Summary
Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.
Abstract
Weefselkweek is een waardevol instrument om de vele aspecten van de celfunctie te bestuderen, van de normale ontwikkeling van de ziekte van. Conventionele celcultuur methoden berusten op het vermogen van cellen hetzij te hechten aan een vast substraat van een weefselkweek schaal of groeien in suspensie in een vloeibaar medium. Meerdere onsterfelijke cellijnen zijn gemaakt en geteeld met behulp van dergelijke benaderingen, echter, deze methoden vaak mislukken als primaire cellen moeten worden gekweekt ex vivo. Deze mislukking is toegeschreven aan de afwezigheid van de geschikte extracellulaire matrixcomponenten van het weefsel micro van de standaard systemen waar weefselkweek kunststof wordt gebruikt als een oppervlak voor celgroei. Extracellulaire matrix is een integraal onderdeel van het weefsel micro en zijn aanwezigheid is cruciaal voor het handhaven van de fysiologische functies zoals mobiele polarisatie, overleving en proliferatie. Hier presenteren wij een 3-dimensionale weefselkweek methode waarbij primaire beenmerg cells worden gekweekt in extracellulaire matrix geformuleerd om de micro-omgeving van het menselijk bot (RGB-systeem) recapituleren. Ingebed in de extracellulaire matrix worden cellen voorzien van voedingsstoffen door het medium aangevuld met humaan plasma, waardoor een uitgebreid systeem waarbij celoverleving en proliferatie kan worden voortgezet tot 30 dagen terwijl de cellulaire samenstelling van de primaire weefsel. Met behulp van het RGB-systeem hebben we met succes gegroeid primaire beenmergcellen van normale donoren en patiënten met amyloïdose, en diverse hematologische maligniteiten. De RGB-systeem zorgt voor directe, in-matrix real time visualisatie van de cel gedrag en de evaluatie van preklinische werkzaamheid van nieuwe therapieën. Bovendien kunnen cellen worden geïsoleerd uit de rBM vervolgens gebruikt voor in vivo transplantatie, celsortering, stroomcytometrie en nucleïnezuur en eiwitanalyse. Samen genomen, de rBM methode biedt een betrouwbaar systeem voor de groei van de primaire bot Marrow cellen onder fysiologische omstandigheden.
Introduction
Weefselkweek ontwikkeld om celgedrag studeren in een gecontroleerde omgeving om de systemische variabiliteit te minimaliseren bij het vergelijken van verschillende processen in intacte organismen. Deze methode werd voor het eerst opgericht in de vroege jaren 1900 1,2 en verwijst naar een techniek waarbij weefselexplantaten werden gekweekt ex vivo in een glazen schaal. In het midden van de jaren 1900 werd het systeem aangepast aan verspreide cellen in plaats van fragmenten van intacte weefsels groeien, en de begrippen 'weefselkweek' en 'celcultuur' werd synoniem 3. In dergelijke conventionele celculturen cellen worden gekweekt op het oppervlak van de weefselkweek plastic bedekt met groeimedium aangevuld met verschillende groeifactoren. Twee soorten culturen ontstaan op basis van de hechting aantal verschillende cellen: hechtende celkweek, waarbij cellen hechten en verspreiden van de weefselkweek plastic en hechtende culturen, waarbij cellen worden gekweekt in suspensie. Sinds de vroege dagen van de celcultuur, meerdere onsterfelijke cellijnen zijn gemaakt, zoals HeLa 4, de eerste menselijke kanker cellijn. Deze cellijnen hebben het vermogen om oneindig prolifereren in celkweek en de meeste hebben geen speciale behandeling nodig levensvatbaarheid behouden.
