Summary
標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。
Abstract
組織培養は、通常の開発から病気に、細胞機能の多くの側面を研究するための貴重なツールとなっている。従来の細胞培養方法は、組織培養皿の固体基質に付着したり、液体媒体中で懸濁液中で増殖するいずれかの細胞の能力に依存する。多数の不死化細胞株が作成され、そのようなアプローチを用いて成長させた初代細胞がex vivoで成長させる必要がある場合、しかしながら、これらの方法はしばしば失敗する。このような障害は、組織培養プラスチックは、細胞増殖のための表面として使用される一般的なシステムからの組織の微小環境の適切な細胞外マトリックス成分の不在に起因している。細胞外マトリクスは、組織微小環境の不可欠な構成要素であり、その存在は、細胞の極性化、生存および増殖などの生理的機能の維持のために重要である。ここでは、一次骨髄セル3次元組織培養法を提示lsのは、ヒト骨（RBM系）の微小環境を再現するように処方細胞外マトリックス中で増殖させる。細胞外マトリックス中に埋め込まれ、細胞は、このように一次組織の細胞組成を維持しながら、細胞生存および増殖は、30日まで持続することができる総合的なシステムを提供し、ヒト血漿を補充した培地を介して栄養素が供給される。 RBMシステムを使用して、我々は成功し、正常なドナーや患者アミロイドーシス、および様々な血液悪性腫瘍からの一次骨髄細胞を成長している。 RBMシステムは、直接、イン行列リアルタイム細胞の挙動の可視化と新規治療薬の前臨床効果の評価が可能になります。さらに、細胞は、RBMから単離し、続いてインビボでの移植、細胞選別、フローサイトメトリー、および核酸とタンパク質分析のために使用することができる。一緒になって、RBMの方法は、一次骨marroの成長のために信頼性の高いシステムを提供しています生理的条件下で細胞ワット。
Introduction
組織培養は、無傷の生物において各種の処理を比較するとき、全身の変動を最小限に抑えるために制御された環境における細胞の挙動を研究するために開発された。この方法は、最初に初期の1900年の1,2年に設立され、組織外植片をガラス皿にex vivoで培養した技術を意味した。半ば1900年代では、システムではなく、無傷の組織の断片よりも分散した細胞を増殖するように適合され、用語「組織培養」と「細胞培養」は3の代名詞となった。このような従来の細胞培養系において、細胞は、種々の成長因子を補充した増殖培地を重層した組織培養プラスチックの表面上に成長させる。接着細胞培養、細胞が付着し、細胞を懸濁液中で増殖された組織培養プラスチックおよび非接着性培養物、上に広げ：培養物の2つのタイプが種々の細胞の接着能力に基づいて、浮上している。細胞の初期の頃から培養物は、多数の不死化細胞株は、HeLa細胞4、第一のヒト癌細胞株として、作成されている。これらの細胞株は、細胞培養で無限に増殖する能力を有し、そしてほとんどが生存能力を維持するために特別な処理を必要としない。
元の細胞培養法の還元主義的アプローチは、細胞生存および増殖を維持するのに必要なだけ最低限の成分を含むことによって、可能な限りシステムを簡素化するために設計された。しかし、簡略化された細胞培養アプローチは、有限の寿命を有するex vivoで最も主要なヒト細胞タイプをサポートすることができない。従って、新たな培養系は、したがって、細胞外植片を生理的条件下で増殖させ、可能な限り厳密に組織微小環境に近似するように設計されている。還元主義/従来の細胞培養手法とは対照的に、3次元（3-D）培養システムは、現在、種々の培養を効率的に好適な方法になってきているヒト細胞株および初代細胞は、その後、支持微小環境の文脈において、健康および疾患に関与する機構を研究する。このような3次元システムは、通常、目的の細胞型を研究する組織の微小環境を再現するためには、成長因子を添加し、再構成された行列、および/またはメディアを使用して設定されています。これらの3次元（3-D）培養モデルの第一は、乳腺発達を研究するために開発された。乳腺上皮細胞をマトリゲルに包埋した天然条件下、コラーゲンIVおよび細胞外マトリックス（ECM）のラミニン豊富な供給源を細胞に提供し、成長培地を重層する。このような条件下では、乳房上皮細胞が乳腺腺房に似たクラスターを形成し、乳腺刺激ホルモンによる刺激の際に、これらの腺房は、腺房様構造の中空lumenaに、カゼイン、および他の乳タンパク質を分泌した。カゼイン分泌あってもプロラクチン5の添加後、標準的な培養では観察されなかったさらに、細胞の形態学的および表現型の特徴を維持における微小環境の役割を強調している。細胞は、それらの生理学的微小環境の文脈から取り出される正常な細胞機能の喪失の別のデモでは、支持的微小環境なしに、ケラチノサイトは重層化表皮6を形成するために失敗していることの証明である。他の3-Dモデルの数は、初代細胞のex vivo増殖7,8を可能にするために作成されている。
