Summary
在标准培养方法细胞被取出来的生理环境，生长在菜的塑料表面。研究原代人骨髓细胞的行为，我们创建了其中细胞条件扼要组织的天然微环境下生长的三维培养系统。
Abstract
组织文化是一个非常宝贵的工具来研究细胞功能的许多方面，从正常发育疾病。常规细胞培养方法依赖于细胞的任一附加到组织培养皿的固体基质或在悬浮液中生长在液体培养基中的能力。多个永生细胞系已经建立和使用这样的方法生长的，然而，当原电池需要被生长的体外这些方法常常失败。这种故障已被归因于缺少从那里组织培养塑料被用作用于细胞生长的表面的标准系统的组织微环境的适当的细胞外基质成分。细胞外基质是组织微环境的一个组成部分，它的存在是对生理功能，如细胞分化，存活和增殖的维持是至关重要的。在这里，我们提出了一个3维的组织培养方法，其中主骨生髓CELLS是生长在细胞外基质配方，概括了人骨（RBM系统）的微环境。嵌在细胞外基质，细胞通过补充了人血浆中的介质供给营养物质，从而提供了一个完整的系统，其中细胞的存活和增殖可以持续长达30天，同时保持了原代组织的细胞组成。使用成果管理系统，我们已经成功地生长正常捐助者和患者的淀粉样变，以及各种血液系统恶性肿瘤原发性骨髓细胞。成果管理系统允许的新型疗法的临床前药效的细胞行为和评价直接在矩阵的实时可视化。此外，细胞可以从RBM中分离，并随后用于体内移植，细胞分选，流式细胞术，以及核酸和蛋白质的分析。综合来看，成果管理方法提供了可靠的系统，用于原发性骨MARRO增长在生理条件下瓦特细胞。
Introduction
组织培养物的开发是为了研究在受控环境中的细胞行为进行比较在完整有机体的各种处理时，以尽量减少系统的可变性。最初成立于1900年初1,2这种方法，指的是一种技术，其中组织外植体离体培养中玻璃盘。在20世纪中期的系统适应于分散生长的细胞，而不是完整的组织碎片，和术语“组织文化”和“细胞培养”成了代名词3。在这种传统的细胞培养系统中的细胞生长的组织培养塑料覆盖以补充有各种生长因子的生长培养基的表面上。贴壁细胞培养物，其中细胞附着和铺展在组织培养塑料和非贴壁培养物，其中细胞增殖的悬浮液：两种培养物都基于不同细胞的粘附能力出现了。由于细胞的初期文化，多永生细胞系已经建立，如海拉4，第一个人类癌症细胞系。这些细胞系有细胞培养增殖下去的能力，也是最不需要任何特殊处理，以保持活力。
的原始细胞的培养方法的还原论方法的目的是要简化系统尽可能地由仅包括维持细胞生存力和增殖所需要的最低限度的部件。然而，简化的细胞培养方法无法支持体外最主要的人体细胞具有有限寿命的类型。因此，新的培养系统被设计为近似的组织微环境尽可能接近，从而使细胞外植体在生理条件下生长。在对比的常规/还原论的细胞培养方法中，3维（3-D）培养系统正在成为一种优选的方法，以有效地培养各人类细胞系和原代细胞随后学习与之相关的健康和疾病的机制，在支持微环境的上下文。这样的3-D系统通常被设置成使用补充有生长因子的重构的矩阵和/或介质，以概括的组织微环境，研究目的细胞类型。第一这些3维（3-D）培养模型的开发是为了研究乳腺发育。提供细胞的天然条件的乳腺上皮细胞包埋在基质胶中，IV型胶原和细胞外基质（ECM）的富含层粘连蛋白来源，并覆盖有生长培养基中。在这样的条件下，乳腺上皮细胞形成簇相似的乳腺腺泡，并且在刺激催乳激素，这些腺泡分泌的酪蛋白，和其它乳蛋白，成腺泡状结构的中空旭光。在标准的文化，甚至除了催乳素5后酪蛋白的分泌没有观察到，进一步强调了微环境中保持细胞的形态学和表型特征的作用。当细胞被取出，它们的生理微环境的上下文中的正常细胞功能的丧失的另一个示范是一个示范，如果不支持的微环境，角化细胞不能形成分层表皮6。已经建立了一些其他的3-D模型，以允许主单元7,8 的体外繁殖。