De reductionistische benadering van de oorspronkelijke celcultuurmethoden ontworpen om het systeem zo veel mogelijk door alleen het absolute minimum onderdelen om levensvatbaarheid en celproliferatie ondersteunen vereenvoudigen. Echter, vereenvoudigde celkweek benaderingen niet ex vivo meest primaire menselijke celtypes met eindige levensduur te ondersteunen. Daarom zijn nieuwe kweeksystemen ontworpen om het weefsel micro zo dicht mogelijk benaderen, waardoor cel explantaten groeien onder fysiologische omstandigheden. In tegenstelling tot de conventionele / reductionistische celkweek benaderingen, 3-dimensionale (3-D) kweeksystemen worden nu een voorkeurswerkwijze efficiënt cultuur verschillendehumane cellijnen en primaire cellen vervolgens bestuderen mechanismen betrokken bij gezondheid en ziekte, in het kader van een ondersteunende micromilieu. Dergelijke 3-D systemen worden meestal opgezet met gereconstrueerde matrices en / of medium aangevuld met groeifactoren, teneinde het weefsel micro herhalen om celtypen plaats bestuderen. De eerste van deze 3-dimensionale (3-D) cultuurmodellen ontwikkeld borstklier ontwikkeling bestuderen. Om de cellen te voorzien van natuurlijke omstandigheden mamma-epitheliale cellen werden ingebed in Matrigel, collageen IV en laminine-rijke bron van extracellulaire matrix (ECM), en bedekt met groeimedium. Onder dergelijke omstandigheden, de mammaire epitheelcellen vormden clusters lijkt op de borstklier acini en na stimulatie met lactogenic hormonen, die acini afgescheiden caseïne en andere melk proteïnen, in de holle lumina van de acini structuren. Caseïne secretie werd niet waargenomen in standaard kweken zelfs na toevoeging van prolactine 5Verder met de nadruk op het behoud van het micro morfologische en fenotypische eigenschappen van cellen. Een andere demonstratie van het verlies van de normale cellulaire functie wanneer de cellen worden uit de context van hun fysiologische micro-omgeving is een demonstratie die zonder ondersteunende micromilieu, keratinocyten niet gelaagde epidermis 6 vormen. Een aantal andere 3-D-modellen zijn gemaakt om ex vivo vermeerdering van primaire cellen 7,8 toestaan.
De cruciale rol van micromilieu in celgedrag is elegant aangetoond in een studie waarbij mammaire epitheelcellen vormden "binnenstebuiten" acini indien gekweekt in collageen matrix, in vergelijking met de juiste gepolariseerde acini dat Matrigel werden gevormd. Dit verlies van goede morfologie werd teruggezet wanneer laminine-producerende myo cellen werden toegevoegd aan de culturen collageen I 9. Bovendien is juist micromilieu vereist nauwkeurigegenotype manifestatie. Gekweekt in een schotel, MCF7-borstkankercellen getransfecteerd met een cel-cel adhesie molecuul CEACAM1 zich precies hetzelfde als de getransfecteerde CEACAM negatieve cellen. Echter, indien gekweekt in Matrigel, in contact met ECM, wildtype MCF7 vorm tumor-achtige structuren, terwijl MCF7 cellen die met CEACAM1 terugkeren naar een normaal fenotype en vorm acini met holle Lumena, zoals is vastgesteld met nonmalignant mamma-epitheel 10. Ook blokkeert β1-integrine in borstkankercellen ofwel hun gedrag veranderen onder standaard kweekomstandigheden, maar hetzelfde experiment uitgevoerd in 3-D culturen blijkt dat het blokkeren β1-integrine keert maligne cellen een normaal fenotype 11. Daarom wordt weefsel micro niet alleen nodig om cellevensvatbaarheid te behouden, maar ook om goede celfunctie behouden.
Naast het verschaffen van een systeem waarbij celgedrag onder fysiologische omstandigheden kan worden bestudeerds, 3-D culturen functioneren als robuust en betrouwbaar medium voor preklinische testen van nieuwe therapieën 8,12,13. Kweken van cellen in 3-D laat screenen van onderzoekssamenstellingen onder de voorwaarden van milieutechnische gemedieerde resistentie 14, waarin de bijdrage van cel-cel en cel-ECM-adhesie kon worden beoordeeld. Bovendien kan off-target toxiciteit van nieuwe verbindingen worden vastgesteld door de combinatie van meerdere cellulaire compartimenten van verschillende weefsels. Dergelijke schermen kunnen sneller worden uitgevoerd en zijn meer kosten-effectiever dan de vergelijkbare studies in vivo 8.
Hier presenteren we een opstelling van een 3-D model van gereconstrueerde beenmerg (rBM) waarin normale en kwaadaardige beenmerg (BM) cellen prolifereren ex vivo in een systeem nauw nabootsen het micromilieu van de menselijke BM. Vorige pogingen groeiende primaire humane BM cellen in 2-D culturen vloeibare of aanhangende hulpkweken met verschillende onderdelen van BM stromaOf 3-D, halfvast agar culturen hebben beperkt succes gehad als gevolg van hun onvermogen om de cellen te voorzien van de bestanddelen van weefsel micro 15-18. In deze systemen hadden primaire BM cellen slechte levensvatbaarheid en mislukte ex vivo te woekeren. Een ander systeem waarbij humane BM progenitorcellen worden gekweekt in bolvormige hulpkweken met BM stromale cellen een 3-D systeem waarbij levensvatbaarheid en proliferatie van hematopoietische stamcellen werd gehandhaafd gedurende ten minste 96 uur 19. Hoewel zeer gunstig voor het begrip van de hematopoïetische voorlopercellen biologie, dit systeem niet getrouw recapituleren het micromilieu van de BM door het ontbreken van ECM componenten, dus het nut beperken. De RBM model hier beschreven vormt een samenhangend systeem waar zowel cellulaire en extracellulaire compartimenten van het menselijk BM worden gereconstrueerd in vitro. We zien dat rBM culturen ex vivo groei van normale humane BM cellen ondersteunen, zoals well als cellen geïsoleerd uit patiënten met verschillende hematologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Advance Voorbereiding
- Houd steriele serologische pipetten en pipet tips bij 4 ° C.
