Overview
La hemolífago drosophila sirve como sangre y líquido intersticial, circulando por todo el cuerpo durante las etapas larvarias y adultas. Este video describe un protocolo para recolectar hemolífanos larvarios con el fin de cuantificar las células circulantes.
Protocol
Este protocolo es un extracto de Reimels y Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).
1. Concentración de hemocitos circulantes
- Para obtener larvas de aproximadamente la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restringir la recolección de huevos permitiendo a las hembras poner huevos durante un período de tiempo fijo de 2 a 6 horas.
- Recoger larvas en la disección de pozos de platos llenos de 1x fosfato tamponado solución salina (PBS).
- Para cada larva, coloque 10 μl 1x PBS en un tubo de microcentrífuga sobre hielo y 10 μl 1x PBS en una almohadilla de disección limpia. Coloque la almohadilla de disección sobre una base de estereomicroscopio iluminada.
- Seque una larva individual colocándola en una toallita de tejido antes de transferirla a una gota de PBS en la almohadilla de disección.
- Usando un par de fórceps, abre suavemente y invierte cuidadosamente la cutícula para liberar el hemolífico.
NOTA: Tener cuidado de no raspar o golpear la cutícula, ya que esto potencialmente podría liberar hemocitos sesionables. - Usando un pipete, recoge el hemolymph de la almohadilla de disección. Evite recoger desechos larvarios como el cuerpo de grasa.
- Agregue la hemolífafa a un tubo de microcentrífuga y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
NOTA: Varias muestras se pueden recoger a la vez y mantenerse en hielo durante un tiempo. - Opcional: Mezcle trypan azul con la muestra de hemolífanos en partes iguales para teñir y excluir las células muertas. Cuente las células dentro de 3 minutos de añadir trypan azul porque es tóxico para las células.
- Mezcle la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de cargar 10 μl en una cámara de hemociclo.
- Si utiliza un contador de celdas automatizado, establezca los parámetros adecuados para el tamaño de celda y la circularidad. Por ejemplo, establezca un tamaño mínimo de celda de 2 μm, un tamaño máximo de celda de 22 μm y una circularidad de 75 - 80% de redondez para detectar hemocitos normales y redondos. Experimente con diferentes parámetros para detectar hemocitos más grandes y en forma de husillo, como los lamellocitos. Alternativamente, utilice un hemociclo para contar manualmente los hemocitos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
