Summary
I standard-dyrkningsmetoder tages celler ud af deres fysiologiske miljø og dyrket på plastoverfladen af en skål. For at undersøge opførslen af primære humane knoglemarvsceller vi skabt en 3-D kultur system, hvor celler dyrkes under betingelser opridset native mikromiljø vævet.
Abstract
Vævskultur har været et uvurderligt værktøj til at studere mange aspekter af cellefunktion fra normale udvikling af sygdom. Konventionelle celledyrkningsmetoder afhængige cellers evne til enten at binde sig til en fast substrat af en vævskulturskål eller til at vokse i suspension i flydende medium. Flere udødelige cellelinjer er blevet oprettet og dyrket ved hjælp af sådanne tiltag, men disse metoder ofte mislykkes, når primære celler skal dyrkes ex vivo. Sådanne svigt er blevet tilskrevet fraværet af de passende ekstracellulære matrix komponenter i vævet mikromiljø fra standard systemer, hvor vævskulturplast bruges som en overflade for cellevækst. Ekstracellulære matrix er en integreret del af vævet mikromiljø og dens tilstedeværelse er afgørende for opretholdelsen af fysiologiske funktioner såsom celle polarisering, overlevelse og spredning. Her præsenterer vi en 3-dimensionel vævskultur metode, hvor primær knoglemarv cells dyrkes i ekstracellulær matrix formuleret til at rekapitulere mikromiljø den menneskelige knogle (rbM system). Indlejret i den ekstracellulære matrix cellerne forsynes med næringsstoffer gennem mediet suppleret med humant plasma, hvilket giver et samlet system, hvor celleoverlevelse og proliferation kan opretholdes i op til 30 dage og samtidig opretholde den cellulære sammensætning af det primære væv. Brug af rbM systemet har vi med succes vokset primære knoglemarvsceller fra normale donorer og patienter med amyloidose, og forskellige blodkræftsygdomme. RBM-systemet giver mulighed for direkte i matrix realtid visualisering af cellernes opførsel og evaluering af prækliniske effekt af nye lægemidler. Desuden kan celler isoleres fra rbM og efterfølgende anvendes til in vivo transplantation, cellesortering, flowcytometri, og nukleinsyre og protein analyse. Tilsammen RBM metode giver et pålideligt system til væksten i primær knogle Marrow celler under fysiologiske betingelser.
Introduction
Vævskultur blev udviklet til at studere celle adfærd i et kontrolleret miljø for at minimere systemisk variation, når man sammenligner forskellige processer i intakte organismer. Denne fremgangsmåde blev først etableret i begyndelsen af 1900 1,2 og henviser til en teknik, hvor vævseksplantater dyrkedes ex vivo i en glasskål. I midten af 1900'erne blev systemet tilpasset til at vokse spredte celler snarere end fragmenter af intakte væv, og udtrykkene »vævskultur 'og' cellekultur" blev synonym 3. I sådanne konventionelle cellekultursystemer celler dyrket på overfladen af vævsdyrkningsplastik overlejret med vækstmedium suppleret med forskellige vækstfaktorer. To typer af kulturer har vist baseret på adhæsionskapacitet af forskellige celler: adhærerende cellekultur, hvor cellerne vedhæfte og spredes på vævskulturplast og adhærente kulturer, hvor celler opformeres i suspension. Siden de tidlige dage af celleer blevet skabt kultur, flere udødelige cellelinier såsom HeLa 4, første human cancer cellelinie. Disse cellelinier har kapacitet til at formere sig i det uendelige i cellekultur, og de fleste ikke kræver nogen særlig behandling for at bevare levedygtigheden.