Problemen oplossen: Matrigel gels bij kamertemperatuur (RT), het gebruik van koude pipetten en tips zal voorkomen Matrigel van geleiachtige tijdens de cultuur setup. - Ontdooi een fles Matrigel bij 4 ° C gedurende de nacht.
2. Bereiding van reagentia
- Voorbereiding van fibronectine voorraad oplossing: Maak een 1 mg / ml voorraad oplossing van fibronectine door het oplossen van 100 mg menselijk fibronectine in 100 ml gedestilleerd water. Zodra de fibronectine is opgelost, steriel filter, aliquot en bewaar bij 4 ° C tot 6 maanden.
Problemen oplossen: Als fibronectine niet snel oplost incubeer de oplossing voor een paar minuten in een waterbad van 37 ° C. - Bereiding van 10x PBS: Los 80 g natriumchloride NaCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2 g KCl en 2,4 g KH 2PO
- Bereiding van neutralisatie buffer 20: Voeg een oplossing die 100 mM HEPES 2x in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 M HEPES en 10x PBS voorraadoplossingen. Stel de pH van de oplossing 7,0. Bewaren bij 4 ° C gedurende 2-3 maanden.
- Bereiding van 2 mg / ml oplossing van rattenstaart collageen type I: Voeg een 2 mg / ml collageen I oplossing in de neutralisatie buffer (stap 2.3). Geschud oplossing bij lage snelheid en meng voorzichtig door en neer te pipetteren. Aangezien dit collageen is zeer visceuze, vermijd generatie van luchtbellen tijdens het pipetteren. Het wordt aanbevolen om collageen I oplossing vers bereiden elke keer. Bewaar de oplossing op ijs tot gebruik.
- Bereiding van endosteal coating (scheuren): Meng 1 mg / ml fibronectine leverbaar met 2 mg / ml collageen I voorraad (stappen 2.1 en 2.4) tot een uiteindelijke concentratie van 77 ug / ml en 29 ug / ml, in 1x &# 160; steriele PBS. Meng en bewaar bij 4 ° C gedurende 1 maand.
- Voorbereiding van de gereconstrueerde bot matrix (RBM):
- Precool 1,5 ml microcentrifugebuizen op ijs. Houd alle matrix-oplossingen op het ijs te allen tijde.
- Meng 4 delen Matrigel (Matrigel concentratie varieert van veel-naar-veel, maar de variaties zijn te verwaarlozen), 2,5 delen van 1 mg / ml fibronectine en 1 deel 2 mg / ml collageen I op ijs door eerst pipetteren Matrigel in de buis met koud pipetpunten en voeg fibronectine en collageen I Matrigel begint stollen bij temperaturen boven 4 ° C, zo snel werken terwijl pipetteren Matrigel. Meng de matrix heel voorzichtig door en neer te pipetteren, voorkomen dat er bubbels. Houd de buizen op het ijs tijdens het mengen de RBM.
- Voorbereiding van het beenmerg groeimedium (BMGM): Maak 500 ml BMGM met 6,2 x 10 -4 M CaCl2, 10 -6 M natriumsuccinaat, 10 -6 M hydrocortison, 20% menselijk plasma (normale of kwaadaardige verzameld van gezonde donoren of patiënten), en 1% penicilline / streptomycine in RPMI-1640. CaCl2, natriumsuccinaat, hydrocortison en supplementen kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende> 6 maanden 1000 x voorraadoplossingen. Bij groeiende cellijnen kan foetaal runderserum (FBS) gelezen humaan plasma.
- Bereiding van 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) Voeg 37% formaldehyde voorraadoplossing 1x PBS bij 10% v / v. Meng goed en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 2-3 weken beschermd tegen licht.
- Bereiding van 1% runderserumalbumine (BSA): Weeg geschikte hoeveelheid BSA en oplossen in 1x PBS. Bewaar bij 4 ° C en binnen 1 week. BSA-oplossing neiging om besmet indien gekoeld voor een langere periode bewaard. Alternatief kan BSA oplossing in hoeveelheden verdeeld en bij -20 ° C ingevroren voor langdurige opslag. Vermijd vries-dooi cycli.
- Voorbereiding van de cel recovery-oplossing (CRS): Maak 5 mM EDTA, 1 mM natriumvanadaat (Na <sub> 3 VO 4) en 1,5 mM natriumfluoride (NaF) oplossing in 1x PBS. Filtreer steriel en bewaar bij 4 ° C tot 6 maanden.