微环境中的细胞行为的关键作用是优雅的表现在哪里乳腺上皮细胞形成了“由内而外”腺泡胶原蛋白的培养，当我基质相比，形成于基底膜的正确极化腺泡的研究。当层粘连蛋白产生肌上皮细胞被添加到I型胶原培养9这个损失的适当的形态恢复。此外，正确的微环境所需的精确基因型表现。生长在培养皿中，转染的细胞 - 细胞粘附分子CEACAM1 MCF7乳腺癌细胞行为完全一样的未转染CEACAM阴性细胞。然而，当在基质胶中培养的，在ECM中，野生型形式的MCF7肿瘤样结构接触而MCF7细胞转染CEACAM1恢复到正常的表型和腺泡形态与中空旭光，因为已经建立了与非恶性乳腺上皮细胞10。类似地，阻断β1-整合素在乳腺癌细胞中不改变他们的行为的标准培养条件下，但以3-D培养物进行同样的实验表明，阻断β1-整合恢复恶性细胞为正常表型11。因此，组织的微环境，不仅需要维持细胞生存力，也能保持正常的细胞功能。
除了提供其中细胞行为可以在生理条件下被研究的系统秒，3维文化作为强大和可靠的介质的新型疗法8,12,13临床前试验。在3-D培养细胞可研究化合物的筛选环境介导的耐药性14，在细胞-细胞和细胞-细胞外基质粘附的贡献可以评估的条件下进行。此外，新化合物的脱靶毒性可通过将各种组织的多种细胞区室来确定。这样的屏幕可以更快速地进行，且更具成本效益比在体内 8的可比性研究。
这里，我们提出的重构的骨髓（RBM），其中正常和恶性骨髓（BM）细胞增殖的体外系统中的密切模仿人类骨髓微环境的一个3-D模型的设置。先前尝试在二维培养，液体或BM间质中各种成分粘附共培养成长初级人类骨髓细胞，或3-D，半固体琼脂培养获得了有限的成功，因为它们无法提供细胞组织微环境15-18的组成部分。在这些系统中主要的骨髓细胞有活力差，不能增殖体外 。其中人骨髓祖细胞生长在旋转椭圆体的共培养与骨髓基质细胞的另一个系统是其中造血干细胞的活力和增殖的持续时间至少为96小时，19的三维系统。然而，尽管向造血祖生物学的理解非常有益的，这种系统并不忠实地概括了BM的由于微环境是缺乏细胞外基质成分的，因此，限制了其有用性。这里所描述的RBM模型提出了一个全面的系统，人类骨髓细胞和细胞外车厢被重建体外 。我们证明了RBM文化能够支持正常的人骨髓细胞的体外生长，因为我们LL作为细胞治疗各种血液病隔离。
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Protocol
1。提前准备
- 保持无菌的血清学移液器和移液器吸头，在4°C。
故障排除：凝胶基质胶在室温（RT），采用冷移液器和技巧将防止基底膜从文化在安装过程中胶凝。 - 解冻一瓶基底膜在4℃过夜。
2。试剂的制备
- 制备的纤维结合素储备液：使纤连蛋白的1毫克/毫升的储备溶液以在100毫升蒸馏水中溶解100毫克的人纤连蛋白。一旦纤连蛋白溶解，无菌过滤，分装，并在4℃下储存长达6个月。
故障排除：如果纤连蛋白不溶解很快孵育数分钟在水浴集的溶液在37℃下 - 10倍PBS制备：溶解80克氯化钠氯化钠，14.4克Na 2 HPO 4，2克氯化钾和2.4克KH 2 PO
- 的中和缓冲液20的制备：使含有100mM HEPES在2x磷酸盐缓冲盐水（PBS），使用1M的HEPES和10倍的PBS中的储备溶液中的溶液。调节溶液的pH至7.0。储存在4℃下2-3个月。
- 2 mg / ml的溶液鼠尾胶原类型I的制备：使中和缓冲液（步骤2.3）2毫克/毫升的胶原蛋白I的解决方案。涡的解决方案在低转速和移液器向上和向下轻轻混匀。由于这胶原蛋白是非常粘稠，避免气泡的产生，同时吸取。建议在每次准备新鲜胶原蛋白I的解决方案。保持溶液置于冰上，直到使用。
