Målrettet Merking av nevroner i en bestemt Funksjonell Micro-domenet neocortex ved å kombinere Intrinsic Signal og to-foton Imaging

Summary

En fremgangsmåte er beskrevet for merking nevroner med fluorescerende fargestoffer i forutbestemte funksjonelle mikro-domener av neocortex. Først, egenverdi signal optisk imaging brukes for å oppnå en funksjonell kart. Deretter to-foton mikroskopi brukes for å merke og image nevroner innenfor mikro-domene på kartet.

Abstract

I den primære visuelle cortex av ikke-gnagere pattedyr, er nervecellene gruppert i henhold til deres preferanser for stimulans funksjoner som ^1-4 orientering, retning ^5-7, okulær dominans ^8,9 og kikkert ⁹ ulikhet. Orientering selektivitet er den mest studerte funksjonen og en kontinuerlig kart med en kvasi-periodisk oppsett for foretrukket retning er tilstede over hele primær visuelle cortex ^10,11. Integrering av synaptiske, mobil og nett bidrag som fører til stimulans selektive tiltak i disse funksjonelle kart krever hybridisering av imaging teknikker som spenner sub-micron til millimeter romlige skalaer. Med konvensjonell egenverdi signal optisk avbildning, kan den totale utformingen av funksjonelle kartene over hele overflaten av den visuelle cortex bestemmes ^12. Utvikling av in vivo to-foton mikroskopi hjelp kalsium sensitive fargestoffer muliggjør en å bestemme synaptic inngang ankommer enkelte dendrittiske spines ¹³ eller registrere aktivitet samtidig fra hundrevis av individuelle nevrale celle organer ^6,14. Følgelig kombinerer egenverdi signal avbilding med sub-mikron romlig oppløsning av to-foton mikroskopi tilbyr muligheten for å bestemme nøyaktig hvilken dendrittiske segmenter og celler bidrar til mikro-domene noen funksjonell kart i neocortex. Her viser vi en high-yield metode for å raskt få en cortical orientering kart og rettet mot en bestemt mikro-domene i denne funksjonelle kart for merking nevroner med fluorescerende fargestoffer i en ikke-gnagere pattedyr. Med samme mikroskop brukes til to-foton bildebehandling, må vi først generere en orientering kart ved hjelp av iboende signal optisk imaging. Da viser vi hvordan å målrette en mikro-domenet av interesse ved hjelp av en mikropipette lastet med fargestoff til enten etiketten en befolkning på neuronal celle organer eller etikett en enkelt nervecelle slik at dendritter, spines og aksoner er synlige ivivo. Våre avgrensninger i forhold til tidligere metoder rette for en undersøkelse av neuronal struktur-funksjon relasjoner med sub-mobilnettet oppløsning innenfor rammen av neocortical funksjonelle arkitekturer.

Protocol

1. Kirurgisk Forberedelse

1. Indusere anestesi og kontinuerlig overvåke hjertefrekvens, endetidal CO _2, EEG og temperatur. Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité av Medical University of South Carolina og var basert på de vi tidligere utgitt ^9,15.
2. Utsett framsiden av hodeskallen ved å kutte huden med en skalpell blad. Skjær bindevev overliggende beinet med en Brudon curette. Rengjør bein med bomull tippet applikatorer og bomull gasbind. Påfør bein voks (som nødvendig) til skallen for å stoppe sporadisk blødning gjennom små utsending årer.
3. Feste en titan eller rustfritt stål endeplaten til skallen (over regionen av interesse hvor kraniotomi vil utføres) ved hjelp dental sement blandet med svart maling (se Materialer). En rektangulær åpning i midten av hodet plate gir tilgang for kraniotomi og optisk imaging. Fest et metall kammer på toppen av endeplaten. Dette kammeret vil tjene som et fluidreservoar for avbildning med vann nedsenking objektiv.
4. Fest hodet plate til en xy scenen ved hjelp av metall innlegg.
5. Tynn et stort område av benet innenfor det rektangulære åpning av headplate ved hjelp av en dental drill. Området som skal tynnes må langt utover grensene for den planlagte kraniotomi. Den tykke skallen av ikke-gnager pattedyr må tynnes dersom høy oppløsning er skal anskaffes fra neocortex fordi på craniotomy området, vil tykkelsen av bein diktere tykkelsen agarosen mellom coverglass og neocortical overflate (se nedenfor) .
6. Bor et 2 x 2 mm firkantet omriss i benet for kraniotomi. Skyll kammeret jevne med fersk kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for å fjerne bein skår og minimere varmeutslipp til underliggende cortex. Påfør bein voks etter behov, for å stoppe tilfeldige blødninger.
7. LIFt bein klaff med en # 3 tang.
8. Fjern alle bortsett fra det nederste laget av dura med en fin tang (# 5CO) og Vännäs våren saks. Dura i ikke-gnagere pattedyr er tykk og ugjennomsiktig, men kan bli fjernet i distinkte lag. Blødning er sjelden, men kan stoppes med Gelfoam og noe blod rester bør være forsiktig fjernes fra den gjenværende lag dura hjelp pinsett og skylling med ACSF. Den endelige laget av dura er transparent og pial fartøy skal være godt synlig gjennom det. Forlate denne siste lag av dura intakt under egenverdi signal bildebehandling vil øke suksessraten av bulk lasting av fluorescerende kalsium indikatorer for den påfølgende to-foton avbildning fase av forsøket (se diskusjon).
9. Påfør en dråpe varm 2% agarose (oppløst i ACSF) og umiddelbart plassere en coverglass over kraniotomi. Sjekk kraniotomi å sikre at respiratoriske og kardiovaskulære pulseringer er minimal ved hjelp av en kirurgisk disseksjonsmikroskop eller okulars av to-foton mikroskop i lyse-feltet modus.

2. Intrinsic Signal Optisk Imaging

1. Legg gel-skum fuktet med ACSF rundt utsiden av coverglass å hindre agarosen tørker under iboende signal imaging.
2. Fest iboende signal bildebehandling CCD kamera til standard C-mount porten på toppen av to-foton mikroskop (figur 1). Plasser opplysende lyskilde på luften bord i nærheten av xy scenen (figur 1A). Posisjon og sikre lys guider over kraniotomi og headplate / kammer (figur 1B). Trekke den primære dikroiske og speilet under C-mount port slik at det reflekterte rødt lys nødvendig for iboende signaler vil passere direkte fra kraniotomi til CCD kamera (figur 1C-D). Bruke 4x luft objektiv (0,13 NA, 17 mm WD), en 2 x 2 mm synsfelt er tilgjengelig for iboende signal imaging.
3. Sett en varme filter i light banen for å hindre at cortex fra oppvarming. Bruke et filter som passerer grønt lys (546 nm sentrum λ) og ta opp en digital referansebilde av kortikale overflaten blodårene.
4. Flytt z fokus til 500 mikrometer under kortikale overflaten. Bruk et rødt filter (630 nm sentrum λ) for å belyse cortex for måling iboende signaler. Plassere lysledere, slik at den kortikale overflaten er jevnt belyst. Skjerme kraniotomi fra lyset som produseres av den visuelle stimulus displayet. Presentere en sekvens av visuelle stimuli og spille reflektansdataene bilder. For å generere en orientering kart innen 10 min, samle data som tilsvarer 4 repetisjoner av en sekvens av 8 stimuli (4 retninger og to retninger for hver retning).
5. Analyser iboende signaldata å generere en falsk farge orientering kart. Velg potensielle mål regioner for to-foton merking av nevroner, f.eks orientering Pinwheel singulariteter - poeng i kartet hvoralle foretrukne orienteringer konvergerer (figur 2A). Overlappe orientering kart og bildet av den kortikale overflaten vaskulaturen (figur 2B-C). Bruk oppsettet av funksjonelle domener og plasseringen av store overflatefartøyer å velge et mål, unngå steder med store blodkar og arterioler ^15.

3. Bulk Loading av Fluorescent Kalsium Indikatorer

1. Forberede en løsning på 20% Pluronic / DMSO ved å tilsette 1 g Pluronic i 5 pl DMSO. Varm opp blandingen til 60 ° C i 10 min for å fullstendig oppløse Pluronic. Tillat blandingen å avkjøles til romtemperatur. Tilsett 4 pl av Pluronic / DMSO blandingen til en 50 ug hetteglass av fluorescerende kalsium indikatoren Oregon Grønn 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Deretter tilsett 1 pl av et rødt fargestoff (Alexa Fluor 594, 2 mM stamløsning) og 35 pl av pipette-løsning (se Materialer) for en endelig konsentrasjon på 1 mM OGB-1 AM. Sonicate løsningen for ½ time ien kjølt vannbad og deretter sentrifuger med et 0,45 mikrometer filter for å fjerne urenheter.
2. Trekk en lang konus pipette med en ytre spiss diameter på 2,0 til 2,5 mikrometer. Belastning 5 pl av fargestoff blandingen inn i pipetten.
3. Ta den siste lag av dura å lette pipette innsetting og få den høyeste kvalitet to-foton bilder.
4. Bestem nøyaktig plassering på kortikale overflaten at pipetten må plasseres for å nå sitt mål i kortikale lag 2/3. Vår forutbestemte kortikale mål er en hjul singularitet i orientering map (figur 2). Pipetten må slås inn i cortex i 30 ° vinkel for å passere mellom kammerveggen og målet. Derfor, for å merke målområdet 200 mikrometer under kortikale overflaten vil pipetten oppføringen posisjon på kortikale overflaten være ca 350 um lateral til målposisjonen (Figur 3 AB).
5. Flytt xy stadiet (som dyret og pipette micromanipulator er plassert) for å sentrere kortikale overflaten oppføring posisjon under målet (Figur 3C). Bruk en 20x eller 40x objektiv med en arbeidsavstand (WD) på minst 3 mm (se Materials) for å sikre at pipetten vil lett inn cortex uten å berøre målet eller benet langs veggen av kraniotomi. Når oppføring posisjon er sentrert under målet, heve Z posisjon av målet ved 2 mm (figur 3D). Med den grønne epi-fluorescens lyset slått på for å visualisere den røde Alexa fargestoff i pipetten, bruk diagonale akse mikromanipulator å flytte pipetten inntil spissen er sentrert (og fokusert) under målet direkte over kortikale overflaten oppføring posisjon ( Figur 3E).
6. Senk pipetten loddrett (langs z-aksen) til pipetten når kortikale overflate (figur 3F), mens kontinuerlig ser på pipettespissen gjennom OCUlars av mikroskopet. Bruke lyse-feltet belysning, kortikale overflaten blodårene og gjenværende meningeal membraner (pia og araknoide) er lett synlig som pipetten nærmer seg kortikale overflaten. Hvis pipetten ikke kommer til ønsket oppføring posisjon, heve pipette og rekalibrere målretting basert på vaskulære landemerker på kortikale overflaten.
7. Fjern målet, veke overflødig spinalvæske fra kraniotomi og tørk den tilstøtende bein med lofri absorpsjon spyd. Påfør en dråpe varm 3% agarose (oppløst i ACSF) for å stabilisere cortex som er synlig gjennom kraniotomi (figur 3G). I ikke-gnagere, er 3% agarose nødvendig å dempe pulseringer for vellykket opptak av fluorescerende fargestoffer av nerveceller. For indre signalet optisk imaging bare 2% agarose er nødvendig fordi kombinasjonen av 2% agarose og coverglass gir nødvendig stabilitet. Her er ingen coverglass brukes for fargestoff-lastingstrinnet så 3% agarose ernødvendig. Etter at agarose har befestet, sette inn et 40x objektiv (0,8 NA, 3,3 mm WD) og re-fill kammeret med ACSF.
8. Bytt fra lyse-feltet til to-foton visning og finne pipettespissen. Bruke diagonale akse mikromanipulator, flytter pipetten inntil spissen når ønsket dybde i cortex (figur 3H). Sporadiske press utstøting puffs av fargestoffet blanding (noen psi, hver puls 0,1 sek) vil bidra til å forhindre pipettespissen fra tilstopping. Fordi OGB-1 AM bare blir synlig ved å skrive inn celler, er den røde Alexa fargestoff kritisk for visualisering av pipettespissen inne i hjernebarken.
9. Før du forsøker å laste nevroner i kortikale lag 2/3 med full dose av fargestoff, re-fokusere målet på kortikale overflaten for å bekrefte dybden pipettespissen og sikre at spissen er i målplasseringen basert på utformingen av overflaten blodkar. Dersom pipetten er i lag 2/3, bør små puffs av fargestoff blandingen belyseekstracellulære rommet og avslører en tett montering av sirkulære celle organer som mørke skygger.
10. For lasting neuronal celle organer i en sfære av cortex 300-600 mikrometer diameter, injisere fargestoff blandingen i det ekstracellulære rom med 30-90 pulser, hver puls 1,0 sek, 2-10 psi. Pulser av trykket bør ikke være så sterk at vevet beveger seg. Etter injeksjonen er fullført, må du vente noen minutter, og deretter fjerne pipette og objektiv. Vent i 1 time for å tillate at OGB-1 AM å være fullt tatt opp av nerveceller.
11. Fjern agarose brukes for fargestoff lasting og skyll opptaket kammeret. Sett en liten dråpe 2-3% agarose på overflaten og raskt plassere en coverglass over kraniotomi. Fordi fluorescerende fargestoffer er følsom for lys, unngå over-eksponere hjernebarken til lyse-feltet eller epi-fluorescerende lys. Sett en høy NA (1.0) 20x objektiv inn målet holderen og re-sentrere merket kortikale regionen under målet med xy scenen. Skjerme kraniotomi fra extraneous lyskilder, f.eks visuell stimulans display, ved hjelp av flere lag av blackout materiale.

4. Encellede Electroporation av fluorescerende fargestoffer

1. For å studere dendrittiske morfologi, utarbeide en løsning av 100 pM Alexa Fluor 594 (1:20 fortynning i ACSF av 2 mM Alexa Fluor 594 aksjer). For funksjonell avbildning av dendritter en OGB salt kan brukes ^16,17.
2. Trekk en lang konus pipette med en dysestørrelse på 1 um og last 5 pl fargestoff inn i pipetten. Alle andre trinn målretting et funksjonelt domene er identiske til bulk ileggingsmetode (figurene 1-3). Å plassere pipettespissen ved siden av en neuronal celle kroppen membran, overvåke økningen i elektroden impedans og legge press puffs av fargestoff til å belyse de ekstracellulære rommet og se celle organer som skygger i løpet av to-foton bildebehandling.
3. Når pipettespissen er tilstøtende til en neuronal celle kroppen membran, bruk Axoporator 800A å søke1-3 pulser (-8 til -10 V, 10 ms puls). Umiddelbar fylling av nervecellen med fargestoff er lett visualisert med to-foton mikroskopi. Fjern pipetten og samle høyoppløselige bilder av dendritter og aksoner in vivo.

Representative Results

Å illustrere presisjonen våre fargestoff merking metoder, målrettet vi den minste mikro-domene av enhver kjent funksjonell kartet i den ikke-gnager neocortex. Sparsomt krydres hele orientering kartet i den primære visuelle cortex er singulariteter. Disse forekommer på punkter hvor alle foretrukne orientering konvergerer slik at i falske farger kartene over foretrukket retning, regionene rundt singularitet ligne "pinwheels" (figur 2A-B). En pinwheel per kraniotomi er valgt for dye merking (grønn sirkel i figur 2C), være sikker på å unngå store fartøy og arterioler spesielt ^15. Med bulk-lasting av OGB-1 AM, avslører sporing av endringer i neuronal kalsium indikator fluorescens til en sekvens av orientert rist visuelle stimuli encellede oppløsning funksjonelle kart rundt Pinwheel singulariteter (figur 4). Med encellede electroporation, den romlige organiseringen av dendritter og aksoner fra såIngle neuron plassert på en hjul singularitet bestemmes in vivo (figur 5).

Figur 1. Intrinsic signal optisk imaging oppsett. (A) dyret er plassert på xy scenen og iboende signal avbildning utføres via en CCD kamera montert på to-foton mikroskop. Lyskilden og datamaskinen benyttes til å styre bildebehandling økten bringes over til oppsett for iboende avbildning og flyttet bort før to-foton avbildning fase av eksperimentet begynner. (B) Nærbilde av 4x objektiv og 630 nm belysning gjennom flytende lys guider. Enten to lysledere festet til metall innlegg (venstre), eller en enkelt opplysende ring festet til direkte målet (høyre) kan brukes. Blackout materialet brukes til å skjerme målet fra eksterne kilder belysning, f. eks, visuell stimulans skjerm, under optisk imaging økter, ikke vist. (C) Skjematisk fremstilling av mikroskopet og lysbanen i det konvensjonelle to-foton avbildning konfigurasjon. Se Utfyllende fig. 20 i Shen et al. 2012 ¹⁵ for en beskrivelse av den komplette to-foton lysbane. Den uttrekkbare speilet er posisjonert til å avbøye lys fra laseren gjennom dikroiske og inn på hjernebarken. Den primære dikroisk, som passerer laserstrålen og reflekterer lyset fra hjernebarken til PMT-tallet, blir flyttet til lysbanen ved å dreie filteret turret. (D) For egenverdi avbildning speilet er tilbaketrukket og filter turret er slått å bevege den primære dikroiske ut av veien, slik at en direkte lysbane fra hjernebarken til CCD-kameraet. Klikk her for å vise større figur .

nt "fo: keep-together.within-page =" always ">

Figur 2. Bruke funksjonelle kart oppnådd med egenverdi signal bildebehandling for å velge en mikro-domene for merking nevroner med fluorescerende fargestoffer. (A) Orientering kart fra katten primære visuelle cortex kjøpt via indre signal optisk imaging. Fargen på hver piksel representerer foretrukket retning på det stedet. Potensielle orientering hjul singulariteter egnet for merking nevroner med fluorescerende fargestoffer er vist i svarte sirkler. (B) Kartet over kortikale overflate blodkar kledde med orientering kartet. (C) Pinwheels innenfor røde sirklene er nær store blodkar eller arterioler og så pinwheel nettsted innen den grønne sirkelen er valgt som mål for dye merking. Den stiplede rektangelet tilsvarer regionen vist i figur 3B. Målestokk i (A) 500 &mu, m.

Figur 3. Optimalisere pipetten plassering for lasting nevroner med fluorescerende fargestoffer. (A) Skjematisk side-visning av opptaket kammeret viser at fargen lasting området for å være målrettet i visuell cortex (rød-og-hvit blinken) er ~ 200 mikrometer under kortikale overflate. Xy koordinat for målet tilsvarer plasseringen av en orientering hjul singularitet bestemmes fra iboende signal imaging. Pipetten vil gå inn i hjernebarken på en 30 ° vinkel. Hvis kortikale overflaten er parallell med xy scenen overflaten, vil pipettespissen beveges sideveis ca 350 um før den når pinwheel singularitet. (B) ovenfra opptak kammer viser kortikale overflaten blodkar og pipetten oppføring posisjon (rød stjerne) thpå er 350 mikrometer fra pinwheel singularitet. (C) Den xy stadiet posisjonen er justert slik at pipetten oppføring posisjon er sentrert under 20x eller 40x objektiv (3,3 til 3,5 mm WD). (D) Målet heves ~ 2 mm. (E) Pipetten er brakt over kraniotomi og spissen er plassert direkte over oppføringen posisjon på kortikale overflaten med grønn epi-fluorescerende lys. (F) pipette og målsetting er senket samtidig bruker lyse feltet belysning til kortikale overflaten blodårene komme i fokus. (G) objektiv og ACSF blir fjernet og en nedgang på 3% agarose er anvendt over kraniotomi. (H) to-foton visualisering med 40x (0,8 NA 3,3 mm WD) mål er brukes til å følge pipetten ned til valgt kortikale dybde og injisere fargebad. Etter å ha bekreftet at nevroner er vellykket merket med fluorescerende fargestoff, typisk, en høyere NA 20x objektiv (1,0 NA, 2,0 mm WD) brukes til å samle to-foton t - og z-series data. Skjematisk s vist i A, CH ikke skalategninger.

Figur 4. Korrespondanse orientering preferanse i to-foton og indre signal bildebehandling funksjonelle kart. (A) To-foton avbildet området viser celle organer merket med OGB-1 AM i visuell cortex lag 2/3. (B) Orientering preferanse av individuelle nevronale celle organer fra samme området vist i (A). Rundt pinwheel singularitet som var sentrert i den avbildede regionen er en organisert kart over foretrukne stimulans orientering. (C) Den orientering kart oppnås med egenverdi signal imaging. Svart firkant tilsvarer regionen vist i (B). Disse dataene ble oppnådd fra det samme eksperimentet vist i figurene 2A-C og 3B. Skala bar i (AB) 100 um og (C) 500 um.

d/50025/50025fig5.jpg "/>
Figur 5. In vivo morfologien en enkelt Nevron på en retning hjul singularitet. (A) dendritter og celle kroppen av en enkelt Nevron kledde med orienteringen kart fra samme visuelle kortikale område. Neuron ble electroporated med Alexa Fluor 594 under to-foton veiledning, ble en z-stack samles in vivo, og dendrittiske prosesser ble sporet offline ved Neurolucida programvare. Orienteringen kartet ble innhentet ved hjelp av iboende signal bildebehandling før encellede electroporation. (B) Gjennomsnittlig intensitet 10-mikrometer-z-projeksjon fra kortikale lag 1 viser apikale dendritter. (CD) Gjennomsnittlig intensitet 10-mikrometer-Z-anslag fra kortikale lag 2/3 viser basal dendritter og aksoner. Røde piler viser spines langs dendritter og hvite piler peker mot individuelle axons. Skala barer i (AD) 100 mikrometer.