3. Embedded 3-D Cultuur van nonmalignant en Maligne Human BM cellen
- Zuiver primaire BM mononucleaire cellen door Ficoll-Plaque gradiëntcentrifugering instructies van de fabrikant.
Optionele stap: cellen met 0,25 uM carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester (CFSE) instructies van de fabrikant celproliferatie gedurende de kweekperiode volgt gelabeld.
Problemen oplossen: Als cellen sterven na CFSE kleuring, titreer de hoeveelheid CFSE als de concentratie is afhankelijk van celtype; 0,25 uM werkt goed voor primaire BM mononucleaire cellen. - Voeg 65 ul van Rend oplossing in elk putje van een 48-well weefselkweek behandeld plaat. Verdeel de oplossing gelijkmatig op het gehele oppervlak van het putje bedekken en incubeer> 30minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid de celsuspensie bij een dichtheid van 0,5 x 10 6 cellen in 10 ul van 1 x PBS per putje van een 48-wells plaat. In een 1,5 ml microcentrifugebuis meng de celsuspensie met 100 pl per putje rBM matrix. Meng de cellen en RBM matrix door zachtjes en neer te pipetteren; voorkomen dat er bubbels. Bewaar de cel / matrix mengsel op ijs geleren van de matrix voorkomen.
Opmerking: het RGB-systeem is volledig schaalbaar, het opzetten van het systeem in een niet-48-well formaat, pas de hoeveelheden van alle reagentia (matrices en middelgrote) gebaseerd op de oppervlakte van de plaat gebruikt. Schaal het aantal cellen dienovereenkomstig worden uitgeplaat. - Zuig de resterende verscheuren en voeg de cel / matrix mengsel in het midden van een goed. Snel, verspreiden de cellen / matrix mengsel het gehele oppervlak van het putje gelijkmatig bedekken. Plaats de plaat gedurende 30-60 min bij 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator om de matrix te stollen. Niet schudden of disturb de plaat tijdens de incubatie.
Problemen oplossen: Om ongelijke verdeling van de cellen te voorkomen in RBM, goed mengen voorafgaand aan plating. Meng na iedere 5e goed vergulde cellen regelen de bodem van de buis te voorkomen. Eenmaal geplateerd, worden cellen niet zinken naar de bodem van de put als gevolg van spanningen oppervlak in de matrix.
Problemen oplossen: Om ongelijke verdeling van de cellen te voorkomen in RBM, goed mengen voorafgaand aan plating. Meng na iedere 5e goed vergulde cellen regelen de bodem van de buis te voorkomen. Eenmaal geplateerd, worden cellen niet zinken naar de bodem van de put als gevolg van spanningen oppervlak in de matrix. - Voorverwarmen BMGM in een waterbad tot 37 ° C.
- Na 30 min, controleren om te zien dat de matrix correct is ingesteld, het zal een zachte gel-achtige laag die niet beweegt wanneer de plaat wordt gekanteld vormen. Overlay de cel / matrix laag met 1 ml warm BMGM. Om scheuren van de matrix pipet middellange vermijden zachtjes (afgeven drop-by-drop) meteen serologische pipet. Plaats de gemonteerde rBM cultuur in een 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator en cultuur voor de gewenste periode.
Opmerking: cellevensvatbaarheid gedurende ten minste 30 dagen zonder dat medium, als mediumverversing is alleen vereist telkens veranderen 50% drager.
Kritische stap: Het is cruciaal dat het medium niet koud als koude temperatuur de reeds matrix zou verstoren. Verzorgen het medium niet te spuiten op de top van de matrix bij het de zachte matrix laag zou kunnen breken.
Problemen oplossen: Als levensvatbaarheid van de cellen in het RGB-systeem laag is, kan celdichtheid moeten experimenteel worden bepaald bij het werken met andere dan primaire mononucleaire cellen uit BM aspiraten cellen. Bij het werken met cellijnen, verminderen het aantal cellen 10-voudige, als onsterfelijk cellijnen vermenigvuldigen sneller dan primaire cellen.
4. 'In-matrix' Imaging
- Afbeelding de gekweekte cellen direct rBM met helderveld, differentieel interferentie contrast (DIC), confocale of andere beeldvormingstechnieken die lange afstand beeldvorming mogelijk te maken wanneer de matrix ongeveer 1 mm dik. Gebruik de Z-stack functie die beschikbaar is op veel van de microscopen om het imago van de hele cultuur van boven naar beneden.
Tip: Voor de immunobeeld protocol hieronder vermijden opzuigen kleuring / wassen oplossingen, in plaats tilt de plaat en oplossingen te verwijderen met behulp van een pipet.