Den reduktionistiske tilgang af de oprindelige celledyrkningsmetoder var designet til at forenkle systemet så meget som muligt ved kun at medtage de nøgne minimum komponenter, der kræves for at opretholde levedygtighed og proliferation. Men forenklede cellekultur tilgange undlader at støtte ex vivo fleste primære humane celletyper med endelig levetid. Derfor er nye dyrkningssystemer blive designet til at tilnærme vævet mikromiljø så tæt som muligt, således at celle eksplanteret til at vokse under fysiologiske betingelser. I modsætning til de konventionelle / reduktionistiske cellekultur fremgangsmåder, 3-dimensional (3-D) dyrkningssystemer er nu ved at blive en foretrukken fremgangsmåde til effektivt kultur forskelligehumane cellelinjer og primære celler til efterfølgende at undersøge mekanismer involveret i sundhed og sygdom, i forbindelse med en støttende mikromiljø. Sådanne 3-D-systemer er normalt sat op ved hjælp af rekonstruerede matricer og / eller medium suppleret med vækstfaktorer, for at rekapitulere vævet mikromiljø for at studere celletyper af interesse. Den første af disse 3-dimensional (3-D) kultur modeller blev udviklet til at studere mælkekirtlen udvikling. At give cellerne med native betingelser brystepitelceller celler blev indlejret i Matrigel, collagen IV og laminin-rig kilde af ekstracellulær matrix (ECM), og overlejret med vækstmedium. Under sådanne betingelser, brystkirtlerne epitelceller dannet klynger ligner yveret acini og efter stimulering med lactogenic hormoner disse acini udskilte kasein og andre mælkeproteiner, ind i den hule Lumena af acini-lignende strukturer. Kasein sekretion blev ikke observeret i standard kulturer, selv efter tilsætning af prolaktin 5Yderligere understreger den rolle mikromiljø bevare de morfologiske og fænotypiske egenskaber af celler. En anden demonstration af tabet af normale cellulære funktion, når cellerne er taget ud af den sammenhæng af deres fysiologiske mikromiljø er en demonstration af, at uden støttende mikromiljø, keratinocytter undlader at danne lagdelte epidermis 6. Der er oprettet en række andre 3-D modeller til at tillade ex vivo opformering af primærelementer 7,8.
Den afgørende rolle mikromiljø celle adfærd var elegant demonstreret i en undersøgelse, hvor brystepitelceller dannede "inside-out"-acini, når de dyrkes i kollagen I matrix sammenlignet med korrekt polariseret acini, der blev dannet i Matrigel. Dette tab af ordentlig morfologi blev vendt når laminin-producerende myoepitelcellerne blev føjet til collagen kulturer 9. Desuden er korrekt mikromiljø kræves til nøjagtiggenotype manifestation. Dyrkes i et fad, MCF7 brystcancerceller transficeret med en celle-celle-adhæsionsmolekyle CEACAM1 opfører sig nøjagtig de samme som de transficerede CEACAM negative celler. Men når dyrkes i Matrigel, i kontakt med ECM, vildtype MCF7 danner tumor-lignende strukturer, mens MCF7-celler transficeret med CEACAM1 vende tilbage til en normal fænotype og formular acini med hul Lumena, som er blevet etableret med nonmalignant brystepitel 10. Ligeledes blokerer β1-integrin i brystkræftceller ændrer ikke deres adfærd under standard dyrkningsbetingelser, men det samme forsøg udført i 3-D kulturer viser, at blokering af β1-integrin vender tilbage maligne celler til en normal fænotype 11. Derfor er vævet mikromiljø ikke kun nødvendig for at opretholde cellelevedygtighed, men også at opretholde korrekt cellefunktion.
Ud over at tilvejebringe et system, hvor celle adfærd kan undersøges under fysiologiske tilstands, 3-D kulturer fungerer som robust og pålidelig medium præklinisk afprøvning af nye lægemidler 8,12,13. Dyrkning af celler i 3-D giver mulighed for screening af testpræparater forbindelser under betingelserne for miljø-medieret lægemiddel-modstand 14, hvor bidraget af celle-celle og celle-ECM vedhæftning kunne vurderes. Endvidere kan off-target toksicitet af nye forbindelser undersøges ved at inkorporere flere cellulære rum i forskellige væv. Sådanne skærme kan udføres hurtigere og er mere omkostningseffektive end de sammenlignelige undersøgelser in vivo 8.
Her præsenterer vi en opsætning af en 3-D model af rekonstrueret knoglemarven (rbM), hvor den normale og maligne knoglemarv (BM)-celler prolifererer ex vivo i et system nøje efterligne mikromiljø human BM. Tidligere forsøg på voksende primære humane BM celler i 2-D kulturer, flydende eller omliggende cokulturer med forskellige komponenter af BM stromaEller 3-D, halvfaste agarkulturer har haft begrænset succes på grund af deres manglende evne til at forsyne cellerne med de komponenter væv mikromiljø 15-18. I disse systemer primære BM celler havde dårlig levedygtighed og undlod at formere sig ex vivo. Et andet system, hvor menneskerettigheder BM stamceller dyrkes i sfæroidpartikler cokulturer med BM stromalceller er en 3-D system, hvor levedygtighed og proliferation hæmatopoietisk stamcelletransplantation blev opretholdt i mindst 96 timer 19. Men selv yderst gavnlig for forståelsen af den hæmatopoietiske stamcelle biologi, at dette system ikke trofast rekapitulere mikromiljø BM på grund af fravær af ECM komponenter derfor begrænse dens anvendelighed. RBM model beskrevet her præsenterer en omfattende ordning, hvor både cellulære og ekstracellulære rum i den menneskelige BM er rekonstrueret in vitro. Vi viser, at RBM kulturer kan understøtte ex vivo væksten af normale humane BM celler, som vill som celler isoleret fra patienter med forskellige hæmatologiske lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Advance Forberedelse
- Hold sterile serologiske pipetter og pipettespidser ved 4 ° C.