Discussion

Vi presenterer en metode for å målrette merking av neuronal celle organer (eller dendritter og aksoner) i forhåndsbestemte funksjonelle mikro-domener neocortex. Sammenslåing egenverdi signal optisk imaging med to-foton mikroskopi tilbyr muligheten for å bestemme hvilke synapser og celler bidrar til mikro-domene noen funksjonell kart, enten nevronale selektivitet korrelerer med plasseringen av nevron i en funksjonell kart, og nevronale kretskomponenter som endrer seg med visuell opplevelse ⁷ eller anvendelsen av klinisk terapeutiske legemidler ^18.

Ingen kart for stimulans orientering, retning, okulær dominans, eller kikkert misforhold er rapportert i den visuelle cortex av voksne villtype gnagere ^6,19-21. Imidlertid har det enkelt å laste nevroner med fluorescerende fargestoffer og oppnå bildebehandling stabilitet, sammen med de kraftige genetiske verktøy for mus resulterte i de aller fleste studierbruker to-foton avbildning av hjernebarken blir utført i stedet for gnagere ildere, katter og aper.

Høyoppløselig to-foton avbildning av nevroner i ikke-gnagere pattedyr kan være svært utfordrende på grunn av lange kirurgi ganger, tykkere bein og dura og ekstra trinn for å holde luftveiene og hjerte medierte pulseringer i hjernen til et minimum ^15. Overganger fra kirurgi til iboende signal bildebehandling og iboende til to-foton bildebehandling må være effektiv, krever rettidig utarbeidelse av reagenser, fargestoffer og utførelse av mikro-kirurgiske prosedyrer. Bruke to-foton mikroskop for indre signal bildebehandling fjerner behovet for mye av utstyret som brukes i konvensjonelle indre signal optisk imaging rigger ²² og reduserer tiden det tar å sette opp egenverdi bildebehandling og overgang til påfølgende to-foton bildebehandling.

Vår tilnærming er spesielt utviklet for å gi høy oppløsning to-photon bildebehandling i forhåndsdefinerte funksjonelle domener. Dette gir minimal krysstale av funksjonelle signaler mellom nevronale celle organer og individuelle dendritic spines og aksoner kan løses in vivo. Ved hjelp av en høy numerisk apertur (NA = 1,0) objektiv og fylle baksiden blenderåpning på målet med strålen utvidelse optikk (se Utfyllende fig. 20 i Shen et al., 2012 ¹⁵⁾ er kritisk for høy oppløsning. Avhengig av hastigheten på bildebehandling i XY og / eller Z, kan respiratoriske og kardiovaskulære pulseringer redusere den effektive imaging oppløsning uansett hvor god NA og optisk lys banen er. Ved å begrense kraniotomi størrelse i ikke-gnagere til 2 x 2 mm, ved hjelp av den relativt høyere konsentrasjon av agarose med coverglass, og utfører en pneumotoraks og lumbar suspensjon når nødvendige ^15, hjernen pulseringer er begrenset til 1-2 um. Minimere respiratoriske og kardiovaskulære induserte pulseringer av neocortex til 1-2 mikrometer under bulklasting av kalsium indikatorer sikrer også at cortex danner en tett forsegling rundt det innsatte pipette og at ingen fargestoff sporer opp langs skaftet pipetten til kortikale overflaten. Velge farge injeksjon og imaging nettsteder unna store arterioler er også kritisk for høy kvalitet funksjonell avbildning fordi relativt rask sensorisk-fremkalt Hyperemia (hemodynamiske) gjenstander vil bli ekskludert ^15.