- Verwijder de BMGM met een pipet en was 2-3x met 100 ul / was / putje RT 1x PBS. Zorg ervoor dat er voldoende PBS wordt gebruikt om het gehele oppervlak van het putdeksel.
- Fix cellen matrix door toevoeging van 100 ul / putje (voor een 48-well plaat) van 10% NBF gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder NBF en was cellen tweemaal met 100 ul / was / well RT 1x PBS.
Noot: Vermijd het gebruik van koud NBF als het kan de matrix kan vloeibaar. - Verwijder PBS, voeg 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende de nacht om te blokkeren specifieke binding van antilichamen.
- Bereid primaire antilichaam oplossing in 1% BSA op de gewenste verdunning. Verwatering zal variëren voor elk antilichaam, contact op met de fabrikant of titreren om de optimale concentratie antilichamen te bepalen. Voeg 100 ul / putje primair antilichaam oplossing en incubeer volgens de instructies van de fabrikant.
Kritische stap: Alle incubaties waarbij antilichamen geconjugeerd aan fluoroforen of fluorescente kleurstoffen moeten worden uitgevoerd in het donker. - Verwijder primaire antilichaam oplossing en was 3x met 1x PBS gedurende 5 minuten.
- Voor indirecte immunofluorescentie kleuring, incuberen met een secundair antilichaam geconjugeerd aan fluorescente probe gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun de antilichamen in 1% BSA in een concentratie gesuggereerd door de fabrikant.
- Verwijder de secundaire eenntibody oplossing en was 3x met 1x PBS gedurende 5 minuten.
Problemen oplossen: Om een hoge achtergrond te vermijden tijdens de beeldvorming, titreer de fluorescent geconjugeerde secundaire antilichamen en gebruik de laagste concentratie die voldoende signaal. Indien hoge achtergrond is nog steeds een probleem, het aantal en de duur van wasstappen, of gebruik direct geconjugeerd primaire antilichamen, en sla stap 4.2.6. - Om vlekken de kernen commentaar 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring van kernen oplossing na verdunning gesuggereerd door de fabrikant, en incubeer gedurende 7-10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder kleuroplossing nucleaire en was 2x met 1x PBS gedurende 5 minuten.
- Verwijder de PBS uit de laatste wasbeurt en voeg een druppel montage medium (reguliere set), op het monster om fluorescentie te behouden. Beeld met behulp van geschikte excitatie / emissie instellingen op een fluorescerende of confocale microscoop.
Opmerking: Imaging moet worden gedaan binnen 2 dagen na kleuringeen achteruitgang van de matrix en het verlies van rBM integriteit en verlies van fluorescent signaal te voorkomen. Als onmiddellijk afgebeeld moet gekleurd monsters bij 4 ° C bewaard, beschermd tegen licht, tot beeldvorming.
5. Isolatie van Cellen van rBM
- Verwijder medium voorzichtig zonder de matrix laag. Niet aspireren.
- Was cellen 2x met steriele 1x PBS. Niet aspireren.
- Voeg 0,5 ml ijskoude CRS aan elk putje en compleet verwijderen matrixlaag met de cellen, door krachtig en neer te pipetteren. Verzamel de cellen matrix en CRS in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Plaats op ijs.
- Voeg een extra 0,5 ml CRS aan dezelfde put en verzamel alle overgebleven materiaal. Transfer naar dezelfde microcentrifugebuis.
- Vortex het mengsel van cellen, matrix, en CRS en incubeer op ijs gedurende 1 uur. Vortex cellen elke 15 minuten naar bevrijding uit de matrix te vergemakkelijken.
- Controleer het mengsel na 1 uur, geen zichtbare klontenvan de matrix aanwezig zijn.
Problemen oplossen: wanneer er klontjes of matrix zijn nog zichtbaar na 1 uur, overdracht cellen / matrix / CRS mengsel in een grotere buis, voeg extra 2-5 ml van CRS, en incubeer een extra 30-60 minuten. - Centrifugeer cellen bij CRS 1000 rpm gedurende 5-10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml koud 1x PBS.
- Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5-10 minuten en verwijder het supernatant. Herhaal de PBS wassen nog een keer.