Problemløsning: Matrigel geler ved stuetemperatur (RT), ved hjælp af kolde pipetter og tips vil forhindre Matrigel fra geldannende under opsætningen kultur. - Optø en flaske Matrigel ved 4 ° C natten over.
2. Fremstilling af reagenser
- Udarbejdelse af fibronectin stamopløsning: Lav en 1 mg / ml stamopløsning af fibronectin ved at opløse 100 mg humant fibronektins i 100 ml destilleret vand. Når fibronectin er opløst, sterilt filter portion, og opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder.
Fejlfinding: Hvis fibronectin ikke opløses hurtigt inkubere opløsningen i nogle få minutter i et vandbad indstillet på 37 ° C. - Fremstilling af 10x PBS: Opløs 80 g natriumchlorid NaCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2 g KCl og 2,4 g KH 2PO
- Fremstilling af neutralisering buffer 20: Foretag en opløsning indeholdende 100 mM HEPES i 2x phosphatbufret saltvand (PBS) under anvendelse af 1 M HEPES og 10x PBS stamopløsninger. Indstil pH af opløsningen til 7,0. Opbevares ved 4 ° C i 2-3 måneder.
- Fremstilling af opløsning af rotte hale collagen type 2 mg / ml I: Foretag en 2 mg / ml collagen I opløsning i neutraliseringen puffer (trin 2.3). Vortex opløsningen ved lav hastighed og bland forsigtigt ved pipettering op og ned. Da denne kollagen er meget tyktflydende, undgå dannelse af luftbobler, mens pipettering. Det anbefales at fremstille collagen I-opløsningen frisk hver gang. Opløsningen opbevares på is indtil brug.
- Fremstilling af endosteale belægning (Rend): Bland 1 mg / ml fibronectin lager med 2 mg / ml collagen I lager (trin 2.1, 2.4) til en slutkoncentration på 77 ug / ml og 29 ug / ml, 1x &# 160; steril PBS. Blandes og opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
- Udarbejdelse af rekonstrueret knoglematrix (RBM):
- Forkøling 1,5 ml mikrocentrifugerør på is. Hold alle matrix løsninger på is på alle tidspunkter.
- Bland 4 dele Matrigel (Matrigel koncentrationen varierer fra parti til parti, men de variationer, blev anset for at være ubetydelige), 2,5 dele 1 mg / ml fibronektin og 1 del af 2 mg / ml collagen I på isen ved første pipettering Matrigel ind røret ved hjælp af kolde pipettespidser og derefter tilføje fibronektin og kollagen I. Matrigel vil begynde at størkne ved temperaturer over 4 ° C, så arbejder hurtigt, mens pipettering Matrigel. Bland matricen meget forsigtigt ved pipettering op og ned, undgå at indføre bobler. Hold rørene på is, mens blande rbM.
- Udarbejdelse af knoglemarv vækstmedium (BMGM): Lav 500 ml BMGM indeholdende 6,2 x 10 -4 M CaCl2, 10 -6 M natriumsuccinat, 10 -6 M hydrocortison, 20% humant plasma (normale eller maligne indsamlet fra raske donorer eller patienter) og 1% penicillin / streptomycin i RPMI-1640. CaCl2, natriumsuccinat og hydrocortison kosttilskud kan opbevares ved -80 ° C i> 6 måneder som 1.000 x stamopløsninger. Når vokser cellelinier kan føtalt bovint serum (FBS) i stedet for humant plasma.
- Fremstilling af 10% neutral pufret formalin (NBF): Add 37% Stamoploesningen 1x PBS ved 10% v / v. Bland godt og opbevares ved stuetemperatur i 2-3 uger beskyttet mod lys.
- Fremstilling af 1% bovint serumalbumin (BSA): Der afvejes en passende mængde af BSA og opløse den i 1x PBS. Opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for 1 uge. BSA-opløsning tendens til at få forurenet, hvis de opbevares i køleskab i længere perioder. Alternativt kan BSA opløsning i aliquoter og nedfrosset ved -20 ° C til langtidsopbevaring. Undgå fryse-tø cykler.
- Udarbejdelse af celle recovery løsning (CRS): Lav 5 mM EDTA, 1 mM natriumvanadat (Na <sub> 3 VO 4) og 1,5 mM natriumfluorid (NaF) opløsning i 1x PBS. Steril filter og opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder.
3. Embedded 3-D Kultur i maligne og maligne Menneskelige BM Cells
- Renses primære BM mononukleære celler ved hjælp af Ficoll-Plaque gradientcentrifugering ifølge producentens anvisninger.
Eventuelt trin: celler kan mærkes med 0,25 uM carboxyfluorescein-diacetat, succinimidyl ester (CFSE) ifølge producentens anvisninger for at følge celleproliferation i hele dyrkningsperioden.
Fejlfinding: Hvis celler dør efter CFSE farvning titreres mængden af CFSE da koncentrationen afhænger af celletype; 0,25 uM fungerer godt for primære BM mononukleære celler. - Tilføj 65 pi Rend opløsning i hver brønd på en 48-brønds vævskulturbehandlede plade. Spred opløsningen jævnt at dække hele overfladen af brønd og inkuberes i> 30min ved stuetemperatur.
- Forbered cellesuspension ved en densitet på 0,5 x 10 6 celler i 10 pi 1x PBS per brønd af en 48-brønds plade. I en 1,5 ml mikrocentrifugerør blande cellesuspensionen med 100 ul rbM matrix per brønd. Bland cellerne og rbM matrix ved forsigtigt at pipettere op og ned, undgå at indføre bobler. Hold celle / matrix-blandingen på is for at undgå gelering af matrixen.
Bemærk: RBM systemet er fuldt skalerbar, at etablere systemet i en ikke-48-brønds format tilpasse beløbene for alle reagenser (matricer og medium) baseret på overfladearealet af pladen anvendes. Skalere antallet af celler, der skal udplades i overensstemmelse hermed. - Aspirer resterende sønderrive og tilsæt celle / matrix-blandingen ind i centrum af en brønd. Hurtigt sprede celle / matrix-blanding til at dække hele overfladen af brønden jævnt. Pladen anbringes i 30-60 minutter i 37 ° C, 5% CO 2 vævsdyrkningsinkubator tillader matrix at størkne. Undgå at ryste eller disTurb pladen under inkubation.
Fejlfinding: For at forhindre ujævn fordeling af celler i rbM, bland godt forud for plettering. Bland efter hver 5. godt belagt for at undgå celler bosætter sig til bunden af røret. Når belagt, har cellerne ikke synke til bunden af brønden på grund af overfladespændingen i matrixen.
Fejlfinding: For at forhindre ujævn fordeling af celler i rbM, bland godt forud for plettering. Bland efter hver 5. godt belagt for at undgå celler bosætter sig til bunden af røret. Når belagt, har cellerne ikke synke til bunden af brønden på grund af overfladespændingen i matrixen. - Forvarm BMGM i et vandbad indstillet til 37 ° C.
- Efter 30 minutter, skal du kontrollere, at matrixen er indstillet korrekt, og det vil danne en blød gel lag, der ikke bevæger sig, når pladen er vippet. Overlay cellen / matrix lag med 1 ml varm BMGM. For at undgå rivning af matrix pipette mediet meget forsigtigt (dispensering drop-by-slip) ved hjælp afen serologisk pipette. Placer de samlede rbM kulturen ind i en 37 ° C, 5% CO 2 vævsdyrkningsinkubator og kultur for den ønskede tidsperiode.
Bemærk: cellernes levedygtighed opretholdes i mindst 30 dage uden at ændre mediet, hvis der kræves medium forandring kun ændre 50% af de mellemstore hver gang.
Kritisk skridt: Det er afgørende, at mediet ikke er koldt som kolde temperaturer kan forstyrre et allerede indstillet matrix. Pas på ikke at sprøjte mediet på toppen af matricen på det kan bryde det bløde matrix lag.
Fejlfinding: Hvis celle levedygtighed i RBM-systemet er lav, kan celletæthed skal bestemmes eksperimentelt når man arbejder med andre end primære mononukleære celler fra BM aspirater celler. Når man arbejder med cellelinier, mindske celletallet 10-fold, som immortaliserede cellelinier prolifererer hurtigere end primære celler.
4.. 'In-matrix «Imaging
- Billede de dyrkede celler direkte i rbM hjælp lyse felt, differential interferens kontrast (DIC), konfokal eller andre billeddiagnostiske teknikker, der tillader lange afstande imaging som matrix er ca 1 mm tyk. Brug Z-stack funktionen tilgængelig på mange af de mikroskoper til billedet af hele kulturen fra top til bund.
Tip: For immunfarvning protokollen nedenfor undgå sugning farvning / vask løsninger, i stedet vippe pladen og fjerne løsninger ved hjælp af en pipette.
- Fjern BMGM ved hjælp af en pipette og vaske 2-3x med 100 ul / vask / brønd RT 1x PBS. Sørg for at der er nok PBS bruges til at dække hele overfladen af brønden.
- Lave celler i matrixen ved tilsætning af 100 ul / brønd (for en 48-brønds plade), i 10% NBF i 15 minutter ved stuetemperatur. Fjern NBF og vask cellerne to gange med 100 ul / vask / brønd af RT 1x PBS.
Bemærk: Undgå at bruge kold NBF da det kan flydende matricen. - Fjern PBS, tilsættes 1% BSA i 1 time ved stuetemperatur eller ved 4 ° C natten over for at blokere ikke-specifik binding af antistoffer.
- Forbered primære antistof opløsning i 1% BSA ved den ønskede fortynding. Fortynding vil variere for hvert antistof, skal du kontakte producenten eller titreres for at bestemme den optimale antistofkoncentration. Der tilsættes 100 gl / brønd af primært antistof-opløsning og inkuberes i henhold til producentens anvisninger.
Kritisk skridt: Alle inkuberinger involverer antistoffer konjugeret til fluoroforer eller fluorescerende farvestoffer skal udføres i mørke. - Fjern primære antistof-opløsning og vaskes 3x med 1x PBS i 5 min.
- Til indirekte immunfluorescens-farvning, inkuberes med et sekundært antistof konjugeret til fluorescerende probe i 1 time ved stuetemperatur. Fortynd antistofferne i 1% BSA ved en koncentration foreslået af producenten.
- Fjern den sekundære enntibody opløsning og vaskes 3x med 1x PBS i 5 min.
Fejlfinding: For at undgå høj baggrund under billedbehandling titreres fluorescens konjugerede sekundære antistoffer og bruge den laveste koncentration, der giver tilstrækkelig signal. Hvis høj baggrund er stadig et problem, øge antallet og varigheden af vaske trin, eller bruge direkte konjugerede primære antistoffer, og springe trin 4.2.6. - At farve kerner tilsættes 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) nuklear farvning opløsning ved fortynding foreslået af producenten, og der inkuberes i 7-10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern nuklear opløsning farvning og vask 2 gange med 1x PBS i 5 min.
- Fjern PBS fra den sidste vask, og der tilsættes en dråbe montering medium (regelmæssigeforstavelser) på prøven for at bevare fluorescens. Billedet ved hjælp af relevante indstillinger excitation / emission på en fluorescerende eller konfokal mikroskop.
Bemærk: Billedbehandling bør ske inden for 2 dage farvningat undgå nedbrydning af matrix og tab af rbM integritet og tab af fluorescerende signal. Hvis det ikke afbildet straks, skal farves prøverne opbevares ved 4 ° C, beskyttet mod lys, indtil billeddannelse.
5.. Isolering af Celler fra rbM
- Fjern medium blidt uden at forstyrre matrixlaget. Aspirér ikke.
- Vask cellerne 2x med sterilt 1x PBS. Aspirér ikke.
- Tilsæt 0,5 ml iskold CRS til hver brønd og fjerne hele matrixlaget sammen med cellerne, ved kraftig pipettering op og ned. Saml de celler, matrix og CRS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Placer på is.
- Tilføj yderligere 0,5 ml CRS til samme godt og indsamle alle resterende materiale. Overflytning til samme mikrocentrifugerør.
- Vortex blandingen af celler, matrix og CRS og inkuberes på is i 1 time. Vortex celler hver 15 minutter for at lette frigivelse fra matrixen.
- Check blandingen efter 1 time, ingen synlige klumpermatrix skal være til stede.
Fejlfinding: Hvis klumper af matrix er stadig synlige efter 1 time, overføre celler / matrix / CRS blandingen til et større rør, tilføje yderligere 2-5 ml CRS, og inkuberes i yderligere 30-60 min. - Centrifuger cellerne i CRS ved 1.000 rpm i 5-10 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml kold 1x PBS.
