2 मिलियन जोड़ें, और दोहराने कदम 1.4.3। दोहराएं 1.4.3। मलबे को हटाने के कुल 3 राउंड के लिए।
   5. PBSBTx लेपित P1000 पिपेट टिप का उपयोग करके, मूल 500 माइक्रोफ्यूज ट्यूब पर वापस ओसाइट्स स्थानांतरित करें। 20 - 25 महिलाओं को लगभग 50 माइक्रोनल लुढ़का हुआ परिपक्व ओसाइट्स प्राप्त करना चाहिए।
5. ताजा पाले से ओढ़लिया स्लाइड, एक साफ गहरी अच्छी तरह से पकवान, और प्रत्येक जीनोटाइप के लिए एक नया शंकु नली का उपयोग कर शेष जीनोटाइप के लिए धारा 4 दोहराएं ।
6. यदि भंडारण आवश्यक है, तो 0.1% ट्रिशनएक्स-100 के साथ 1x पीबीएस में ओसाइट्स स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें। दीर्घकालिक भंडारण की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग को गैर-आयनिक डिटर्जेंट द्वारा उलट दिया जा सकता है।

Representative Results

चित्रा 1: साइटोलॉजी उपकरण। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरण: (1) संदंश की जोड़ी (#5 ड्यूमोंट); (2) टंगस्टन सुई; (3) कवर के साथ गहरी अच्छी तरह से पकवान; (4) उथले कांच विच्छेदन पकवान; (5) पाश्चुर पिपेट खींचा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2: रोलिंग oocytes के लिए स्लाइड की व्यवस्था और आंदोलन। (क) प्रोटोकॉल में वर्णित ओसाइट्स के रोलिंग के लिए स्थापित स्लाइड का आरेख । गहरा क्षेत्र स्लाइड के पाले से ओढ़े हुए कांच के हिस्से को दर्शाता है। (ख) ओसाइट रोलिंग के दौरान स्लाइड #2 के लिए मूवमेंट वैक्टर की दिशा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes