Summary
Vi beskriver ett protokoll för isolering och rening av neutrofiler från musbenmärg genom densitetsgradientcentrifugering och för neutrofil märkning med hjälp CellTracker färgämnen. Detta representerar en enkel, snabb, reproducerbar och ekonomisk metod för att erhålla ett stort antal neutrofiler för efterföljande funktionella studier eller adoptiv överföring och spårning experiment.
Abstract
Neutrofiler är viktiga effektorceller i det medfödda immunförsvaret. De är snabbt rekryteras vid ställen för akut inflammation och utöva skyddande eller patogena effekter beroende på inflammatorisk miljö. Ändå, trots den oumbärliga roll neutrofiler i immunitet, detaljerad förståelse av de molekylära faktorer som medlar neutrofiler "effektor och immunopathogenic effekter i olika infektionssjukdomar och inflammatoriska tillstånd fortfarande saknas, delvis på grund av sin korta halveringstid, svårigheterna med hanteringen av dessa celler och bristen på tillförlitliga experimentella protokoll för att erhålla tillräckligt antal neutrofiler för nedströms funktionella studier och adoptivföräldrar experiment överföring. Därför, enkelt, snabbt, ekonomiskt och tillförlitligt sätt är mycket önskvärt för att skörda tillräckligt många mus neutrofiler för bedömning funktioner såsom fagocytos, dödande, cytokin produktion, degranulering och människohandel. I detta syftepresenterar vi en reproducerbar densitetsgradientcentrifugering-baserat protokoll, som kan anpassas på alla laboratorier för att isolera ett stort antal neutrofiler från benmärgen av möss med hög renhet och livsduglighet. Dessutom presenterar vi ett enkelt protokoll som använder CellTracker färgämnen för att märka de isolerade neutrofiler, som sedan kan adoptivt överföras till mottagande möss och spåras i flera vävnader i minst 4 h efter överföring med användning av flödescytometri. Användning av detta tillvägagångssätt kan differentiell märkning av neutrofiler från vildtyp och gen-brist möss med olika CellTracker färgämnen med framgång användas för att utföra konkurrenskraftiga inplantering studier för utvärdering av den direkta rollen av specifika gener i trafficking av neutrofiler från blodet till målvävnader in vivo .
Introduction
Neutrofiler är de mest förekommande leukocyter hos människor. De är den främsta cellulära del av det medfödda immunförsvaret och fungera som en första försvarslinje mot invaderande mikroorganismer. Patienter med förvärvad neutropeni och primär immunbrist som påverkar neutrofila siffror och / eller funktion utveckla livshotande invasiva bakterie-och svampinfektioner, och betona vikten av dessa celler i värdförsvar 1. Immun erkännande av invaderande patogener på infektion webbplatsen genom deras besläktade mönsterigenkänning receptorer resulterar i induktion av en iscensatt medfödda immunförsvaret, vilket leder till utsöndring av kemoattraktanter som genererar en chemotactic gradient kan rekrytera neutrofiler från blodet in i den inflammerade vävnaden 2 . Efter neutrofiler in infektionen webbplats, de blir aktiverade, vilket leder till cytokin och kemokinproduktion, patogen upptag, och dödande via oxidativ och icke-oxidativ migchanisms 3. Förutom deras erkänd roll i det medfödda immunförsvaret, har neutrofiler också nyligen visats spela viktiga roller som initiativtagare effektiva adaptiva immunsvar 4. Å andra sidan, bortsett från deras skyddande roller i immunitet, kan neutrofiler medierar även vävnadsskada och immunopatologi grund av överdriven ackumulation och / eller aktivering vid ställen för inflammation, såsom visas i ett antal infektiösa och autoimmuna sjukdomar 5-7.
Trots den oumbärliga roll neutrofiler vid montering effektiva medfödda immunförsvaret och deras pleiotropa effektorfunktionerna i flera infektionssjukdomar och inflammatoriska tillstånd, tekniska svårigheter med att hantera dessa celler och brist på tillförlitliga experimentella protokoll har hindrat forskning med neutrofiler under de senaste decennierna. Därför bör användning av reproducerbara analyser för isolering av neutrofiler främja ytterligare forskning om neutrofilmedierad immunologiska funktioner ex vivo och in vivo. Hittills har flera metoder beskrivits för isolering av neutrofiler, såsom densitetsgradientcentrifugering av humanblod och mus blod eller benmärg 8,9, positiv eller negativ immunomagnetisk anrikning av neutrofila granulocyter från musblod eller benmärg 10,11, och skörd av neutrofiler från peritonealhålan hos möss efter intraperitoneal injektion av tioglykolat eller andra inflammatoriska medel 12. Även neutrofiler kan lätt isoleras i stora antal från humant blod, är denna metod suboptimal i möss på grund av den begränsade volymen musblod som utesluter isolering av tillräckliga neutrofiler för funktionella studier eller adoptiv experiment överföra 13. Även om utbytet av tioglykollat-framkallade celler från peritonealhålan är större jämfört med den för musblod, varierar renheten av neutrofiler i den inflammatoriska peritonealsköljning mellan60-90%, och de isolerade neutrofiler uppvisar en aktiverad fenotyp. Sålunda insamlade cellerna med den här metoden endast kan användas för att utföra funktionella studier av aktiverade men inte av ostimulerade neutrofiler, som musen bukhålan har några neutrofiler vid steady state 12. Istället är benmärgen ett bekvämt reservoar för att skörda ett stort antal antingen ostimulerade eller aktiverade neutrofiler 11,14, som sedan kan användas för nedströms funktionella studier såsom fagocytos, dödande och degranulering, eller för adoptiv överföring till mottagande möss.
Häri beskriver vi en enkel och snabb (~ 2 tim) protokoll, vilket ger en hög direktavkastning (~ 6-12 × 10 6 neutrofiler / infekterade mus, eller upp till 30-40 × 10 6 neutrofiler / infekterad mus) ren (80 -95%) neutrofiler med> 95% viabilitet från benmärgen. Denna metod använder kommersiellt tillgänglig Histopaque, vilket är densitetsgradient cell separatranson massmedia som består av Ficoll och natriumdiatrizoat, att separera neutrofiler från benmärgen hos möss. Denna metod ger betydligt större antal neutrofiler per mus jämfört med blod eller peritonealhålan, kan den användas för att samla in neutrofiler från möss både vid steady state eller efter infektion, och det är lättare att skiktet jämfört med densitetsgradientcentrifugering metod som använder diskontinuerlig Percoll gradienter som består av 55% / 65% / 75% Percoll i PBS 9. Dessutom är den tid och de resurser som krävs för att samla in rena neutrofiler minskat avsevärt jämfört med neutrofila isolering användning av fluorescens-cellsortering. Dessutom, eftersom denna metod inte involverar en immunomagnetisk anrikningssteg, är det mer kostnadseffektivt, och den undviker exponering av celler för den magnetiska kolonnen och antikroppar, vilket sålunda minskar sannolikheten för neutrofil aktivering.
Förutom att utföra funktionella studier av isolerat neutrophils ex vivo och adoptiv överföring av celler in i mottagarmöss, beskriver detta protokoll också ett förfarande för märkning av isolerade neutrofiler som använder olika CellTracker färgämnen. Differential märkning av neutrofiler från möss med olika genetiska bakgrunder kan anpassas på konkurrensutsatta inplantering studier för att spåra de överförda neutrofiler i vävnader hos mottagaren möss med användning av flödescytometri, vilket kan ge mekanistisk insikt om direkta roll specifika gener i trafficking av neutrofiler från blodet i mål inflammerade organ 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Isolering av benmärg hos möss Cells
- Euthanize möss med institutionens djurvård kommitté-godkända protokoll och spraya djurets yta med 70% etanol.
- Gör ett snitt i huden i mitten av buken och ta bort huden från bortre delen av musen inklusive huden som täcker de nedre extremiteterna.
- Skär av muskler från de nedre extremiteterna med en sax och försiktigt förskjuta acetabulum från höftleden, samtidigt som man undviker att bryta lårbenet huvudet.
- Ta bort de kvarvarande musklerna från lårbenet och skenbenet med hjälp av en skalpell och sax och separera lårbenet från skenbenet vid knäleden utöva omsorg att inte bryta benändarna. Placera benen i en petriskål innehållande iskallt RPMI 1640 1X kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin.
- Fortsätt med följande steg inom en vävnad kultur huva. Ta extra försiktighetsåtgärd för att upprätthålla strikta sterila tekniker för att undvika neutrophil aktivering.
- Skölj varje ben med 70% etanol (i en petriskål) följt av tre efterföljande tvättar i iskall steril PBS (inom petriskålar) för att skölja bort etanolen från ytan av benen.
- Inuti en ren steril petriskål, skära av epifyser i benen och hålla dem undan.
- Använd en 25-gauge nål och en 12 cc spruta fylld med RPMI kompletterat med 10% FBS och 2 mM EDTA och spola benmärgsceller från båda ändarna av ben axlar på en 50 ml skruvlock Falcon rör utrustat med en 100 ^ m filtrera. För att effektivt ta bort alla celler, skrapa den inre ytan av benen med hjälp av 25-gauge nål.
OBS: Blanchering av ben tyder på att cellerna tillräckligt har skrapats.
OBS: Använd ca 10 ml av media för att spola en femur / tibia par. Lägga EDTA till mediet är viktigt att förhindra klumpning av cellerna.
- Skära benet epifyseri små 0,5-1 mm 3 bitar med en skalpell och krossa dem genom de 100 um filter med den bakre änden av en 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur pipettspetsen.
- Centrifugera vid 1400 rpm under 7 minuter vid 4 ° C.
- Lyse de röda blodkropparna genom att återsuspendera cellpelleten i 20 ml 0,2% NaCl under cirka 20 sekunder följt av tillsats av 20 ml 1,6% NaCl. (Kritisk: Överskrid inte 20-30 sek av hypoton lys för att undvika ben död märg cell Användningen av hypoton NaCl för lys rekommenderas över ACK lyseringsbuffert eftersom den senare har potential att aktivera neutrofiler.).
- Centrifugera i 7 min vid 1400 rpm vid 4 ° C för att samla upp cellerna.
- Tvätta cellerna med RPMI 1640 1X kompletterat med 10% FBS och 2 mM EDTA och centrifugera som i steg 1,12.
- Utbytet av benmärgsceller som använder denna metod är cirka 60 till 80.000.000 per oinfekterade 8-12 veckor gamla C57BL / 6 mus.
2. Separation av neutrofilergenom densitetsgradientcentrifugering
- Räkna benmärgsceller och återsuspendera i 1 ml iskall steril PBS.
- Tillsätt 3 ml Histopaque 1119 (densitet, 1.119 g / ml) i en 15-ml konisk tub.
- Overlay 3 ml Histopaque 1077 (densitet, 1,077 g / ml) på 3 ml Histopaque 1119.
OBS: Histopaque 1119 och Histopaque 1077 skall värmas till 18-26 ° C före användning.
Kritiskt steg: Förbered gradienter omedelbart före användning såsom förberedelse av gradienten i förväg kommer att resultera i diffusion mellan de två skikten och suboptimal neutrofil renhet och återhämtning.
Kritiska steg: överliggande Histopaque 1077 över 1119 måste göras långsamt för att undvika att blanda de två densiteter, som kommer att förhindra cell separation under centrifugering.
- Overlay benet fjädring benmärg cell ovanpå Histopaque 1077.
Kritiska steg: OverlAying benet fjädring benmärg cell över Histopaque 1077 måste göras långsamt för att undvika att störa gränsytan mellan cellerna och Histopaque 1077.
OBS: återsuspendering benmärgsceller från en oinfekterad mus i en ml PBS ger neutrofil renhet av> 90%. Emellertid sammanslagning många benmärgsprov äventyrar neutrofil renhet, till exempel återsuspendering 300 x 10 6 celler i 3 ml PBS minskar neutrofil renhet från> 90% till ~ 80%. Därför bör utredare utför pilotförsök för att identifiera de ideala celltal / volym villkoren för deras specifika experiment
- Centrifugera i 30 minuter vid 2000 rpm vid 25 ° C utan broms.
OBS: Centrifugering av gradienten vid rumstemperatur är kritisk och nödvändig för effektiv separering av neutrofilerna.
- Samla neutrofiler vid gränsytan av Histopaque 1119 och Histopaque 1077 skikten. Tvätta de uppsamlade neutrofiler två gånger med RPMI 1640 1X kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin och centrifugera vid 1400 rpm under 7 minuter vid 4 ° C.
- Räkna neutrofiler och bestämma deras livskraft.
OBS: Neutrofiler är typiskt> 95% viabla och> 90% ren enligt bestämning genom FACS-analys. Den typiska utbytet av neutrofiler från benmärgen (dvs. 2 lårbenet och 2 skenbenet ben) i en icke-infekterade 8-12 veckor gamla C57BL / 6 mus är ~ 6-12.000.000 celler. Detta antal är betydligt större när neutrofiler skördas från benmärgen av infekterade djur. Därför var ~ 30-40 miljoner neutrofiler / mus återvinnas när Candida-infekterade möss användes för cellskörd 6.
Tre. Märkning av neutrofiler Använda CellTracker Färgämnen
- Resuspendera neutrofilerna vid 5 x 10 6 celler / ml i PBS förvärmt vid 37 ° C.
- Lägg en CellTracker färgämne vid en slutlig concentranson av 5 uM.
OBS: CellTracker Grön (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein diacetat) och CellTracker Orange (CMTMR (5 - (och-6)-4-Chloromethyl) Bensoyl Amino Tetramethylrhodamine användes i detta protokoll för att differentiellt märka neutrofiler från vild-typ och gen-brist möss.
OBS: Bered en förrådslösning av 10 mM av CellTracker Green and CellTracker Orange, alikvot, och förvara vid -80 ° C tills dagen för experimentet.
- Inkubera neutrofiler med 5 | iM av den motsvarande CellTracker färgämnet i 10 min vid 37 ° C i ett skakande vattenbad i mörker.
- Tvätta cellerna två gånger med iskall RPMI 1640 1X kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin.
OBS: Effektiv tvätt av cellerna efter märkning steget med CellTracker färgämnet är viktigt att undvika dye korskontaminering före blandning differentiellt-märkta neutrofila befolkningar för downstream konkurrenskraftiga inplantering studier.
4. Adoptiv överföring av neutrofiler i Möss och analys av överförda neutrofiler användning av flödescytometri
- Återsuspendera neutrofiler i iskall PBS vid en koncentration av 25 x 10 6 celler / ml och injicera 200 | il av suspensionen in i den laterala svansvenen så att 5 x 10 6 neutrofiler överförs per mus. För konkurrenskraftiga studier inplantering neutrofila, blanda vildtyp och gen-brist neutrofiler i förhållandet 1:1 och injicera totalt 5 x 10 6 neutrofiler per mus som ovan.
OBS: åtminstone upp till 10 x 10 6 neutrofiler kan adoptivt överföras per mus utan uppenbar omedelbar toxicitet till djuren.
- Vid olika tidpunkter efter adoptiv överföring (t.ex. 1, 2, 3 eller 4 h efter överföring), euthanize möss och skörd blod, och / eller benmärg och / eller annan målorgan (er) av intresse.
- Förbered single cellsuspensioner från dessa vävnader för kvantitativ och kvalitativ analys av adoptivt överförda märkta neutrofiler med publicerade protokoll 6,15.
- Efter levande / döda livskraft färgning och Fc blockad, celler etikett med CD45 (klon 30-F11), Ly6G (klon 1A8) och CD11b (klon M1/70) och grind på levande CD45 + Ly6G + CD11b + neutrofiler. Neutrofiler i denna grind inkluderar nativa neutrofiler hos mottagaren mus samt de adoptivt överförda märkta neutrofiler, vilka är FITC + (om märkt med CellTracker Grön) eller PE + (om märkt med Cell Tracker Orange).
OBS: Neutrofiler kan spåras i blod, benmärg och njurar hos Candida-infekterade möss under minst 4 h efter överföringen.
OBS: Fixering med 2% paraformaldehyd i PBS inte negativt påverkar den genomsnittliga fluorescensintensiteten av neutrofilerna märkta med CellTracker Green eller CellTracker Orange under minst 48 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll är optimerad för skörd av benmärgsceller från möss och den efterföljande separationen av neutrofiler från dessa celler genom densitetsgradientcentrifugering med användning av kommersiellt tillgängliga medier Histopaque cellseparation. Neutrofiler isolerades med användning av denna metod kan användas för en mängd olika nedströms funktionella studier ex vivo och för adoptiv överföring experiment i mottagaren möss.
Den typiska utbytet av insamling av benmärgsceller från både lårben och skenben per oinfekterade 8-12 veckor gamla C57BL / 6 mus är ~ 60-80 miljoner celler med en livskraft ~ 94-98%. Nedströms densitetsgradientcentrifugering av dessa celler använder Histopaque media täthetsseparation normalt ger ~ 6-12.000.000 neutrofiler per oinfekterat mus. Neutrofiler är 80-95% ren och> 95% livskraftiga, vilket verifierats genom flödescytometri (figur 1). Även om det är möjligt att märg pool benceller från flera djur innan densitetgradient centrifugering steg, pooling-celler minskar något renheten av de isolerade neutrofiler. Till exempel, medan överdra 60-80.000.000 benmärgsceller från en icke-infekterade mus i 1-3 ml PBS utbyten> 90% rena neutrofiler, minskar cellen renhet till ~ 80% när ~ 300 miljoner benmärgsceller poolas tillsammans i tre ml PBS och överlagrade.
Dessutom beskriver detta protokoll också stegen för efterföljande märkning av neutrofiler med CellTracker färgämnen, vilket möjliggör spårning av de adoptivt överförda cellerna i mottagande möss med användning av flödescytometri. Märkning av neutrofiler med 5 iM CMFDA eller CMTMR tycks inte påverka neutrofila överlevnad som märkta neutrofiler kvarstår> 95% livskraftiga (data visas ej). Märkta neutrofiler kan spåras i olika musvävnader i minst 4 timmar efter adoptiv överföring med hjälp av flödescytometri genom slussning på levande CD45 + Ly6G + CD11b + celler (Figur 2).Användningen av färgämnen differentiella märkning i vildtyp kontra gen-brist neutrofiler i konkurrenskraftiga inplantering studier möjliggör en bedömning av den direkta rollen av en specifik gen (t.ex. kemoattrahent receptor 6) i trafficking av neutrofiler från blodet in i en given målorgan.
Figur 1. Representant FACS plot av isolerade neutrofiler från benmärgsceller hos en icke-infekterade C57BL / 6 mus med densiteten protokollet centrifugering. Den vänstra panelen visar den initiala slussning används för benmärgsceller som samlats in från gränssnittet i Histopaque 1119 och Histopaque 1077 med framåt och sidospridning (FSC / SSC). Såsom visas, neutrofiler som samlats in från gränsytan är> 90% ren (mellersta fältet) och> 95% viabla (högra panelen).
<img alt = "Bild 2" src = "/ files/ftp_upload/50586/50586fig2.jpg" />
Figur 2. Representant FACS plot av överförd adoptivt CMTMR-märkta neutrofiler skördas från blod, benmärg och njurar av en mottagare Candida-smittade C57BL / 6 mus 4 tim efter cellöverföring. De adoptivt överförda CMTMR-märkta neutrofiler är PE-positiva och kan skiljas från de infödda neutrofiler hos mottagaren musen, som PE-negativ. Observera att uttryck av CD 11 b är större i neutrofiler skördats från njuren jämfört med neutrofiler skördats från blod och benmärg. Ökningen i CD11b expression i njure neutrofiler är i överensstämmelse med tidigare resultat 15 och sannolikt återspeglar aktivering av cellerna vid inträde i njuren, som är den huvudsakliga målorganet i musmodellen för systemisk candidiasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri presenterar vi en pålitlig, enkel, snabb och ekonomisk protokoll för isolering av ett stort antal neutrofiler från benmärgen av möss med hög renhet och viabilitet med användning av en densitet tillvägagångssätt gradientcentrifugering. När detta protokoll utförs korrekt, kan ~ 6-12 × 10 6 neutrofiler utvinnas från en icke-infekterade mus och så många som ~ 30-40 × 10 6 neutrofiler kan isoleras från en mus efter infektion 6. De isolerade neutrofiler är 80-95% ren och> 95% livskraftiga.
Benmärgen är en lämplig behållare för att erhålla mus neutrofiler för nedströms funktionella studier och adoptivföräldrar experiment överföring. Först har man tidigare visat att benmärg neutrofiler är funktionellt lika blodneutrofiler i möss som celler från båda avdelningarna uppvisar liknande oxidativ burst och degranulering 16. Andra har musbenmärg neutrofiler visats överleva protrhandlat tidsperioder i kultur, betydligt längre jämfört med neutrofiler musblod 16. Därför kunde skörda benmärg över blodneutrofiler möjliggöra större utbyte av celler när de behandlas för funktionella analyser ex vivo. Tredje, isolering av neutrofiler från benmärgen har fördelen att återvinna betydligt större antal neutrofiler, som är tillräckliga för nedströms adoptiv transfer experiment, både vid steady state och efter infektion. Istället kan betydligt färre neutrofiler utvinnas från mus blod, även efter infektion, och inte många neutrofiler är närvarande vid steady state i bukhålan. Således är tioglykolat eller andra medel som typiskt används för att främja rekrytering av aktiverade neutrofiler i peritoneum, denna metod hämmas av den variabla renhet av neutrofiler inom det peritoneala akuta inflammatoriska exudat (opublicerade, data ej visade) och induktionen av ett aktiverat neutrofil phenotype, som skiljer sig från den hos ostimulerade neutrofiler återvunnits från unmanipulated möss.
Flera metoder finns tillgängliga för isolering av neutrofiler från benmärg hos möss. Dessa inkluderar (a) densitetsgradientcentrifugering metoder såsom den vi presenterar här som använder Histopaque media densitet separation, och en liknande metod som använder diskontinuerlig Percoll gradienter 17, (b) positiva immunomagnetiska urval metoder, under vilka benmärgsceller är märkta med en neutrofil-specifik antikropp, såsom Ly6G, och neutrofiler sedan anrikas genom bindning av Ly6G-positiva celler på en magnetisk spalt 18, (c) negativ selektion immunomagnetiska metoder, under vilken benmärgsceller är märkta med en cocktail av antikroppar som binder på andra celler än neutrofiler (dvs. CD5 för T-lymfocyter, CD45R/B220 för B-lymfocyter, CD49b/DX5 för NK-celler, CD117 för mastceller och hematopoetiska stamceller, F4/80 förmakrofager och Ter119 för erytrocyter) 11, och sedan neutrofiler berikas genom eluering som den antikroppsnegativa fraktion av celler som inte binder på den magnetiska kolonnen, och (d) fluorescensaktiverad cellsortering, under vilken benmärgsceller är märkta med antikroppar som binder på neutrofiler och andra celler och neutrofiler separeras därefter med användning av en fluorescensaktiverad cellsorterare som cellerna som är positiva för neutrofila markörer såsom kombinationen av Ly6G och CD11b.
Även om både positiva immunomagnetiska urval metoder och fluorescensaktiverad cellsortering ger mycket höga utbyten och renheter av mus neutrofiler, dessa metoder har den nackdelen jämfört med våra protokoll som märkningsmedel binder på ytan av neutrofiler, som potentiellt skulle kunna påverka deras funktion. Positiva immunomagnetiska urval tillvägagångssätt har den ytterligare begränsningen att antikropps-märkta neutrofiler binder på en magnetisk kolonn för separation, vilket också kan påverka cellfunktionen. Fluorescensaktiverad cellsortering har den ytterligare nackdelen att signifikant längre tid krävs för uppsamling av cellerna med användning av en fluorescensaktiverad cellsorterare i ett laboratorium core facility, som negativt kan påverka överlevnaden av neutrofiler på grund av deras korta halveringstid. Vår metod är jämförbar med densitetsgradientcentrifugering metod som använder diskontinuerliga Percoll-gradienter, men skiktning de två Histopaque densitet separationsmedia är tekniskt mycket mindre utmanande jämfört med skiktning Percoll gradienter som består av 55%, 65% och 75% vol / vol i PBS , vilket resulterar ofta i sammanblandning av Percoll gränssnitten på grund av de små densitetsskillnader mellan de tre skikten. När det gäller negativa immunomagnetiska urval ansatserna har de också rapporterats vara tillförlitliga för isolering av ett stort antal funktionellt kompetenta neutrofiler med hög renhet och livsduglighet från benmärg hos möss 11
Isolerade neutrofiler användning av den beskrivna densitetsmetod gradientcentrifugering kan användas för en mängd olika nedströms funktionella studier ex vivo såsom fagocytos, döda, kemotaxi, cytokinproduktion, oxidativt utbrott och analyser degranulering med användning av publicerade protokoll 6. Dessutom kan enstaka neutrofiler varaadoptivt överföras till mottagande infekterade möss för att utvärdera rollen av neutrofila överföring på mus överlevnad och effekterna av överförda neutrofiler på immunologiska korrelat såsom cytokinproduktion vid ställen för infektion i mottagarländerna möss. För detta ändamål Tosello Boari och kollegor överfördes adoptivt härledd från benmärg neutrofiler in Trypasonoma-infekterade mottagande möss, som nedregleras IFN-γ produktion i infekterade mjälte och lever och resulterade i förbättrad överlevnad i en IL-10 beroende sätt 19.
Vidare ger förmågan att märka neutrofiler med CellTracker färgämnen CMFDA och CMTMR utan synbar färgämne-inducerad sänkning av cellernas viabilitet en möjlighet att differentiellt märka neutrofiler från möss av olika genetisk bakgrund och spåra adoptivt överförda märkta celler i olika organ mus mål med hjälp av flöde cytometri eller intravital mikroskopi. De CellTracker färgämnena kvarhålles i viable neutrofiler och inte diffundera inte till angränsande celler. I våra studier använder vi en koncentration av 5 iM för cell märkning och vi har lyckats med att spåra märkta neutrofiler i blod, benmärg och njurar av Candida-infekterade mottagande möss under minst 4 timmar efter neutrofila överföring 6. Förutom CellTracker Grön och CellTracker Orange, andra färgämnen inklusive CellTracker Violet, CFSE och Snarf-1 har också använts med framgång för att märka mus härledd från benmärg neutrofiler för adoptiv överföring experiment 11,19,20. Dessutom har den CellTracker Grön och CellTracker Orange färgämnen effektivt använts vid en liknande koncentration av 5 iM för märkning mus mjälten T-celler för adoptiv överföring och spårning experiment 21. Förmågan att differentiellt märka neutrofiler med olika CellTracker färgämnen möjliggör utforma konkurrenskraftiga inplantering experiment där en 1:01 förhållande av differentiellt märkta neutrofiler från möss med olikagenetisk bakgrund kan adoptivt överföras till mottagaren möss med syfte att fastställa den direkta rollen av specifika gener i trafficking av neutrofiler från blodet till inflammerade vävnader. Vi rapporterade nyligen att kemokinreceptorn CCR1 förmedlar handel av neutrofiler från blodet till Candida-infekterade njurar sent under infektionen, vilket resulterar i överdriven ansamling av neutrofiler i njuren, vävnadsskada och minskad överlevnad 6.
Som med alla protokoll, har vår metod också begränsningar. Till exempel, trots de ovan nämnda fördelarna med att skörda neutrofiler från benmärgen över blod, det finns stora skillnader mellan neutrofiler erhållna från dessa två avdelningar, som beroende på den efterföljande forskningen tillämpningen av de skördade cellerna kan ha en inverkan på de experimentella resultaten. Specifikt blodneutrofiler är mogna celler, medan neutrofiler från benmärgen consIST av tre olika delpopulationer som sträcker sig från omogna promyelocyter / myelocyter till mindre omogna metamyelocyter / blanketter bandet att mogna neutrofiler, som tidigare beskrivits 22. Därför kan skillnaden i cellen mognad mellan benmärg och neutrofiler blod resultera i variationer i vissa cell funktionella egenskaper som det var tidigare rapporterats för neutrofila svar på fMLF (N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanin) och intag av partiklar 23. Dessutom, eftersom varje neutrofila manipulation ex vivo kan resultera i cell aktivering och apoptos, är försiktighet nödvändig vid hantering av cellerna under centrifugering. Dessutom, eftersom CellTracker färgämnen vid högre koncentrationer än 5 iM kan påverka neutrofila överlevnad, bör denna möjlighet att testas i pilotförsök med enskilda utredare, beroende på den efterföljande funktionell analys som kommer att testas.
I sammanfattning, pre viskickade en tillförlitlig och reproducerbar metod som kan användas på alla laboratorier för att samla in och märka ett stort antal mus neutrofiler från benmärgen. Detta tillvägagångssätt kan användas för en mängd olika neutrofila funktionella studier, inkluderande in vivo adoptiv överföring och spårning experiment genom flödescytometri och intravital mikroskopi. Användningen av detta och av andra tillförlitliga protokoll för mus neutrofila rening, isolering, märkning och nedströms adoptiv överföring och studier spårning bör fördjupa vår förståelse av neutrofila fysiologi på molekylär nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Avdelningen för Interna Forskning av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA.
Samtliga möss hölls vid en American Association för ackreditering av laboratoriet Animal Care-ackrediterad djuranläggningen vid National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIAID) och förvaras i enlighet med de förfaranden som beskrivs i Guide för skötsel och användning av försöksdjur under överinseende av ett protokoll som godkändes av Animal Care och användning kommittén av NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