細胞挙動における微小環境の重要な役割は、エレガントな乳腺上皮細胞は、私が行列コラーゲン中で培養し、マトリゲル内に形成された正確に偏光した腺房と比較した「インサイド·アウト」腺房形成の研究で実証された。ラミニン産筋上皮細胞は、コラーゲンI培養9に追加されたときに適切な形態のこの損失は、元に戻されました。また、正確な微小環境を正確に必要です遺伝子型症状。 CEACAM1は、非トランスフェクトCEACAM陰性細胞とまったく同じように動作し、細胞 - 細胞接着分子でトランスフェクトされた皿、MCF7乳癌細胞で増殖させた。しかし、非悪性乳腺上皮10との間に確立されているようにCEACAM1にトランスフェクトされたMCF7細胞は、中空lumenaの正規表現型および形態腺房に戻りつつECM、野生型MCF7形腫瘍のような構造と接触し、マトリゲルで培養した。同様に、乳癌細胞におけるβ1-インテグリンの遮断は、標準的な培養条件下で、それらの動作を変更したが、3-D培養物で行った同じ実験は、β1-インテグリンの遮断が正常な表現型11に悪性細胞を戻すことを実証しない。したがって、組織微小環境は、細胞生存率を維持するために必要とされるだけでなく、適切な細胞機能を保持する。
細胞の挙動は、生理的条件下で研究することができるシステムを提供することに加えてsは3-D培養物は、新規治療薬8,12,13の前臨床試験のための堅牢で信頼性の高い媒体として機能する。 3-Dで細胞を培養すると、細胞-細胞および細胞-ECM間接着の寄与を評価することができる環境媒介性薬剤耐性14に記載の条件下での治験化合物のスクリーニングを可能にする。さらに、新規化合物のオフターゲット毒性は、種々の組織の複数の細胞区画に組み込むことによって確認することができる。このようなスクリーンは、より迅速に行われ、より費用対効果のインビボ 8 で同等の試験よりもすることができる。
ここでは、正常および悪性の骨髄（BM）細胞が密接にヒトBMの微小環境を模倣するシステムにおいてex vivoで増殖する 、再構成された骨髄（RBM）の3-Dモデルの設定を提示する。 BM間質の様々な構成要素を有する2-D培養物は、液体または接着共培養において初代ヒトBM細胞を増殖する以前の試み、又は3-D、半固体寒天培養物は、組織微小環境15-18の成分を細胞に供給することができないことに限られた成功しか収めていない。これらのシステムでは、一次骨髄細胞は、貧しい人々の生存能力を持っていたし、ex vivoでの増殖することができませんでした。ヒトBM前駆細胞は、BM間質細胞との共培養スフェロイドで増殖させる別のシステムは、造血幹細胞の生存および増殖は、少なくとも96時間持続した19 3-Dシステムである。造血前駆細胞生物学の理解に非常に有益なものの、このシステムは、忠実にその有用性を制限するため、ECM成分が存在しないためBMの微小環境を再現しない。ここで説明するRBMモデルは、人間の骨髄の両方細胞および細胞外区画は、in vitroで再構成され、総合的なシステムを提供します。我々は、RBM培養物は、正常ヒトBM細胞のex vivoでの増殖を支持することができることを示しているとして、我々様々な血液疾患の患者から単離された細胞のようにチェック！
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Protocol
1。事前準備
- 4℃で滅菌した血清学的ピペットおよびピペットチップを保つ
トラブルシューティング：室温（RT）でマトリゲルゲル、寒ピペット·チップを使用して、培養セットアップ時にゲル化マトリゲルを防ぐことができます。 - 4℃で一晩マトリゲルの瓶を解凍する。
2。試薬の調製
- フィブロネクチンのストック溶液の調製：100mlの蒸留水に100mgのヒトフィブロネクチンを溶解することによってフィブロネクチンの1 mg / mlのストック溶液を作る。 6ヶ月まで4℃でのフィブロネクチンが溶解したら、滅菌フィルター、分量、店舗。