- Centrifuger ved 1000 rpm i 5-10 minutter, og supernatanten fjernes. Gentag vask med PBS en gang mere.
- Den anden vask med PBS fuldender genvinding af celler fra matrix og isolerede celler kan anvendes til alle efterfølgende anvendelser såsom DNA / RNA / protein-isolation, flowcytometri, in vivo-transplantation, osv..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da den primære knoglemarvsceller undlader at formere sig under standard vævskulturbetingelser blev rbM system skabt til nøje efterligner knoglen mikromiljø, at tilbyde et system til kultur og udvide BM celler in vivo. De vigtigste komponenter i BM ekstracellulære matrix, fibronektin, kollagen I, kollagen IV og laminin 21 blev indarbejdet i rbM matrix til at levere den strukturelle stillads til denne 3-D kultur. Endosteum, grænsefladen mellem knoglen og BM, rig på kollagen I og fibronectin blev rekonstrueret ved at coate overfladen af en vævskulturskål med disse proteiner. Krydstale mellem flere cellulære rum inden BM bidrager til den samlede homøostase af vævet. For at sikre, at ingen af de trådløse komponenter er udeladt, blev rbM kulturen sat op ved hjælp fraktionerede mononukleære celler fra menneskelige BM nål aspiratprøver biopsier. For at sikre, at systemet forsynes med hormoner, vækstfaktorer, end cytokiner til stede i kredsløbssygdomme miljø blev kultur medium suppleret med human plasma svarer til modellen dyrkes (dvs. plasma fra normale donorer blev tilføjet når maligne BM celler blev placeret i rbM, mens plasma fra patienter blev sat til kulturer af ondartet celler) (figur 1).
BM og blodprøver fra raske donorer og patienter med forskellige blodkræftsygdomme blev indsamlet efter godkendelse fra Purdue University og University of Alberta Institutionelle Research Boards og efter skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen (tabel 1). Mononukleære celler isoleret fra BM biopsier formere sig og bevare deres levedygtighed i rbM systemet i op til 30 dage (figur 2). Cellekoncentrationen på 0,5 x 10 6 cells/100μl af rbM matrix er blevet bestemt til at være den optimale tæthed for primære BM celler. Går ud This tæthed overcrowds systemet faldende cellernes levedygtighed og spredning over tid. En lavere massefylde har også vist sig at være til skade for den samlede hede af systemet som celle-celle-kontakter, har vist sig afgørende for en robust cellevækst. Væksten inden RBM kan følges efter mærkning af celler med carboxyfluorescein diacetat, succinimidylester (CFSE). Fluorescensintensitet CFSE halvdele hver celledeling, således celleproliferation kan spores ved mikroskopi eller flowcytometri over tid. Desuden er de cellulære rum inden RBM kultur opretholdt i samme forhold som var til stede i de biopsiprøver 8. Ud over celler af de hæmatopoietiske afstamninger, stromale rum udviser robust vækst i rbM. Alkalisk phosphatase udtrykker osteoblaster kan Mineraliserende calcium-, tartrat-resistente syrephosphatase farvnings osteoklaster, olie rød positive adipocytter og fibronectin producerende stromaceller findes på endosteum/ BM interface RBM (figur 3).
Tilsammen vores data viser, at rbM modellen giver en første ex vivo system, hvor primære humane BM celler fra raske donorer og patienter med forskellige blodkræftsygdomme såsom leukæmi, lymfekræft og myelomatose kan opretholdes og udvides i op til 30 dage. rbM giver en samlet model til at studere celle adfærd under fysiologiske betingelser i forbindelse med det native BM mikromiljø. Dette system er blevet brugt af vores laboratorium til at identificere fænotype af myelomatose kræft stamceller og til at undersøge samspillet mellem de maligne celler og BM ekstracellulære matrix samt cross-talk mellem de maligne celler og BM stroma.
