Single Worm PCR: En metode til at udtrække og forstærke genomisk DNA

In This Article

Abstract

Kilde: Prior, H., et al. En hurtig og letkøbt rørledning til generering af genomiske point mutanter i C. elegans Ved hjælp af CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteiner. J. Vis. Exp. (2018).

Denne video beskriver en teknik til hurtigt at screene en enkelt nematode for en genetisk markør ved PCR screening. I eksempelprotokollen screener vi for CRISPR-baseret genomredigering.

Protocol

Følgende protokol er et uddrag fra Prior et al, A Rapid og Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

Pcr og genotyping med en enkelt orm

Efter 1 - 2 dages æglægning overføres F_1'ernetil individuelle PCR-båndrørhætter, der indeholder 7 μL Worm Lysis Buffer ved hjælp af et ormeplukke (Tabel 1, Figur 1D, dag 4 - 5).
Centrifuge PCR-rør ved maksimal hastighed i 1 min ved stuetemperatur for at bringe dyr til rørbunden og fryserør ved -80 °C i 1 time.
BEMÆRK: Orme kan opbevares ved -80 °C på ubestemt tid.
Lyse frosne orme i en termocykel ved hjælp af følgende program: 60 °C i 60 min, 95 °C i 15 min.
Opsætning af PCR-mastermix som vist i tabel 2.
Der tilsættes 21 μL PCR mastermix til rene PCR-rør, og derefter tilsættes 4 μL orme lysis fra trin 3. Bland godt ved hjælp af en pipette, og kør PCR-programmet i nedenstående retningslinjer (se materialetabel ).
Rense PCR-reaktioner ved hjælp af et DNA Clean and Concentrate-sæt ved at følge producentens anvisninger (se materialetabel ). Elute DNA ved at tilsætte 10 μL vand til spinkolonnen.
Set-up restriction enzyme mastermix som vist i tabel 3.
Der tilsættes 10 μL af restriktionsenzymmastermix til hver renset PCR-reaktion og inkuberes i 1 - 2 timer ved 37 °C.
Separate fordøjede PCR-produkter på en 1,5% agarose gel kører ved 120 V ved hjælp af 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

figure-results-1
Figur 1. CRISPR-Cas9 ingeniørarbejde afC. eleganssod-1 locus. (A) Skematisk illustration, der viser den exon-intron struktur af sod-1 locus i C. elegans. Den røde bjælke angiver placeringen af G93 i exon 3. Primerparsættet bemærkes af de røde pile (F1-R1). (B) Sekvensjustering af humane og C. elegans (...