トラブルシューティング：フィブロネクチンは、迅速に溶解37℃の水浴セット内の数分間溶液をインキュベートしていない場合 - 10×PBSの調製：80gの塩化ナトリウムのNaCl、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2gのKClおよび2.4グラムのKH 2 POを溶解
- 中和緩衝液20の調製：1 M HEPESおよび10×PBS原液を使用して、2×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で100mMのHEPESを含有する溶液を作る。 7.0に溶液のpHを調整します。 2〜3ヶ月、4℃で保存してください。
- ラット尾コラーゲンタイプの2 mg / mlの溶液の調製は、I：中和バッファー（ステップ2.3）中の2 mg / mlのコラーゲンI溶液を加えます。低速でのソリューションをボルテックスし、上下にピペッティングにより穏やかに混合。このコラーゲンは非常に粘性であるため、ピペッティングしながら、気泡の発生を避ける。これは、新鮮なたびに、コラーゲンI溶液を調製することが推奨される。使用するまで氷上で溶液を準備しておく。
- 骨内膜コーティング（引き裂く）の調製：1X＆で、それぞれ77μg/ mlのおよび29μg/ mlの、最終濃度を2 mg / mlのコラーゲンIストック（2.1および2.4ステップ）で1 mg / mlのフィブロネクチン株式ミックス＃160;滅菌PBS。混合し、1ヶ月まで4℃で保存する。
- 再構築された骨基質（RBM）の調製：
- 氷上の予冷1.5mlのマイクロチューブ。常時氷上すべてのマトリックス溶液を保管してください。
- 4部マトリゲル（マトリゲル濃度はロットごとに異なりますが、変動は無視できる程度であることが判明した）、1 mg / mlのフィブロネクチンの2.5部と第ペッティングマトリゲルによる氷上で2 mg / mlのコラーゲンIへの1の部分をミックスフィブロネクチンとコラーゲンIをマトリゲルを追加し、コールドピペットチップを使用して、管を4℃以上の温度で固化し始めるので、マトリゲルピペッティングしながら、すぐに動作します。気泡を導入しないよう、上下にピペッティングによって、非常に静かに行列を混ぜる。 RBMを混合しながら氷上でチューブを保持します。
- 骨髄増殖培地（BMGM）の調製：6.2×10 -4 MのCaCl 2、10 -6 Mコハク酸ナトリウム、10 -6 Mヒドロコルチゾン、20％ヒト血漿（BMGM含有する500mlのを作る正常または健常ドナーまたは患者から採取悪性）、およびRPMI-1640中の1％のペニシリン/ストレプトマイシン。のCaCl 2、コハク酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン及びサプリメントは、1,000倍のストック溶液として> 6ヶ月間-80℃で保存することができる。細胞株を成長させる際に、ウシ胎児血清（FBS）は、ヒト血漿の代わりに用いることができる。
- 10％中性緩衝ホルマリン（NBF）の調製：10％容量/ vのPBSで1Xを、37％ホルムアルデヒドストック溶液を追加よく混合し、光から保護し、2〜3週間、室温で保管してください。
- 1％ウシ血清アルブミン（BSA）の調製：BSAの適量を秤量し、1×PBSに溶かし。 4℃で保存し、1週間以内に使用しています。 BSA溶液は、より長い期間にわたって冷蔵した場合汚染さ傾向がある。あるいは、BSA溶液を等分し、長期保存のために-20℃で凍結することができる。凍結融解を避ける。
- 細胞回収液（CRS）の調製：5mMのEDTA、1mMのバナジン酸ナトリウムせ（Naを<メイク1×PBS中にサブ> 3 VO 4）および1.5mMのフッ化ナトリウム（NaFの）溶液。 6ヶ月まで4℃で滅菌フィルターや店舗。
3。非悪性および悪性のヒトBM細胞の組み込み3次元培養
- 製造業者の説明書に従って、フィコール - プラーク勾配遠心分離により、一次BM単核細胞を精製する。
オプションのステップ ：細胞は、培養期間を通して細胞増殖を追跡する製造業者の指示につき0.25μMカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（CFSE）で標識することができる。
トラブルシューティング：細胞はCFSE染色後に死亡した場合は濃度が細胞の種類に依存するため、CFSEの量を滴定、0.25μMのは、一次骨髄単核細胞に適しています。 - 48ウェル組織培養処理プレートの各ウェルにREND液65μlを加える。ウェルの全面を覆うように均等にソリューションを広げ、> 30インキュベートRTで分。
