Ferimentos a laser epidérmicos: induzindo danos localizados para examinar processos de reparo em C. elegans

Overview

Este vídeo introduz um método de ferimento a laser, que é usado para causar lesões muito precisas na epiderme do verme.  O protocolo amostral é de um estudo de resposta e reparo da ferida.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Xu e Chisholm, Métodos para Ferida de Pele e Ensaios para Respostas de Feridas em C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Ferida a laser

NOTA: Use irradiação a laser femtosegundo (800 nm) para realizar ferimentos mais precisos.

1. Prepare as almofadas de ágar em uma lâmina de vidro com ágar derretido de 2%. Certifique-se de que as almofadas são semelhantes às almofadas de ágar usadas para imagens ao vivo de C. elegans.
2. Transfira 10 vermes adultos jovens para a almofada de agarose com picareta de vermes, e adicione uma gota de 2 μl de solução levamisole de 12 mM. Cubra os animais e o líquido com um deslizamento de cobertura. Espere 1-2 min para os vermes paralisarem.
3. Coloque o deslizamento de vidro em um microscópio confocal de disco giratório. Mova o estágio para encontrar os vermes e concentre-se na epiderme sincicial lateral ou posterior com um objetivo de 100X (NA 1.4-1.46).
4. Defina o poder do laser femtosegundo para 140 mW (medido antes do objetivo). Use o laser femtosegundo a uma taxa de repetição de 80 MHz.
   NOTA: Dois pulsos de 200 msec cada (separados por 20 msec) são suficientes para ferir em nossas mãos.
5. Concentre-se na superfície apical da célula epidérmica e fera a epiderme. Observe a interrupção local do citoplasma (borbulhante), ou branqueamento local de qualquer marcador fluorescente utilizado.
   NOTA: Siga os procedimentos de segurança do laser adequados ao usar o laser femtosegundo. Varreduras de linha ou ponto usando lasers femtosegundos como os de dois microscópios de fótons devem fornecer energia suficiente para ferimentos a laser.
   NOTA: Embora não tenhamos experiência direta de usar outros lasers, em princípio a ferida deve ser possível usando lasers UV convencionais (como usado em ablações de células C. elegans). Opcionalmente, use um módulo de recuperação de fluorescência após o photobleaching (FRAP) no disco giratório confocal para ferir a epiderme (N. Pujol, comunicação pessoal).