- 骨内涂层（雷德）的制备：将1毫克/毫升纤维连接蛋白分别与股票2 mg / ml的I型胶原股票（步骤2.1和2.4），以77μg/ ml的终浓度为29微克/毫升，在1x＆＃160;无菌PBS。混合并在4℃下储存长达1个月。
- 准备重建骨基质（RBM）的：
- 预冷的1.5 ml离心管置于冰上。置于冰上的所有矩阵解决方案，在任何时候。
- 混合4份基质胶（从很多到很多基质胶浓度变化，但变化被认为是可以忽略不计），2.5份1毫克/毫升纤维连接蛋白和1份2毫克/毫升的胶原蛋白I冰首先吹打成基底膜使用冷管移液器吸头，然后添加纤维连接蛋白和胶原基质胶一开始凝固温度高于4℃，所以工作迅速而吹打基底膜。混合矩阵轻轻吹打向上和向下，避免引入气泡。保持管上的冰，而混合RBM。
- 骨髓生长培养基（BMGM）的制备：使500毫升BMGM含6.2×10 -4 M 氯化钙 ，10 -6 M琥珀酸钠，10 -6 M氢化可的松，20％的人血浆（正常或恶性来自健康供体或患者收集的），和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640。的CaCl 2，琥珀酸钠和氢化可的松补充剂可以储存在-80℃下> 6个月为1000×储备溶液。当生长的细胞系，胎牛血清（FBS）的可取代的人血浆。
- 的10％中性缓冲福尔马林（NBF）的制备：加入37％的甲醛原液1倍PBS中的10％V / V的搅拌均匀，在室温下存放于避光2-3周。
- 1％牛血清白蛋白（BSA）的制备：称取BSA适量和溶解在1×PBS中。储存在4℃下，1周之内使用。 BSA溶液往往受到感染，如果冷藏保存更长的时间。或者，BSA溶液可以等分并冷冻在-20℃下长期贮存。避免反复冻融。
- 细胞恢复解决方案（CRS）准备：5毫米EDTA，1 mM的钒酸钠（钠<子> 3 VO 4）和1.5mM氟化钠（NaF）溶液中的1×PBS。无菌过滤并储存于4℃至6个月。
3。非恶性和恶性人类骨髓细胞内含3-D文化
- 通过按照制造商的指示，聚蔗糖 - 斑块梯度离心纯化初级骨髓单个核细胞。
可选步骤 ：细胞可以被标记，用0.25微米羧基二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）按照生产商的说明来跟随细胞增殖整个培养期间。
故障排除：如果细胞的CFSE染色后死亡，滴定CFSE的量随着浓度取决于细胞类型; 0.25微米很适合初级骨髓单个核细胞。 - 加65微升撕裂溶液放入48孔组织培养处理板的每孔中。分散液均匀地覆盖井的整个表面上并孵育> 30分钟，在室温。
- 制备细胞悬浮液以0.5×10 6个细胞的10微升的48孔板的1×PBS中，每孔的密度。在1.5ml微量离心管中混合的细胞悬浮液以每孔100μlRBM矩阵。混合细胞和基质RBM轻轻吹打向上和向下，避免引入气泡。置于冰上细胞/基质混合物，以避免基质凝胶。
注：成果管理系统是完全可扩展，建立了系统在非48孔格式的基础上，用板的表面面积调整所有试剂（基质和介质）的款项。比例进行相应的镀细胞的数量。 - 吸出剩余的撕裂，并加入细胞/基质混合物成的阱的中心。很快，散布细胞/基质混合物以覆盖井的整个表面上均匀。放置板30〜60分钟在37℃，5％CO 2的组织培养箱中，使基质固化。请勿摇晃或断开孵化期间TURB板。
故障排除：为了防止细胞分布不均的RBM，拌 匀之前，电镀。混合后，每5 个孔接种，以避免细胞沉降到管底。一次镀，细胞不下沉到由于表面张力在基质中的井的底部。
故障排除：为了防止细胞分布不均的RBM，拌 匀之前，电镀。混合后，每5 个孔接种，以避免细胞沉降到管底。一次镀，细胞不下沉到由于表面张力在基质中的井的底部。 - Prewarm BMGM在水浴设定为37℃。