- 48ウェルプレートのウェルあたり1×PBSを10μlの0.5×10 6細胞の密度で細胞懸濁液を準備します。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにウェルあたりRBM行列100μlの細胞懸濁液を混ぜる。優しく上下にピペッティングにより細胞やRBM行列を混ぜ、泡を導入することを避ける。マトリックスのゲル化を防ぐために氷の上で、細胞/マトリックス混合物を保管してください。
注意：RBMシステムは完全にスケーラブルであり、非48ウェルフォーマットにシステムを設定するために、使用されるプレートの表面積に基づいてすべての試薬 （行列や培地）の量を調整します。それに応じてめっきされる細胞の数をスケール。 - 残りRENDを吸引し、ウェルの中央に、細胞/マトリックス混合物を追加します。すぐに、均一にウェルの表面全体を覆うように、細胞/マトリックス混合物を広げた。 37°Cで30〜60分間プレートを置き、5％CO 2組織培養インキュベータマトリックスを固化することを可能にする。振ったり、DISしないでくださいインキュベーション中、プレートをTURB。
トラブルシューティング：めっき前によく混ぜ、RBMのセルの偏在を防ぐため。すべての5の目だけでなく、チューブの底にセトリング細胞を避けるために、メッキ後に混ぜる。一度メッキ、細胞がマトリックスに表面張力により井戸の底に沈むしないでください。
トラブルシューティング：、RBMのセルの偏在を防ぐメッキによく前にミックスする。よくチューブの底にセトリング細胞を避けるために、メッキごとに5 回目の後に混ぜる。一度メッキ、細胞がマトリックスに表面張力により井戸の底に沈むしないでください。 - 37℃に設定した水浴中で予熱しBMGM
- 30分後、行列が適切に設定されていることを確認してください、それはプレートが傾いたときに移動しない層のような柔らかいゲルを形成する。暖かいBMGM 1mlで細胞/マトリックス層を重ねる。非常にゆっくりと行列ピペット媒体の引き裂きを回避するために使用して（滴ずつ分注）血清学的ピペット。 37℃で、所望の時間のために、5％のCO 2組織培養インキュベーターや文化に組み立てRBM文化を置きます。
注：細胞生存率は、培地を交換せずに少なくとも30日間維持され、培地交換が必要な場合にのみたびに、培地の50％を変更する。
重要なステップ：それは冷たい温度が既に設定されている行列を乱す可能性があるため媒体が冷えていないことが重要です。それは柔らかいマトリックス層を壊すかもしれないで、マトリックスの上にメディアを噴出しないように注意してください。
トラブルシューティング：RBMシステムにおける細胞生存率が低い場合、細胞密度は、BM吸引液からの一次単核細胞以外の細胞を操作するときに実験的に決定されなければならない。細胞株を操作する場合、不死化細胞株は、初代細胞よりも速く増殖するように、細胞数を10倍減少させる。
4。 「イン行列 'イメージング
- 明視野画像を用いて直接RBMで培養された細胞、微分干渉コントラスト（DIC）、共焦点又はマトリックスは、約1mmの厚さであるように、長距離の撮像を可能に任意の他の撮像技術。上から下まで全体の文化イメージに顕微鏡の多くで利用可能なzスタック機能を使用します。
ヒント：以下の免疫染色プロトコルは染色/洗浄溶液を吸引しないようには、代わりにプレートを傾け、ピペットを用いてソリューションを削除します。
- ピペットを使用してBMGMを削除し、RT 1XのPBSを100μl/洗浄/ウェルで2〜3倍を洗う。十分なPBSをウェルの表面全体をカバーするために使用されていることを確認してください。
- 室温で15分間10％のNBFの（48ウェルプレート用）100μl/ウェルを添加することにより、マトリックス内の細胞を固定。 NBFを削除して、RT 1XのPBSを100μl/洗浄/ウェルで細胞を2回洗浄します。
ノート：それは、マトリックスを液化可能性がある冷たいNBFの使用は避けてください。 - PBSを除去する、抗体の非特異的結合をブロックするために室温で一晩又は4℃で1時間、1％BSAを加える。
- 必要な希釈で、1％BSA中の一次抗体溶液を準備します。希釈は、メーカーに確認するか、最適な抗体濃度を決定するために滴定、各抗体ごとに異なります。一次抗体溶液100μL/ウェルを添加し、製造業者の指示に従ってインキュベートする。