På kraniotomi nettsted, forlater det endelige lag av dura intakt gjennom iboende signal bildebehandling og fluorescerende fargestoffmolekyler forberedelse faser - og dermed fjerne den like før pipetten innsetting i cortex for fargestoff lasting - øker suksessraten og kvaliteten av neuronal merking i følgende måter: (1) holder kortikale overflaten ren og / eller hindrer dural vev gjenvekst, slik at pipettespissen er mindre sannsynlig å bli tett og gjennomsiktigheten i vevet opprettholdes, (2) unngår å ha agarose brukes for iboende bildebehandling berører Cortical overflate blodkar som kan bli skadet når den agarose fjernes, (3) hindrer agarose brukt under iboende avbildning fra inn mellom dura og cortex under skallen rundt kantene av kraniotomi. Agarose i disse regionene vil øke avstanden mellom coverglass og kortikale overflaten som gjør innsetting av pipetten vanskeligere, fører til kompresjon av det kortikale vev og reduserer gjennomsiktigheten for avbilding.

Ved utarbeidelsen av AM fluorescerende fargestoffer for bulk lasting, bør 20% Pluronic / DMSO blanding aldri brukes utover en uke fra sin opprinnelige forberedelse - gamle Pluronic / DMSO slukker fluorescens. For optimal ilegging av mange tilstøtende celle legemer med en funksjonell indikator, f.eks OGB-1 AM, blir fargestoffet blandingen lagret på is, lastet inn i pipetten etter behov, men alltid injisert i hjernen i løpet av 2 hr av dets fremstilling.

Under bulk lasting fase avforsøket, gjentatt 1 sek pulser av press enn som en injeksjon på 1 min gir for iterative kalibrering av utstøting parametere, som sikrer at overdreven fargestoff eller trykk ikke er brukt. På grunn av den potensielle vevsskade fra flere pipetter innsettinger trengs å merke meget store regioner av vev og potensiell toksisitet fra store volumer av Pluronic / DMSO fra en slik serie av mange injeksjoner, foretrekker vi en 300-600 mikrometer fargestoff injeksjonsstedet per 2 x 2 mm kraniotomi. Sammenlignet med blinde ¹⁴ injeksjoner, to-foton visuelt guidet navigering rundt blodkar, bruk av negativ kontrast av neuronal celle organer å bestemme lamina posisjon, og måle spredningen av fargestoffet ved trykket utstøting som en indeks av volumet av cellene som vil bli merket med OGB-1 AM, forbedrer kvaliteten på fargestoff lasting i ikke-gnagere forberedelser.

Protokollen vi beskriver her fører til vellykket merking av nevroner med fluorescerende fargestoffer i tjæregeted mikro-domener i hvert dyr forsøkt. For bulk lasting med OGB-1 AM, vi konsekvent får visuelt fremkalt respons i 75-100% av samtidig fotografert nevroner ^9,15 og teknikken er følsom for påvisning av single aksjonspotensialer in vivo ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane	Webster Vet	NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer	Midmark	VIP 3000
Feedback regulated heating blanket	Harvard Apparatus	50-7079F
ECG monitor	Digicare Biomedical	LifeWindow Lite
EEG amplifier	A-M Systems	1800
EEG display monitor	Hewlett Packard	78304A
End tidal CO2 monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone	Henry Schein	fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber	Dentsply	675571, 675572
Black Powder Tempera Paint	Sargent Art Inc.	22-7185	Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A	Sigma	A9793	For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness	World Precision Instruments	502040, 502041	For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Cleaning skull surface
Bone wax	Ethicon	W31G	Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator	Electron Microscopy Sciences	72308-05	Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps	Fine Science Tools	11295-20	Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	To stop bleeding on the dura
Absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material	Thorlabs	BK5	Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O6807	Calcium indicator
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size)	Millipore	UFC30HV00	To remove impurities before injection
Glass pipette puller	Sutter Instruments	P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter)	World Precision Instruments	1B150F-4	Dye ejection pipette
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	For loading dye into pipette
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285	To position pipette
Pressure pulse controller	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator	Molecular Devices	Axoporator 800A	For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD)	Olympus	UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera	Adimec	Adimec-1000
Light source power supply	KEPCO	ATE 15-15M
Light source	Optical Imaging Inc.	HAL 100	Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (bandpass 30 nm)	For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal)	Optical Imaging Inc.	λ = 630 nm (bandpass 30 nm)	To collect intrinsic signals
Heat filter	Optical Imaging Inc.	KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software	Prairie Technologies		See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD)	Olympus	UMPLFLN20X	0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)	Olympus	XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)	Olympus	LUMPLFLN40X/IR
Air table	Newport	ST-200	Isolates preparation from external vibrations
xy stage	Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)		Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4