- 30分钟后，请检查矩阵已正确设置，它会形成一个柔软的凝胶状层时，板倾斜不动。用1毫升温BMGM的覆盖细胞/基质层。为了避免矩阵吸管介质撕裂轻轻地使用（点胶滴逐滴）血清学移液管。将组装RBM文化成37℃，5％CO2细胞培养箱和培养所需的时间段。
注：细胞活力可维持至少30天不改变介质;如果需要换液每次只改变介质的50％。
关键的一步：它是至关重要的介质不冷，冷的温度可能扰乱已经设置的矩阵。小心不要喷在介质上的矩阵的顶部就可能会出现软基质层。
故障排除：如果在成果管理系统细胞活力低，细胞密度可能有实验用的细胞比骨髓抽吸初级单核细胞等工作，则必须确定。当用细胞系的工作，降低了细胞数目的10倍，作为永生化细胞系增殖比原代细胞更快。
4。 “在矩阵'成像
- 图像的培养细胞直接在RBM使用明场，微分干涉对比（DIC），共聚焦或任何其他成像技术，使远距离成像的矩阵是大约1毫米厚。使用上的许多显微镜可用的Z堆叠功能，图像的整个培养从上到下。
提示：对于下面的染色协议避免吸染色/洗涤解决方案，而不是倾斜的板，用吸管取出的解决方案。
- 取出BMGM用移液管，洗2〜3倍，用RT的1X PBS 100μL/洗/孔。确保足够的PBS用于覆盖所述孔的整个表面上。
- 通过加入100微升10％NBF /孔（对于48孔板）15分钟，在室温下固定细胞在基质中。删除NBF并与RT的1X PBS 100μL/洗/孔洗涤细胞两次。
注：避免使用冷NBF，因为它可能液化矩阵。 - 除去PBS中，过夜，以阻止抗体的非特异性结合加1％BSA的1小时在室温或4℃。
- 制备在1％BSA的第一抗体溶液在所需的稀释。稀释会各有不同，每个抗体，请与制造商或滴定，以确定最佳的抗体浓度。加的第一抗体溶液100μl/孔，并根据制造商的说明孵化。
关键步骤：所有涉及缀合的荧光团或荧光染料的抗体孵育应在黑暗中进行。 - 除去第一抗体溶液，并用1×PBS洗涤3次5分钟。
- 用于间接免疫荧光染色，培养与缀合至荧光探针1小时在室温下的二次抗体。稀释的抗体在1％BSA的浓度由制造商建议的。
- 删除辅助一ntibody溶液并用1×PBS洗涤3次5分钟。
故障排除：为了避免高背景成像过程中，滴定荧光标记的二抗和使用提供足够的信号的最低浓度。如果高的背景仍然是一个问题，增加洗涤步骤的数量和持续时间，或使用直接结合的一抗，并跳过步骤4.2.6。 - 染色的细胞核中添加4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）的核染色溶液中，在由制造商所建议的稀释，并孵育在室温下7-10分钟。
- 除去核染色溶液中，用1×PBS中洗2×5分钟。
- 从最后一次洗涤除去PBS并加入一滴安装介质（常规设置），在样品上保留的荧光。图像上使用荧光或共聚焦显微镜适当的激发/发射设置。
注：成像应在2天内染色完成为了避免矩阵和RBM完整性和荧光信号的损失损耗下降。如果不立即成像，彩色样本应保持在4℃，避光，直到成像。
5。从RBM细胞的分离
- 轻轻取出介质，而不会干扰基质层。不要吸。
- 洗涤细胞2倍，用无菌1X PBS。不要吸。
- 加入0.5毫升冰冷的CRS到每个孔中，并伴随着细胞移除整个基质层，通过大力上下吹打。收集细胞，基质，和CRS在1.5ml微量离心管中。放置于冰上。
- 添加一个额外的0.5毫升CRS在同一井和收集所有剩余的材料。转移到同一个离心管中。
- 涡流细胞，基质，和对照品，将混合物在冰上孵育1小时。涡流细胞每隔15分钟，以促进从基质释放。
- 1小时，无肉眼可见团块后检查混合物矩阵应该存在。
故障排除：如果是矩阵的团块仍然可见1小时后，转移细胞/矩阵/ CRS混合到一个更大的管中，加入额外2-5毫升的CRS，孵育一个额外的30-60分钟。 - 离心细胞，在CRS在4℃下1,000 rpm离心5-10分钟去除上清，重悬细胞沉淀在1ml冷的1X PBS的。