| Diagnose | Celletype | Overlevelse | |
| Maligne | BM | Moderat | Moderat |
| Amyloidose | BM | Høj | Høj |
| Monoklonal gammopati af ubestemt signifikans | BM | Høj | Høj |
| PBMC | Nej | Nej | |
| Plasmacytoma | BM | Høj | Høj |
| Ulmende myelomatose | BM | Høj | Høj |
| Myelomatose | BM | Høj | Høj |
| PBMC | Nej | Nej | |
| MB | Høj | Høj | |
| Plasma-celle leukæmi | BM | Høj | Høj |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | High | Høj |
| Akut myeloid leukæmi | BM | Høj | Høj |
| Akut promyelocytisk leukæmi | BM | Høj | Høj |
| PBMC | Nej | Nej | |
| Akut lymfatisk leukæmi | BM | Moderat | Moderat |
| Kronisk myeloid leukæmi | BM | Moderat | Høj |
| Kronisk lymfatisk leukæmi | BM | Lav | Langsom |
| PBMC | Nej | Nej | |
| Non-Hodgkins lymfom | BM | Moderat | Langsom |
| PBMC | Nej | Nej |
Tabel 1. Overlevelse og spredning af forskellige prøver dyrket i rbM. Knoglemarv mononuclear celler (BM), perifere mononukleære blodceller (PBMC), eller mobiliserede blodprøver (MB) fra raske donorer og patienter diagnosticeret med forskellige maligniteter blev dyrket i rbM. Tabellen viser alle prøvetyper, der blev dyrket i rbM sammen med celletype (dvs. BM PBMC eller MB). Omfanget af celleoverlevelse og proliferation i rbM noteres. Mens BM og MB udvise robust vækst i rbM, PBMC'er isoleret fra patienter med forskellige maligne sygdomme ikke var levedygtig i rbM.
Figur 1. . Skematisk fremstilling af rbM opsætning rbM består af to faser: 1) endosteale belægning (fibronectin, collagen I (CI)) og 2) rbM matrix (fibronectin, collagen I (CI), kollagen IV (CIV) og laminin) Bemærk. : collagen IV og laminin er major komponenter i Matrigel, således ingen separat tilsætning af disse proteiner er påkrævet. Disse faser er sat op i to trin ved at lægge RBM matrix / celle blandingen på toppen af tyndt lag endosteale matrix. At følge celleproliferation over tid, kan celler mærkes med CFSE før blanding med rbM matrix. Over varigheden af kulturen kan celler synliggøres ved mikroskopi og cellemigration kan følges i realtid ved hjælp af et mikroskop udstyret med en temperatur / CO 2-kammer. Efter 14-30 dage i kultur celler kan isoleres fra matricen og udsættes for en bred vifte af downstream analyser, herunder både in vitro og in vivo procedurer. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Tidsforløb for selvstændig adskillelse af cellulære rum i rbM. BM-celler blev dyrket i rbM for det angivne antal dage. Stromale elementer bliver tydeligt ved dag 14, men kan opdages så tidligt som dag 5 i rbM. I løbet af dyrkningsperioden celler de kan ses migrerer gennem rbM matrix og aggregering i adskilte klynger. Masser af maligne celler udvider sig over tid (sammenlign klynge størrelser mellem dag 9-30). Repræsentativt indtryk af kulturen på hvert tidspunkt blev taget med lysfeltmikroskopi på et inverteret mikroskop (forstørrelse: 200X). Klik her for at se større billede.
Figur 3. Stromale rum er "leveret« i rbM. At vurdere sammensætningen af de stromale komponenter, der vokser fra i rbM blev celler ved overgangen mellem rbM matrix og endosteale belægning vurderet for fibroblast, osteoblast, fedtcellerne, og osteoclast-specifikke morfologi og markør udtryk . (a) at detektere fibroblaster blev celler farvet for fibronectin (grøn), actin (rød) og kerner (blå), og afbildes på et konfokalt mikroskop (forstørrelse: 200x). (b) Celler med stromale morfologi viste sig at være preosteoblasts med høje niveauer af alkalisk fosfatase aktivitet (b.1) og kan mineralisering calcium som bestemt af Alizarin Rød farvning (b.2). (c) Celler med en synlig tilstedeværelse af lipid dråber blev identificeret som adipocytter baseret på positiv farvning med Olie Rød (C.1). (d) Celler med lejlighedsvise flere kerner blev anerkendt som PReosteoclasts og var positive for tartarat resistente sur phosphatase (TRAP) (d.1). Bright felt og farve (fluorescerende) billeder blev erhvervet på et inverteret mikroskop udstyret med et farvekamera (forstørrelse: 200X). Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RBM model giver et omfattende system, hvor cellulære sammensætning af BM opretholdes ex vivo i op til 30 dage. BM celler dyrket i rbM selvstændige stratificere efter deres funktion nøje efterligne BM arkitektur findes in vivo. Desuden er dette det første system, der giver mulighed for udvidelsen af myelom klon multiple 8. De mest kritiske skridt til at sikre den robuste vækst i BM celler og den samlede succes af kulturen er: 1) at opnå en sund bestand af BM celler med> 70% levedygtighed og for det meste fri for røde blodlegemer, 2) at sikre, at matrixkomponenterne blandes godt, og at cellerne er ensartet fordelt i hele matrixen, og 3) at passe på ikke at beskadige matricen når vækstmedium tilsættes til systemet. For at sikre en robust proliferation af maligne celler, bør vækstmedium suppleres med humant plasma matchende diagnosticering af patient, hvis cellerne dyrkes. One begrænsning af rbM system, der blev bemærket, er dens manglende evne til at understøtte oprensede populationer af CD34 + bloddannende stamceller, CD20 + B-celler og CD138 + plasmaceller uden stromale rum i BM.