重要なステップ：蛍光団または蛍光色素に結合させた抗体を含む全てのインキュベーションは、暗闇の中で行われるべきである。 - 一次抗体溶液を除去し、5分間×PBSで3回洗浄します。
- 間接免疫蛍光染色のために、室温で1時間の蛍光プローブに結合させた二次抗体とインキュベートします。製造元が推奨する濃度で、1％BSA中で抗体を希釈する。
- 二次Aを削除ntibody液と5分間×PBSで3回洗浄します。
トラブルシューティング：高いバックグラウンドを回避するために撮像中に、蛍光結合二次抗体を滴定し、十分な信号を提供し、最も低い濃度を使用しています。高いバックグラウンドがまだ問題になる場合は、洗浄工程の数と期間を増やすか、直接結合一次抗体を使用して、ステップ4.2.6をスキップします。 - 核は、製造業者によって示唆さの希釈率で、 '、6 - ジアミジノ2 - フェニルインドール（DAPI）核染色溶液を4染色を追加し、室温で7-10分間インキュベートする。
- 核染色溶液を除去し、5分間1X PBSで2回洗う。
- 最後の洗浄から、PBSを削除し、蛍光を維持するために試料上に、封入剤の滴（正規集合）を追加します。蛍光または共焦点顕微鏡上で適切な励起/発光の設定を使用してイメージ。
注：画像は、染色の2日以内に行われるべきであるマトリックス及びRBMの完全性と蛍光シグナルが失われるの劣化を回避することができる。すぐに画像化されていない場合は、染色されたサンプルが撮像されるまで、光から保護し、4℃で維持されるべきである。
5。 RBMから細胞を分離
- マトリックス層を乱すことなく静かに培地を除去します。吸引しないでください。
- 洗浄細胞は、滅菌1×PBSで2倍。吸引しないでください。
- 各ウェルに氷冷したCRSの0.5ミリリットルを追加し、激しく上下にピペッティングにより、細胞と一緒に行列全体の層を除去する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の細胞、マトリックス、およびCRSを収集します。氷の上に置きます。
- 同じウェルに追加の0.5ミリリットル、CRSを追加し、すべての残りの材料を集める。同じマイクロ遠心チューブに移します。
- 渦細胞、マトリックス、およびCRSの混合物と1時間、氷上でインキュベートする。渦細胞は15分毎に、マトリックスからの放出を容易にする。
- 1時間後、目に見える塊の後に混合物を確認してください行列の存在すべきである。
トラブルシューティング：行列の塊が1時間後に観察される場合は、より大きなチューブに転送細胞/マトリックス/ CRSの混合物、CRSの追加の2〜5ミリリットルを追加し、さらに30〜60分間インキュベートする。 - 4℃で5〜10分間、1,000 rpmで、CRSでの遠心細胞上清を除去し、冷たい1×1mlのPBSに細胞ペレットを再懸濁します。
- 5〜10分間1,000 rpmで遠心分離し、上清を除去します。 PBS洗浄をもう一度繰り返します。
- 第PBS洗浄等は、 インビボ移植において 、フローサイトメトリー、マトリックスおよび単離された細胞からの細胞の回復は、このようなDNA / RNA /タンパク質の単離などの任意の下流の適用のために使用することができる完了する。
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Representative Results
一次骨髄細胞は、標準的な組織培養条件下で増殖することができないので、RBMシステムは密接に培養システムを提供し、骨の微小環境を模倣し、ex vivoで BM細胞を増殖するために作成された。 BM細胞外マトリックス、フィブロネクチン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニンおよび21の主要な構成要素は、この3-D培養物に構造的な足場を提供するために、RBMマトリックスに組み込んだ。骨内膜、コラーゲンI及びフィブロネクチンに富む骨とBMとの間のインタフェースは、これらのタンパク質を用いて組織培養皿の表面を被覆することによって再構築した。 BM内で複数の細胞区画間のクロストークは、組織の全体的な恒常性に貢献しています。細胞成分のいずれも省略されていないことを保証するために、RBMの文化は、人間の骨髄穿刺吸引生検から分別されていない単核細胞を使用して設定した。システムは、ホルモン、増殖因子が供給されていることを確認する循環環境に存在するd個のサイトカインは、培養培地は、ヒト血漿非悪性BM細胞はRBMに置かれたときに患者からの血漿は、悪性の培養物に添加しながら（ すなわち、正常なドナーからの血漿を、添加した試料が培養されることに対応する補充した細胞） します（図1）。