- 离心机在1,000 rpm下5-10分钟，去除上清。重复的PBS洗一次。
- 第二PBS洗涤完成细胞从基质和分离的细胞中回收，可用于任何下游应用，如DNA / RNA /蛋白质分离，流式细胞术， 在体内移植等 。
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Representative Results
由于原发性骨髓细胞不能标准组织培养条件下增殖，成果管理系统的建立是为了紧密地模仿骨微环境，提供一个系统的文化和扩大骨髓细胞体外 。在BM细胞外基质，纤维连接蛋白，Ⅰ型胶原，Ⅳ型胶原，层粘连蛋白和21的主要组成部分，已被纳入RBM矩阵，以提供结构骨架，以这种3-D的文化。骨内膜，骨及骨髓，富含胶原蛋白I和纤连蛋白之间的接口，被重建通过涂覆组织培养皿与这些蛋白质的表面上。在BM中的多个细胞区室之间的串扰贡献于组织的整体平衡。为了确保没有任何细胞成分被排斥在外，成果管理文化已设置使用普通肝素单核细胞从人骨髓针吸活检。以确保该系统是与激素，生长因子，一个供给存在于循环系统环境ð细胞因子，培养基中补充了人血浆中对应于样品被培养（ 即从正常供体的血浆中加入时，非恶性骨髓细胞置于RBM，而从患者的血浆加入到恶性的培养细胞）（图1）。
BM和健 康供者和患者与普渡大学和阿尔伯塔院校研究委员会大学批准后，并根据赫尔辛基宣言（表1）书面知情同意书后，各种血液系统恶性肿瘤采集血样 。单核细胞从骨髓活检中分离增殖并维持其在成果管理系统的可行性进行长达30天（图2）。为0.5×10 6cells/100μlRBM矩阵的细胞浓度已被确定为是最佳的密度为初级骨髓细胞。超越氏s密度overcrowds系统随着时间的推移降低细胞活力和增殖率。较低的密度，也被证明是不利的系统的整体健康的细胞 - 细胞接触已经证明重要的健壮生长。成果管理中的增长可以用二醋酸盐，琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记细胞后跟随。 CFSE的荧光强度减半，每个细胞分裂，从而细胞增殖可以通过显微镜进行跟踪或流式细胞仪随着时间的推移。此外，RBM文化中的细胞区室保持在相同的比例是目前的活检样品8。除造血谱系的细胞，基质隔间呈现强劲增长RBM。碱性磷酸酶表达能力矿化钙，抗酒石酸酸性磷酸酶染色破骨细胞，油红阳性脂肪细胞，并产生纤维粘连蛋白基质细胞的成骨细胞被发现在骨内膜/成果管理系统的BM界面（如图3）。
两者合计，我们的数据表明，RBM模型提供了第一次离体系统中，从健康供者和患者的各种血液系统恶性肿瘤如白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤原代人类骨髓细胞可以持续并扩大了长达30天。注重结果的管理提供了一个全面的模型来在本土的BM微环境的背景下研究生理条件下细胞的行为。该系统已经用于我们的实验室来确定多发性骨髓瘤的癌症干细胞的表型，并研究了恶性细胞和骨髓细胞外基质之间的相互作用，以及恶性细胞和骨髓基质之间的串扰。
| 诊断 | 电池类型 | 生存 | |
| 非恶性 | BM | 温和 | 温和 |
| 淀粉样变 | BM | 高 | 高 |
| 意义不明的单克隆丙种球蛋白病 | BM | 高 | 高 |
| 外周血单个核细胞 | 无 | 无 | |
| 浆 | BM | 高 | 高 |
| 闷燃的多发性骨髓瘤 | BM | 高 | 高 |
| 多发性骨髓瘤 | BM | 高 | 高 |
| 外周血单个核细胞 | 无 | 无 | |
