Levensduuranalyse: Het meten van de levensduur van C. elegans

Overview

Deze video beschrijft een traditionele, op platen gebaseerde methode om de levensduur van C. elegans te meten. Het voorbeeldprotocol meet de levensduur van wormen die met RNAi worden behandeld.

Protocol

Het volgende protocol is een uittreksel uit Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Voorkomen van nakomelingenproductie door toevoeging van 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)

1. Kweek dieren tot het L4-stadium bij 20 °C. Controleer of gesynchroniseerde dieren zich ongeveer 40 uur na het zaaien tot L4 hebben ontwikkeld (stap 2.1.7).
   OPMERKING: De ontwikkelingstijd van C. elegans zal variëren bij verschillende temperaturen en groeisnelheden van gemuteerde dieren waarvoor de percentages niet zijn gekarakteriseerd, moeten empirisch worden getest.
   1. Voeg 160 μL 50x FUdR toe aan elke plaat van 6 cm met L4-dieren.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om FUdR toe te voegen in de L4-fase. Maak voor het gemak 1.000 x voorraden FUdR door 1 g FUdR op te lossen in 10 ml ultrapure H₂O. Filtersterilisatievoorraad FUdR met een filter van 0,2 μm en een spuit van 10 cc. Aliquot ~1 ml voorraad in steriele buizen van 1,5 ml. Invriezen en bewaren bij -20 °C.
2. Inspecteer platen op de aanwezigheid van mannelijke C. elegans. Verwijder alle mannetjes.
   OPMERKING: Levensduur wordt meestal gemeten voor hermafrodieten en niet voor mannen. Hermafrodieten die paren leven korter dan ongematte dieren, zelfs in aanwezigheid van FUdR. Mannetjes zijn kleiner en dunner dan hermafrodieten en zijn gemakkelijk te herkennen aan een kenmerkende gehaakte staart.
3. Doe de doos terug in de ritssluitingszak. Keer terug naar 20 °C incubator.

2. Levensvatbaarheid scoren

1. Scoor dagelijks de levensvatbaarheid door het dier voorzichtig op het hoofd aan te raken met een platinadraad of wimper. Scoor dieren die niet als dood bewegen en verwijder ze van de plaat (Figuur 1A). Noteer het aantal waargenomen doden voor elke voorwaarde voor elk observatietijdpunt.
   OPMERKING: Om het risico op scoringsbias te verminderen, moet de experimenteerder blind blijven voor experimentele omstandigheden en mag hij tijdens het scoren niet verwijzen naar de resultaten van eerdere tijdspunten.
2. Censuur dieren die scheuren, sterven aan andere duidelijke ontwikkelingsstoornissen of aan de zijkant van de schaal kruipen: verwijder deze dieren en noteer het aantal op elk waargenomen tijdstip ter overweging in de statistische analyse. Bovendien, als mannetjes worden gevonden, verwijder ze en noteer het waargenomen aantal.
3. Herhaal dit dagelijks vanaf stap 2.1 totdat er geen dieren in leven blijven.
   OPMERKING: Als het gazon van E. coli aanzienlijk afneemt of schimmel op de plaat begint te groeien, breng dan alle resterende dieren over op een verse plaat met de juiste RNAi en FUdR.

Representative Results

Figuur 1: De traditionele en de replicasetmethode voor het scoren van de levensduur van C.elegans (A). De traditionele methode voor het scoren van C. elegans levensduur. Verschillende kleine gesynchroniseerde populaties van isogene dieren per aandoening worden in de loop van de tijd gevolgd. Dezelfde populatie dieren wordt gedurende de hele studie gevolgd. De levensvatbaarheid wordt beoordeeld door beweging, die kan worden gestimuleerd door zachte prodding. Dieren die niet bewegen worden als dood beoordeeld en verwijderd (aspiratie getoond) totdat er geen levensvatbare dieren overblijven. (B). De Replica Set Methode voor het scoren van C. elegans levensduur. Een grote populatie van leeftijdsgesynchronleerde isogene dieren wordt verdeeld over een aantal identieke repliceerplaten. Op elk moment wordt één replica gescoord: een milde gebufferde oplossing (M9) wordt toegevoegd, die beweging stimuleert. Dieren die niet spontaan bewegen na overstromingsputten worden ook beoordeeld via aanraakprikkels. De scoreduur voor het experiment wordt voorafgaand aan de start bepaald. Elk dier wordt slechts één keer gescoord en de levensduur voor de grotere populatie is afgeleid van vele onafhankelijke waarnemingen. (C). De Replica Set-benadering is een methode met hoge doorvoer om de levensduur van C. elegans kwantitatief te meten. 100 of meer onafhankelijke RNAi-klonen kunnen tegelijkertijd worden gevolgd. HT115 E. coli die dsRNA uitdrukt voor een bepaalde RNAi-kloon wordt getoond. Praktisch zijn elke 24 monsters van de 96-put plaat verdeeld in een enkele 24-well plaat. Elke resulterende 24-put plaat heeft een negatieve(d.w.z. lege vector, rode put) en positieve controle (groene put) willekeurig verdeeld binnen een verzameling RNAi klonen (gele putten). Meestal bevat de eerste put (A1) in een verzameling een lege vector. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/