explants העצבי culturing מגזור<em> Xenopus laevis</em> עוברים המבטאים חלבוני היתוך ניאון מאפשרים הדמיה של דינמיקת cytoskeletal קונוס צמיחה.
התהליך המורכב של הדרכת האקסון מונע בעיקר על ידי חרוט הצמיחה, שהוא המבנה הדינמי ניע בקצה האקסון הולך וגדל. במהלך תולדת האקסון, חרוט הצמיחה חייב לשלב מספר מקורות מידע קיו הדרכה לווסת cytoskeleton כדי להניע את הצמיחה קדימה קונוס ומדויק לנווט למצוא מטרות הספציפיות שלה 1. איך השילוב הזה מתרחש ברמת cytoskeletal עדיין מתפתחים, והבדיקה של חלבון cytoskeletal ודינמיקת מפעיל בתוך חרוט הצמיחה יכולה לאפשר הבהרת המנגנונים אלה. קונוסים צמיחת laevis Xenopus הם גדולים מספיק (10-30 מיקרונים בקוטר) לביצוע גבוה ההדמיה ברזולוצית חיה של דינמיקת cytoskeletal (למשל 2-4) והם קלים לבודד ולטפל בסביבת מעבדה בהשוואה לבעלי חוליות אחרים. הצפרדע היא מערכת מודל קלסית למחקרים התפתחותיים נוירוביולוגיה, ותובנה מוקדמות חשובות למיקרופון חרוט צמיחהדינמיקת rotubule תחילה נמצאה באמצעות מערכת זו 5-7. בשיטה 8 זה, ביצים נאספות ומופרה במבחנה, הזריקה רנ"א קידוד חלבוני היתוך cytoskeletal מתויג fluorescently או מבנים אחרים כדי לתפעל ביטוי גנים, ולאחר מכן אפשרו לפתח לבמת הצינור העצבית. צינורות עצביים מבודדים על ידי נתיחה ואז מתורבתים, וקונוסים צמיחה בneurites נגמל הם צלמו. במאמר זה יתאר כיצד לבצע בשיטה זו, שמטרתה היא לקונוסים תרבות Xenopus laevis צמיחה לניתוח תמונה הבא ברזולוציה גבוהה. למרות שאנו מספקים את הדוגמא של חלבון היתוך עצה + EB1-GFP, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מספר של חלבונים על מנת להבהיר את התנהגותם בתוך חרוט הצמיחה.
explants העצבי Xenopus laevis לשלוח neurites בצורה מאוד חזקה על ידי 24 שעות לאחר הציפוי בlaminin / מצע פולי ליזין אם תנאים מתאימים. עם המצע הזה, קונוסים צמיחה הם מאוד ניע ויכולים להשיג אורכי האקסון של עד 1 מ"מ, המשתרעים לכל הכיוונים החיצוניים מexplant, למרות שאורכים אופייניים הם 100 מיק?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לבוב פרימן לאימונים וקירשנר המעבדה לשימוש במתקן הצפרדע, וחברי מעבדת Vactor אן על תמיכה. אנו מודים לניקון מרכז ההדמיה בבית הספר לרפואה ברווארד לקבלת סיוע במיקרוסקופ אור לתמונות באיור 1. עבודה זו מומנה על ידי הבא: NRSA NIH המלגה ומלגת K99-NIH לאל, מדע בסיסי שותפות מימון (https://bsp.med.harvard.edu/) לAEF, וNIH RO1 NS035909 לDVV
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
Ficoll | Sigma | F2637 |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
Laminin | Sigma | L2020 |
NT3 | Sigma | N1905 |
BDNF | Sigma | B3795 |