- De tweede PBS wassing maakt de terugwinning van cellen van matrix en geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor verdere toepassingen zoals DNA / RNA / eiwit isolatie, flowcytometrie, in vivo transplantatie, enz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sinds primaire beenmergcellen niet woekeren onder standaard weefselkweek omstandigheden werd het RGB-systeem gemaakt om het bot micro-omgeving na te bootsen, het verstrekken van een systeem om de cultuur en uitbreiden BM cellen ex vivo. De belangrijkste componenten van de BM extracellulaire matrix, fibronectine, collageen I, collageen IV, laminine en 21, zijn opgenomen in rBM matrix om de structurele steiger daartoe voorzien in 3-D cultuur. Endosteum, het raakvlak tussen het bot en de BM, rijk aan collageen I en fibronectine, werd gereconstrueerd door het bekleden van het oppervlak van een weefselkweekschaal met deze eiwitten. Interactie tussen verschillende cellulaire compartimenten binnen de BM bijdraagt aan de algehele homeostase van het weefsel. Om ervoor te zorgen dat geen van de cellulaire componenten worden weggelaten, werd de rBM cultuur opgezet met behulp van niet-gefractioneerde mononucleaire cellen van het menselijk BM naaldaspiraat biopten. Om het systeem beschikt hormonen, groeifactoren, eend cytokinen aanwezig in de bloedsomloop, bleef het kweekmedium aangevuld met humaan plasma volgens het model worden gekweekt (bijvoorbeeld plasma van gezonde donoren werd toegevoegd wanneer nonmalignant BM cellen rBM geplaatst, terwijl plasma van patiënten werd toegevoegd aan de culturen van maligne cellen) (Figuur 1).
BM en bloedmonsters van gezonde donoren en patiënten met verschillende hematologische maligniteiten werden verzameld na goedkeuring van de Purdue University en de Universiteit van Alberta Institutioneel Onderzoek Boards en na schriftelijke geïnformeerde toestemming, in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki (tabel 1). Mononucleaire cellen die zijn geïsoleerd van BM biopsieën prolifereren en hun levensvatbaarheid RGB-systeem tot 30 dagen (figuur 2) te handhaven. De celconcentratie van 0,5 x 10 6 cells/100μl van rBM matrix is vastgesteld dat de optimale dichtheid voor primaire BM cellen. Verder gaan dan this dichtheid overcrowds het systeem afnemende levensvatbaarheid van de cellen en proliferatie tarieven in de tijd. Een lagere dichtheid is ook aangetoond schadelijk voor de algemene heide van het systeem als cel-cel contacten essentieel gebleken voor een sterke celgroei. Groei binnen het RBM kan na het labelen cellen met carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester (CFSE) worden gevolgd. Fluorescentie-intensiteit van CFSE helften met elke celdeling, waardoor celproliferatie kan worden gevolgd door microscopie of flowcytometrie tijd. Bovendien is de cellulaire compartimenten binnen de rBM cultuur gehandhaafd in dezelfde verhoudingen als in de biopsiemonsters 8 waren. Naast de cellen van het hematopoëtische lijnen, stromale compartimenten vertonen sterke groei rBM. Alkalische fosfatase uitdrukken osteoblasten staat mineralisatie calcium, tartraat resistente zure fosfatase kleuring osteoclasten, olie rood positief adipocyten, en fibronectine produceren stromale cellen zijn te vinden op de endosteum/ BM-interface van het RGB-systeem (figuur 3).
Samengevat tonen onze gegevens aan dat de rBM model een eerste ex vivo systeem waarbij primaire humane BM-cellen van gezonde donoren en patiënten met verschillende hematologische tumoren zoals leukemie, lymfoom en multiple myeloom kan worden voortgezet en uitgebreid tot 30 dagen. RBM biedt een uitgebreide model naar cel gedrag te bestuderen onder fysiologische omstandigheden in het kader van de inheemse BM micro-omgeving. Dit systeem is gebruikt door ons laboratorium om het fenotype van de veelvoudige myeloma kanker stamcellen te identificeren en om de interacties tussen de kwaadaardige cellen en de extracellulaire matrix BM en de overspraak tussen de kwaadaardige cellen en de BM stroma bestuderen.
| Diagnose | Celtype | Survival | |
| Nonmalignant | BM | Matig | Matig |
| Amyloïdose | BM | Hoog | Hoog |
| Monoklonale gammopathie van onbepaalde betekenis | BM | Hoog | Hoog |
| PBMC | Geen | Geen | |
| Plasmacytoom | BM | Hoog | Hoog |
| Smeulend multipel myeloom | BM | Hoog | Hoog |
| Multipel myeloom | BM | Hoog | Hoog |
| PBMC | Geen | Geen | |
| MB | Hoog | Hoog | |
| Plasma-cel leukemie | BM | Hoog | Hoog |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | High | Hoog |
| Acute myeloïde leukemie | BM | Hoog | Hoog |
| APL | BM | Hoog | Hoog |
| PBMC | Geen | Geen | |
| Acute lymfatische leukemie | BM | Matig | Matig |
| Chronische myeloïde leukemie | BM | Matig | Hoog |
| Chronische lymfatische leukemie | BM | Laag | Langzaam |
| PBMC | Geen | Geen | |
| Non-Hodgkin lymfoom | BM | Matig | Langzaam |
| PBMC | Geen | Geen |
Tabel 1. Overleving en verspreiding van verscheidene exemplaren gekweekt in rBM. Beenmerg mononuclear cellen (BM), perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC), of gemobiliseerd bloedmonsters (MB) van gezonde donoren en patiënten met verscheidene maligniteiten werden gekweekt in rBM. In de tabel staan alle specimen types die gekweekt waren in rBM samen met het celtype (dat wil zeggen BM, PBMC of MB). De mate van celoverleving en proliferatie in rBM worden genoteerd. Terwijl BM en MB vertonen robuuste groei in RBM, PBMC geïsoleerd van patiënten met verschillende maligniteiten waren niet levensvatbaar in RBM.