RBM system er meget alsidig og kan modificeres på mange måder bedst passer målene for specifikke undersøgelser. Endotel rum kan tilføjes til systemet for at efterligne vaskularisering af BM og yderligere ekstracellulære matrixbestanddele kan leveres til at bringe matrixsammensætningen så tæt som muligt på in vivo make-up af BM matrix koncentrationer kan justeres til afspejle de sygdomstilstande, hvor koncentrationen af individuelle matrixkomponenter kan ændres 21. Ud over at dyrke primære celler er rbM egnet til coculturing forskellige cellelinier til at studere celle-celle interaktioner mellem specifikke cellepopulationer. For eksempel kan systemet sættes op som et cokultur hvor stromal celler udplades over endosteale belægning, er hæmatopoietiske celler tilsættes oven på stromaceller, og hele stromal / hæmatopoietisk cokultur overlejres først med rbM matrix og derefter med vækstmediet. Også nyttigt, kunne være de ændringer af mediet sammensætning omfatter plasma fra forskellige kilder eller medium betinget af stroma at studere, hvordan opløselige faktorer påvirker celle adfærd 12. Cytokiner, vækstfaktorer og hormoner kan også føjes til vækstmediet bør dog være forsigtig med ikke at erstatte alle vækstmedium i kulturen på én gang som vækst bærende faktorer, som blev udskilt af cellerne i rbM kan gå tabt, og dermed , der påvirker den samlede rentabilitet af systemet. Vi foreslår at erstatte op til 50% af mediet på et tidspunkt.
RBM-systemet kan bruges til at studere både adfærd celle (dvs. proliferation, levedygtighed, migration osv.) og at vurdere styrken og off-target effekter af nye terapeutiskes 8,12. Systemet er sat op til at rekapitulere vævet mikromiljø, derfor kan effekten af testpræparater lægemidler vurderes under betingelserne for miljø-medieret lægemiddel-modstand 14. Brug live-cell realtid mikroskopi, kan celle levedygtighed i løbet af behandlingen vurderes ved levende / død farvning og påvirke af behandlingen på forskellige organeller kan evalueres ved hjælp af flere kommercielt tilgængelige organel-specifikke farvestoffer, der hurtigt ind i rbM matrix og er taget op af celler uden at generere væsentlig baggrund, der kan påvirke billeddannelse.
RBM systemet giver en meget alsidig og fleksibel model til at studere BM lidelser. Fordelen ved en sådan 3-D dyrkningsmetode forhold til standard 2-D kulturer er evnen til at studere celle adfærd i forbindelse med vævet mikromiljø sikre, at virkningerne af de multiple interaktioner ikke overses, når cellerne er isoleret fra deres fysiskgiske miljø og anbringes i en plastik skål. Appellen af RBM systemet over in vivo modeller ligger i gennemsigtighed i systemet, hvor det samspil, der ikke kan ses in vivo på grund af de begrænsninger af billeddannende teknikker kunne let dissekeres. RBM system giver et medium for let manipulation af komponenter, samtidig med at den overordnede vævssammensætning, således at forskeren at dissekere de molekylære mekanismer, der undersøges. Desuden har rbM systemet blevet valideret som en omkostningseffektiv måde, sammenlignet med in vivo-testning, at udføre prækliniske undersøgelser af nye lægemidler 8,12. Tilsammen RBM modellen giver et system, hvor mange aspekter af væv biologi kan undersøges ex vivo med primære prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award, American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53), til Purdue University Center for Cancer forskning, og den canadiske Institutes of Health Research og Alberta Cancer Board forskningsinitiativer Program. MP blev støttet af National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Praktik Program (R25CA128770, PI: D. Teegarden) administreres af Onkologiske Sciences Center og Discovery Learning Research Center ved Purdue University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