BMおよび様々な血液悪性腫瘍のパデュー大学とアルバータ制度研究掲示板大学の承認後とヘルシンキ宣言（表1）に応じて、書面によるインフォームドコンセントの後に採取した健康なドナーと患者からの血液サンプル。 BM生検から単離された単核細胞を増殖し、最大30日間、RBMシステムにおけるそれらの生存率（図2）を維持する。 RBMマトリックスの0.5×10 6cells/100μlの細胞濃度は、一次BM細胞のための最適密度であると判定された。 THIを越えて行くの密度が経時的に細胞の生存率および増殖率を低下させるシステムをovercrowds。より低い密度はまた、細胞 - 細胞接触が強固な細胞増殖のために重要なことが証明されているように、システムの全体的なヒースに有害であることが示されている。 RBM内の成長は、カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（CFSE）で細胞を標識した後に続くことができる。 CFSEの蛍光強度は、各細胞分裂、したがって、細胞増殖は顕微鏡法によって追跡することができ、または経時的にフローサイトメトリーを用いて半。生検試料8に存在したようにまた、RBMの文化の中で細胞区画は、同じ割合で維持されている。造血系の細胞に加えて、間質コンパートメントはRBMにおける堅調な成長を示す。アルカリホスファターゼ鉱化カルシウム、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色破骨細胞、オイルレッドプラスの脂肪細胞、およびフィブロネクチン間質細胞を産生することができる骨芽細胞に発現が骨内膜で発見されたRBMシステムの/ BMインタフェース（図3）。
まとめると、我々のデータは、RBMモデルは、健康なドナーならびに白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫などの種々の血液学的悪性腫瘍を有する患者由来の初代ヒトBM細胞は最大30日間持続し、拡大することができる第エクスビボシステムを提供することを実証する。 RBMは、ネイティブのBM微小環境のコンテキスト内で生理的条件下で細胞の挙動を研究するための包括的なモデルを提供しています。このシステムは、多発性骨髄腫癌幹細胞の表現型を同定し、悪性細胞およびBM細胞外マトリックスとの相互作用、ならびに悪性細胞およびBM間質間のクロストークを研究するために、我々の研究室で使用されてきた。
| 診断 | 細胞型 | 生存 | |
| 悪性でない | BM | 適度な | 適度な |
| アミロイド症 | BM | 高い | 高い |
| 意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症 | BM | 高い | 高い |
| PBMC | いいえ | いいえ | |
| 形質細胞腫 | BM | 高い | 高い |
| くすぶり型多発性骨髄腫 | BM | 高い | 高い |
| 多発性骨髄腫 | BM | 高い | 高い |
| PBMC | いいえ | いいえ | |
| MB | 高い | 高い | |
| 形質細胞性白血病 | BM | 高い | 高い |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | HIGH | 高い |
| 急性骨髄性白血病 | BM | 高い | 高い |
| 急性前骨髄球性白血病 | BM | 高い | 高い |
| PBMC | いいえ | いいえ | |
| 急性リンパ性白血病 | BM | 適度な | 適度な |
| 慢性骨髄性白血病 | BM | 適度な | 高い |
| 慢性リンパ性白血病 | BM | 低い | 遅い |
| PBMC | いいえ | いいえ | |
| 非ホジキンリンパ腫 | BM | 適度な | 遅い |
| PBMC | いいえ | いいえ |
表1。 RBMで培養された様々な試験片の生存と増殖。骨髄M細胞（BM）ononuclear、種々の悪性腫瘍と診断された健常ドナーおよび患者からの末梢血単核細胞（PBMC）、又は動員血液サンプル（MB）は、RBMで培養した。表には、細胞の種類（ すなわち 、BM、PBMC、またはメガバイト）と一緒にRBMで培養したすべての試料の種類が一覧表示されます。 RBMにおける細胞の生存および増殖の程度が注目される。 BMとMBはRBMで力強い成長を示すが、様々な悪性腫瘍の患者から単離されたPBMCは、RBMに実行可能ではなかった。