| MB | 高 | 高 | |
| 浆细胞白血病 | BM | 高 | 高 |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | HIGħ | 高 |
| 急性髓细胞性白血病 | BM | 高 | 高 |
| 急性早幼粒细胞白血病 | BM | 高 | 高 |
| 外周血单个核细胞 | 无 | 无 | |
| 急性淋巴细胞性白血病 | BM | 温和 | 温和 |
| 慢性粒细胞性白血病 | BM | 温和 | 高 |
| 慢性淋巴细胞性白血病 | BM | 低 | 慢 |
| 外周血单个核细胞 | 无 | 无 | |
| 非霍奇金淋巴瘤 | BM | 温和 | 慢 |
| 外周血单个核细胞 | 无 | 无 |
表1中。生存在RBM培养各类标本的增殖。骨髓米ononuclear细胞（BM），来自健康捐赠者和病人确诊患有各种恶性肿瘤外周血单个核细胞（PBMC），或动员血液样本（MB）的RBM培养。下表列出了所有样品类型的培养在RBM随着细胞类型（ 即骨髓，外周血单个核细胞，或MB）。细胞的存活和增殖RBM的程度都注意到。而BM和MB表现出强劲增长的成果管理，外周血单个核细胞来自患者的各种恶性肿瘤中分离是不可行的RBM。
图1。 。RBM设置的示意图 RBM由两个阶段组成：1）内膜涂层（纤维连接蛋白，Ⅰ型胶原（CI））和2）RBM基质（纤维连接蛋白，Ⅰ型胶原（CI），Ⅳ型胶原（CⅣ）和层粘连蛋白） 注 。 ：Ⅳ型胶原和层粘连蛋白是米基质胶的ajor元件，从而不需要单独添加这些蛋白质是必需的。这些阶段是由内膜上矩阵的薄涂层上覆盖的RBM矩阵/细胞混合物设立两个步骤。要按照时间的推移细胞增殖，细胞可以事先与RBM基质混合用CFSE标记。在培养期间，细胞可以通过显微镜观察及细胞迁移性，可以实时跟踪用装有温度/ CO 2的控制腔室中的显微镜。在培养细胞14-30天可以从基质中分离并进行各种下游分析，包括在体外和体内的程序。 点击这里查看大图。
图2。在RBM细胞区室的自我隔离时间过程。骨髓细胞生长在RBM的天数表示。间质元素变得明显了14天，但可以早在RBM 5天的检测。在培养期间细胞的过程中可以看出，通过RBM矩阵迁移和聚集成不同的集群。恶性细胞的群众扩大随着时间的推移（比较9-30天之间的簇大小）。文化的各时间点有代表性的观点是用亮视野显微镜倒置显微镜（放大倍数：200X）抓获。 点击这里查看大图。
图3。间质隔室“供给”的RBM中，为了评估该长大在RBM的基质组分的组合物，将细胞在RBM基质和骨内涂层之间的过渡进行了评价的成纤维细胞，成骨细胞，脂肪细胞，破骨细胞和特定形态和标志物表达（a）为检测成纤维细胞，将细胞染色，纤维粘连蛋白（绿色），肌动蛋白（红色）和细胞核（蓝色）和成象在共聚焦显微镜（倍率：200倍）（b）细胞与基质的形态被证明是preosteoblasts具有高水平的碱性磷酸酶活性（B.1）的并且能够矿化钙通过茜素红染色（B.2）测定的。（c）与脂滴的一个明显的存在使细胞根据阳性染色以鉴定为脂肪细胞油红（C.1）。（四）细胞偶有多个细胞核被确认为公关eosteoclasts和阳性抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）（D.1）。明场和颜色（非荧光）图像被收购倒置显微镜配备了彩色摄像头（放大倍数：200X）。 点击这里查看大图。
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Discussion
