Single Worm PCR: En metode til at udtrække og forstærke genomisk DNA

Abstract

Kilde: Prior, H., et al. En hurtig og letkøbt rørledning til generering af genomiske point mutanter i C. elegans Ved hjælp af CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteiner. J. Vis. Exp. (2018). 

Denne video beskriver en teknik til hurtigt at screene en enkelt nematode for en genetisk markør ved PCR screening. I eksempelprotokollen screener vi for CRISPR-baseret genomredigering.

Protocol

Følgende protokol er et uddrag fra Prior et al, A Rapid og Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018). Pcr og genotyping med en enkelt orm Efter 1 – 2 dages æglægning overføres F1’ernetil individuelle PCR-båndrørhætter, der indeholder 7 μL Worm Lysis Bu…

Representative Results

Figur 1. CRISPR-Cas9 ingeniørarbejde afC. eleganssod-1 locus. (A) Skematisk illustration, der viser den exon-intron struktur af sod-1 locus i C. elegans. Den røde bjælke angiver placeringen af G93 i exon 3. Primerparsættet bemærkes af de røde pile (F1-R1). (B) Sekvensjustering af humane og C. elegans<…

Materials

Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780