図1。 RBMのセットアップの概略図 RBM 2つのフェーズで構成されています。1）骨内膜コーティング（フィブロネクチン、コラーゲンI（CI））及び2）RBMマトリックス（フィブロネクチン、コラーゲンI（CI）、コラーゲンIV（CIV）およびラミニン） 注 ：コラーゲンIVおよびラミニンはMですマトリゲルのajorコンポーネントは、このようにこれらのタンパク質の全く別々の添加は必要ありません。これらのフェーズは、骨内膜マトリックスの薄いコーティングの上にRBMマトリックス/細胞混合物を重ねることによって2段階に設定されています。経時的な細胞増殖に追従するために、細胞の前RBMマトリックスと混合するCFSEで標識することができる。培養の期間にわたって、細胞を顕微鏡で観察することができ、細胞遊走は、温度/ CO 2恒温室を備えた顕微鏡を用いてリアルタイムで追跡することができる。 14-30後の培養細胞での日数をマトリックスから単離することができ、in vitroおよびin vivoの手順で両方を含む下流の様々な分析にかける。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。 RBMにおける細胞区画の自己分離の時間経過は。BM細胞は日数は、示された数のためのRBMで増殖させた。間質要素は、14日目までに明らかになったが、早くも5日目におけるRBMとして検出することができる。培養期間にわたって細胞はRBMマトリックスを通って移動した別個のクラスタに集約することがわかる。悪性細胞の塊（一日9月30日の間でクラスタサイズを比較して）時間をかけて展開します。各時点での文化の代表的な図は、倒立顕微鏡（倍率：200X）で明視野顕微鏡を用いて撮影した。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。間質区画はRBM内に「供給」される。RBMに脱却する間質成分の組成を評価するために、RBMマトリックスと骨内膜コーティングとの間の移行部における細胞は線維芽細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、および破骨細胞特異的形態およびマーカー発現について評価した（a）は、線維芽細胞を検出するために、細胞を、フィブロネクチン（緑色）について染色し、アクチン（赤）、および核（青）及び共焦点顕微鏡上に結像さ（倍率：200倍）。（b）の間質形態を有する細胞であることが示された高いアルカリホスファターゼ活性（B.1）のレベルおよびアリザリンレッド染色（B.2）によって決定されるように、カルシウムを鉱化することが可能と前骨芽細胞（c）は脂質滴の可視的存在を有する細胞を用いて陽性染色に基づいて、脂肪細胞と同定された時折、複数の核を有するオイルレッド（C.1）。（D）細胞はPRとして認識されたeosteoclastsおよび酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）〜（D.1）陽性であった。明視野と色（非蛍光）画像はカラーカメラ（倍率：200倍）を搭載した倒立顕微鏡で得た。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
RBMモデルは、BMの細胞組成物は、最大30日間、ex vivoで維持される総合的なシステムを提供しています。その機能が密接に生体内で見つかったBMアーキテクチャを模倣に従ってRBM自己層別化で成長させた骨髄細胞。さらに、これは多発性骨髄腫クローン8の膨張を可能にする最初のシステムである。 BM細胞の力強い成長と文化の全体的な成功を確保するための最も重要なステップは次のとおりです。1）> 70％の生存率と赤血球の大部分は自由にBM細胞の健康な集団を得るために、2）を確保することマトリックス成分を十分に混合し、細胞がマトリックス全体に均一に分布している、3）増殖培地がシステムに追加されたときにマトリックスに損傷を与えないように注意することれる。悪性細胞増殖のロバスト性を確保するために、増殖培地を細胞培養されている患者の診断と一致するヒト血漿を補充すべきである。 O認められたRBMシステムのアフィン制約は、BM間質区画せずにCD34 +造血幹細胞、CD20 + B細胞およびCD138 +形質細胞の精製された集団をサポートすることができないことである。