成果管理模型提供其中的细胞在BM的组合物保持离体长达30天的综合系统。骨髓细胞按其功能密切模仿体内发现的BM架构RBM自分层种植。此外，这是第一个系统，它允许对多发性骨髓瘤克隆8的扩张。为确保BM细胞的生长健壮和培养物的整体成功的最关键的步骤是：1），得到的BM细胞与> 70％生存力和较自由的红血细胞的健康人群，2），以确保基质组分充分混合，使细胞均匀地分布在整个基质中，和3）小心不要损坏矩阵时生长培养基加入到系统中。以确保恶性细胞的增殖健壮，生长培养基中应当补充了人血浆相匹配的患者的细胞被培养的诊断。 Ø被发现的成果管理制的NE限制是无法支持的CD34 +造血干细胞，CD20 + B细胞和CD138 +浆细胞的纯化群体中没有骨髓基质车厢。
成果管理系统是非常灵活，可以在很多方面为最适合具体研究的目标进行修改。内皮隔室可以被添加到系统中，以模仿在BM和额外的细胞外基质成分的血管生成可以提供给使基质组合物尽可能接近到体内化妆的BM与基质浓度可以调整，以反映疾病状态，其中个别的基质组分的浓度可以改变21。除培养的原代细胞，RBM系统适合于共培养各种细胞系，研究特定的细胞群之间的细胞 - 细胞相互作用。例如，该系统可以被设置为一个共存，其中的基质升细胞接种在骨内涂层，造血细胞中加入对基质细胞的顶部，而且整个基质/造血共培养时先用RBM矩阵，然后覆盖有生长培养基中。也有用的，可能是培养基成分的修改，包括通过调节基质研究可溶性因子如何影响细胞的行为12各种渠道或媒介等离子。细胞因子，生长因子和激素也可以加入到生长培养基中，但是，应注意不全部更换生长培养基中培养时，一旦如由细胞在RBM中分泌的生长维持的因素可能会丢失，从而，影响了系统的整体可行性。我们建议更换到介质的50％的时间。
成果管理系统可以用来研究这两种细胞的行为（ 即增殖，存活，迁移等 ），并评估效能和新的治疗的脱靶效应š8,12。该系统被设置为概括了组织微环境，因此，研究用药物的疗效可以的环境介导的耐药性14的条件下进行评价。使用活细胞的实时显微术，整个治疗过程中细胞生存力可以通过活/死染色法进行评估和治疗各种细胞器的影响可以使用多个可商购的细胞器特异性染料容易渗入RBM矩阵进行评估，并采取行动的细胞，而不会产生可能影响成像显著背景。
成果管理系统提供了一个高度灵活和适应性强的模型来研究骨髓疾病。这种3-D培养方法的益处相对于标准的2-D培养物中研究细胞行为的组织的微环境，确保不漏掉的多重相互作用的影响，当细胞从自身物理隔离的上下文的能力目的论环境并放置在塑料培养皿中。成果管理系统在体内模型的吸引力在于制度的地方，不能在体内由于成像技术的局限性见过的相互作用可以很容易地解剖的透明度。成果管理系统提供了一个媒介，便于操作部件，同时保持整体组织构成，从而使研究人员解剖调查的分子机制。此外，成果管理系统已被验证为一个具有成本效益的方式，而在体内试验，进行新型疗法8,12临床前研究。综合来看，RBM模型提供了一个系统，组织生物学的许多方面可以使用主样本进行调查体外 。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作是由卫生部，国家癌症研究所（1R21CA141039），BD生物科学的研究资助奖，美国癌症协会的机构研究资助（IRG＃58-006-53），在普渡大学癌症中心的国家研究院的赞助研究，健康研究和阿尔伯塔癌症委员会研究倡议计划的加拿大学院。 MP是由美国国家癌症研究所癌症预防实习计划的国家卫生研究院，支持（R25CA128770; PI：D. Teegarden）的肿瘤学科学中心和发现式学习研究中心在美国普渡大学管理。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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