Figuur 1. . Schematische weergave van rBM setup rBM bestaat uit twee fasen: 1) de endosteale coating (fibronectine, collageen I (CI)) en 2) rBM matrix (fibronectine, collageen I (CI), collageen IV (CIV) en laminine) Opmerking. : collageen IV en laminine zijn de mBELANGRIJKSTE componenten van Matrigel, waardoor geen afzonderlijke toevoeging van deze eiwitten vereist. Deze fasen worden ingesteld in twee stappen door het bedekken rBM matrix / celmengsel bovenop het dunne laagje endosteal matrix. Om celproliferatie tijd volgen cellen worden met CFSE vóór het mengen met de rBM matrix geëtiketteerd. Over de duur van de kweek, kunnen cellen worden gevisualiseerd door microscopie en celmigratie te volgen in real time via een microscoop met een temperatuur / CO 2-geregelde kamer. Na 14-30 dagen in kweek cellen kunnen worden geïsoleerd uit de matrix en onderworpen aan een verscheidenheid van stroomafwaartse analyses, zowel in vitro als in vivo procedures. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Tijdsverloop van zelf-segregatie van cellulaire compartimenten rBM. BM-cellen werden gekweekt in rBM voor het aangegeven aantal dagen. Stromale elementen duidelijk geworden op dag 14, maar kan al op dag 5 in rBM worden gedetecteerd. Gedurende de kweekperiode cellen zichtbaar doortrekken rBM matrix en aggregeren in verschillende clusters. Massa van kwaadaardige cellen uit te breiden in de tijd (vergelijk clustergrootten tussen dag 9-30). Representatief beeld van de cultuur op elk tijdstip is vastgelegd met helder veld microscopie op een omgekeerde microscoop (vergroting: 200X). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Stromale compartimenten worden 'geleverd' in de RBM. Voor de samenstelling van de stromale componenten die ontgroeien in rBM evalueren, werden de cellen bij de overgang tussen RBM matrix en endostale coating geëvalueerd voor fibroblasten, osteoblasten, adipocyten, en osteoclasten specifieke morfologie en markerexpressie . (a) fibroblasten detecteren, werden cellen gekleurd voor fibronectine (groen), actine (rood) en kernen (blauw) en afgebeeld op een confocale microscoop (vergroting: 200X). (b) cellen met stromale morfologie vertoonden een preosteoblasts met hoge niveaus van alkalische fosfatase (b.1) en geschikt mineraliserende calcium bepaald door Alizarinerood kleuring (b.2). (c) Cellen met een zichtbare aanwezigheid van lipide druppeltjes werden geïdentificeerd als adipocyten op positief kleuring met olie Rood (c.1). (d) Cellen met af en toe meerdere kernen werden erkend als preosteoclasts en waren positief voor tartaraat resistente zure fosfatase (TRAP) (D.1). Helderveld en kleur (niet-fluorescerende) beelden werden verkregen op een omgekeerde microscoop uitgerust met een kleurencamera (vergroting: 200X). Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De RBM-model biedt een uitgebreid systeem waar de cellulaire samenstelling van de BM wordt gehandhaafd ex vivo voor maximaal 30 dagen. BM cellen gekweekt in rBM zelf stratify basis van hun functie nauwkeurig nabootsen van de BM architectuur in vivo. Bovendien is dit het eerste systeem dat zorgt voor de expansie van de veelvoudige myeloma kloon 8. De meest kritische stappen voor het waarborgen van de krachtige groei van BM cellen en het succes van de cultuur zijn: 1) een gezonde populatie van de BM cellen met> 70% levensvatbaarheid en meestal vrij van rode bloedcellen te verkrijgen, 2), zodat de matrix componenten worden goed gemengd en de cellen gelijkmatig in de matrix, en 3) zorgen de matrix niet beschadigt wanneer groeimedium wordt toegevoegd aan het systeem. De sterke proliferatie van kwaadaardige cellen waarborgen, moet groeimedium aangevuld met humane plasma overeenkomen met de diagnose van de patiënt waarvan de cellen worden gekweekt. One beperking van het RGB-systeem dat werd opgemerkt is het onvermogen om gezuiverde populaties van CD34 + hematopoietische stamcellen, CD20 + B-cellen, en CD138 + plasmacellen ondersteunen zonder de stromale compartiment van de BM.
