Overview
Este video describe una técnica para examinar rápidamente un solo nematodo para un marcador genético mediante la detección de PCR. En el protocolo de ejemplo, examinamos la edición del genoma basada en CRISPR.
Protocol
El siguiente protocolo es un extracto de Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).
PCR de un solo gusano y Genotipado
- Después de 1 - 2 días de puesta de huevos, transfiera el F1s a tapas individuales de tubo de tira PCR que contengan 7 μL de amortiguador de lisis de gusano utilizando una selección de gusano (Tabla 1, Figura 1D,día 4 - 5).
- Centrífuga tubos PCR a máxima velocidad durante 1 min a temperatura ambiente para llevar animales a la parte inferior del tubo, y congelar tubos a -80 °C durante 1 h.
NOTA: Los gusanos se pueden almacenar a -80 °C indefinidamente. - Lyse gusanos congelados en un termociclo utilizando el siguiente programa: 60 °C durante 60 min, 95 °C durante 15 min, 4 °C de retención.
- Configurar mastermix PCR como se muestra en la Tabla 2.
- Agregue 21 μL de mastermix PCR en tubos PCR limpios y, a continuación, agregue 4 μL de lisis de gusano desde el paso 3. Mezcle bien con una pipeta y ejecute el programa PCR siguiendo las directrices de los fabricantes (consulte Tabla de materiales).
- Purifique las reacciones pcr utilizando un kit de limpieza y concentrado de ADN, siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte tabla de materiales). Elute DNA añadiendo 10 μL de agua a la columna de espín.
- Configurar la mastermix enzimática de restricción como se muestra en la Tabla 3.
- Añadir 10 μL de la enzima de restricción mastermix a cada reacción PCR limpia e incubar durante 1 - 2 h a 37 °C.
- Los productos PCR digeridos separados en un gel de agarose del 1,5% funcionan a 120 V usando 1 búfer Tris-acetato-EDTA (TAE).
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Representative Results
Figura 1. Ingeniería CRISPR-Cas9 del locus C. eleganssod-1. (A) Ilustración esquemática que representa la estructura exon-intron del locus sod-1 en C. elegans. La barra roja denota la ubicación del G93 en exon 3. El conjunto de pares de imprimación se anota en las flechas rojas (F1-R1). (B) Alineación de secuencia de proteínas SOD-1 humanas y C. elegans (gusano). Los residuos específicos del G93 se resaltan en rojo. (C) Superior, una sección de ADN genómico que rodea el codón G93 se muestra como una referencia, y los sitios PAM (verde) y objetivo de sgRNA (azul) se resaltan. En la parte inferior,se muestra la plantilla de reparación dirigida por homología (HDR) de oligonucleótido (SsODN) única que contiene: la edición de codón cambiando G93 a A93, un cambio silencioso en el motivo PAM para evitar el escote por el complejo sgRNA-Cas9, un cambio silencioso para introducir un sitio único de enzimas de restricción hindiii (caja amarilla), y flanqueando brazos homológicos de 5' y 3' 50 bp (barras negras). Todos los cambios de nucleótido diseñados en el ssODN se resaltan en rojo. (D) Ilustración esquemática de la canalización para generar e identificar mutantes de puntos basados en RNP CRISPR-Cas9. En el día 0, inyectar 10 - 15 P0 animales con mezcla de inyección. En el día 2 - 3, identificar animales P0 inyectados con éxito por aquellos que contienen progenie fluorescente F1, y seleccionar tres placas P0 con la progenie más fluorescente. De cada una de las tres placas P0, progenie F 1 fluorescente simplede 8 fluorescentes. En el día 4 - 5, (a) paso 1, F1s individuales se recogen y se colocan en tubos PCR que contienen Lysis Buffer; (b) paso 2, después de congelarse a -80 °C, los tubos PCR que contienen gusanos F1 se mida para liberar ADN genómico, que se utiliza como plantilla de PCR. A continuación, los productos PCR se limpian y digieren con la enzima de restricción única; (c) paso 3, los productos digeridos enzimáticos se resuelven en un gel de agarose donde los animales de tipo salvaje (+/+), heterocigógoo (m/+) y homocigógico (m/m) pueden identificarse mediante patrones de bandas digeridos de restricción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | [Final] |
| HCO | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| Preadolescente-20 | 0.45% |
| Proteinasa K | 1 mg/ml |
Tabla 1. Receta de búfer de lisis de gusano. La proteinasa K debe añadirse fresca antes de cada uso.
| Reactivo | 1x | 04: |
| 2X Q5 Mastermix | 12,5 μL | 300 μL |
| Imprimación F1 (10 μM) | 1.25 μL | 30 μL |
| Imprimación R1 (10 μM) | 1.25 μL | 30 μL |
| Lisis de gusano | 4 μL | ---- |
| DdH2O | 6 μL | 144 μL |
| Volumen final | 25 μL | 504 μL |
Tabla 2. Mastermix pcr. La mastermix PCR debe mezclarse bien pipeteando hasta que la solución sea homogénea. Se deben añadir 21 μL de la mastermix PCR a tubos PCR limpios y, a continuación, se deben añadir 4 μL de lysato de gusano individual a tubos correctamente etiquetados.
| Reactivo | 1x | 04: |
| 10X amortiguador enzimático | 2 μL | 48 μL |
| Reacción limpia pcr | 10 μL | ---- |
| DdH2O | 7 μL | 168 μL |
| Enzima de restricción (10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
| Volumen final | 20 μL | 240 μL |
Tabla 3. Enzima de restricción Mastermix. La enzima de restricción mastermix debe mezclarse bien mediante pipeteo hasta que la solución sea homogénea. 10 μL de la enzima de restricción mastermix debe añadirse a 10 μL de producto PCR limpio.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