RBMシステムは、非常に汎用性があり、最高の特定の研究の目的に合うように多くの方法で変更することができる。内皮区画はBMとマトリックス濃度のインビボメイクアップにできるだけ近いマトリックス組成物をもたらすために供給することができるBMおよび追加の細胞外マトリックス成 分の血管新生を模倣するためにシステムに追加することが可能に調整することができる個々のマトリックス成 分の濃度が21を変更することができる疾患状態を反映している。初代細胞を培養することに加えて、RBMシステムは、特定の細胞集団の間の細胞 - 細胞相互作用を研究するために、種々の細胞株を共培養するのに適している。例えば、システムは共培養間質として設定することができますlの細胞は骨内膜コーティングの上にメッキされ、造血細胞は、間質細胞の上に追加され、全体の質/造血共培養は、増殖培地で第RBMマトリックスとし、次いで重ねられる。また、有用な、可溶性因子は、細胞の挙動12にどのように影響するかを研究する間質によって調整様々なソースやメディアからプラズマを含むように培地組成の変更がある可能性があります。サイトカイン、成長因子、およびホルモンはまた、しかしながら、世話を一旦RBM中の細胞によって分泌された成長を維持因子のように培養物中のすべての成長培地を交換しないように注意し、したがって、失われる可能性があるべきであり、増殖培地に添加することができる、システムの全体的な生存率に影響を与える。我々は時間で培地の50％まで置き換えることをお勧めします。
RBMシステムは、両方の細胞の挙動（ すなわち等の増殖、生存、遊走など）を研究し、新規治療の効力およびオフターゲット効果を評価するために用いることができる8,12は、S。システムはこのように、組織の微小環境を再現するように設定され、治験薬の有効性は、環境媒介薬剤耐性14の条件で評価することができます。生細胞のリアルタイム顕微鏡を用いて、治療の過程にわたって細胞生存率は、生/死染色によって評価することができ、様々な細胞小器官に対する処置の影響を容易にRBMマトリックスに浸透複数の市販のオルガネラ特異的色素を用いて評価することができる取られたセルによって画像化に影響を与える可能性が重要な背景を生成せずに。
RBMシステムが骨髄障害を研究するための、汎用性の高いと適応モデルを提供します。標準的な2-D培養物と比較して、このような3-D培養法の利点は、細胞がそれらのphysiから単離される場合に、複数の相互作用の効果が失われないことを確実にする組織微小環境のコンテキストで細胞の挙動を研究する能力である環境論に、プラスチック皿に入れた。 in vivoのモデルに比べRBMシステムの魅力は、イメージング技術の限界のため、生体内で見ることができない相互作用を簡単に解剖することができるシステムの透明性にある。研究者は、調査中の分子機構を精査することができ、したがって、全体的な組織組成を維持しながら、RBMシステムは、構成部品の容易な操作のための媒体を提供する。また、RBMシステムは、新規治療薬8,12の前臨床試験を実施するために、in vivo試験に比べて、費用対効果の高い方法として確認されています。まとめると、RBMモデルは、組織生物学の多くの局面は、一次試験片を用いてex vivoで調べることができるシステムを提供する。
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Disclosures
著者らは、競合する利害を宣言していません。
Acknowledgments
この作品は、健康、国立がん研究所（1R21CA141039）、BDバイオサイエンス研究助成賞、がんパデュー大学センター米国癌協会の制度研究助成（IRG＃58-006-53）、国立研究所からの補助金によって賄われていた研究、健康研究およびアルバータがん会研究イニシアティブプログラムのカナダの協会。 MPは、国立衛生研究所、国立がん研究所、がん予防インターンシッププログラムによってサポートされていました（R25CA128770、PI：D. Teegarden）腫瘍学科学総合研究センターとパデュー大学のディスカバリー·ラーニング研究所で投与。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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