Het RGB-systeem is zeer veelzijdig en kan op vele manieren het beste past bij de doelstellingen van specifieke studies worden gewijzigd. Endotheel kunnen worden toegevoegd aan het systeem om de vascularisatie van het BM en aanvullende extracellulaire matrixcomponenten kunnen worden toegevoerd aan de matrix samenstelling zo dicht mogelijk bij de in vivo samenstelling van de BM en de matrix concentraties brengen nabootsen kunnen worden aangepast weerspiegelen de ziektetoestanden waar de concentraties van afzonderlijke matrixcomponenten kunnen worden gewijzigd 21. Naast primaire kweken van cellen rBM is geschikt voor coculturing verschillende cellijnen om cel-cel interacties tussen specifieke celpopulaties te bestuderen. Bijvoorbeeld, kan het systeem worden opgezet als een co-cultuur waar stromal cellen worden uitgeplaat via endosteal coating worden hematopoietische cellen toegevoegd bovenop de stromale cellen en het gehele stromale / hematopoëtische coculture eerst de rBM matrix en daarna bedekt met het groeimedium. Ook nuttig, zou kunnen zijn de wijzigingen van de samenstelling van het medium aan plasma uit verschillende bronnen of medium geconditioneerd door stroma te bestuderen hoe oplosbare factoren van invloed op het gedrag van cellen 12 omvatten. Cytokinen, groeifactoren en hormonen kunnen ook worden toegevoegd aan het groeimedium echter voorzichtigheid geboden alle groeimedium niet vervangen in de kweek tegelijkertijd de groei onderhoudende factoren die zijn uitgescheiden door de cellen in rBM verloren, waardoor , waardoor de totale levensvatbaarheid van het systeem. Wij stellen terugplaatsing 50% van het medium tegelijk.
De RGB-systeem kan worden gebruikt om zowel celgedrag (bijvoorbeeld proliferatie, levensvatbaarheid, migratie, enz.) bestuderen en de potentie off-target effecten van nieuwe therapeutische beoordelen ens 8,12. Het systeem is opgezet om het weefsel micro recapituleren, dus kan de werkzaamheid van geneesmiddelen voor onderzoek worden geëvalueerd onder de voorwaarden van milieu-gemedieerde resistentie 14. Het gebruik van levende cellen realtime microscopie, kan cel levensvatbaarheid in de loop van de behandeling worden beoordeeld door levende / dode kleuring en het effect van behandeling op verschillende organellen kan worden geëvalueerd met verschillende commercieel verkrijgbare organel-specifieke kleurstoffen die gemakkelijk doordringen in de matrix en rBM worden uitgenomen door de cellen zonder genereert aanzienlijke achtergrond die van invloed kunnen beeldvorming.
De RGB-systeem zorgt voor een zeer veelzijdig en aanpasbaar model om BM aandoeningen te bestuderen. Het voordeel van deze 3-D kweekmethode ten opzichte van de standaard 2-D culturen in het vermogen om cel gedrag te bestuderen in het kader van het weefsel micro waarborgen dat de effecten van de meervoudige interacties niet missen wanneer cellen worden geïsoleerd uit hun fysiekegische omgeving en in een plastic schaaltje. De aantrekkingskracht van het RGB-systeem via in vivo modellen ligt in de doorzichtigheid van het systeem waarbij de interacties die niet kan worden gezien in vivo door de beperkingen van beeldvormende technieken gemakkelijk worden ontleed. De RGB-systeem zorgt voor een medium voor eenvoudige manipulatie van componenten met behoud van de totale samenstelling weefsel, waardoor de onderzoeker de moleculaire mechanismen te onderzoeken ontleden. Bovendien heeft het RGB-systeem gevalideerd als een kosteneffectieve manier, vergeleken met in vivo testen, om preklinische studies van nieuwe therapieën 8,12 voeren. Samen genomen, de RBM-model biedt een systeem waarbij veel aspecten van weefselbiologie kunnen worden onderzocht ex vivo gebruik van primaire monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award, de American Cancer Society Institutioneel Onderzoek Subsidie (IRG # 58-006-53), aan de Purdue University Center for Cancer onderzoek, en de Canadese Institutes of Health Research en de Alberta Cancer Board Research Initiatives Program. MP werd gesteund door de National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Internship Program (R25CA128770; PI: D. Teegarden) door de Oncologische Sciences Center en de Discovery Learning Research Center aan de Purdue University toegediend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S. Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
