Summary
בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.
Abstract
תרבית רקמה הייתה כלי רב ערך כדי ללמוד על היבטים רבים של תפקוד תא, מהתפתחות נורמלית למחלה. שיטות תרבות תאים רגילות להסתמך על היכולת של תאים או לצרף לתשתית מוצקה של צלחת תרבית רקמה או לגדול בתרחיף במדיום נוזלי. נוצרו שורות תאים אלמותיים מרובות וגדלו תוך שימוש בגישות אלה, עם זאת, שיטות אלה לעתים קרובות להיכשל כאשר תאים ראשוניים צריכים להיות מבוגרים vivo לשעבר. כישלון כזה יוחס להעדרם של רכיבי מטריצה תאיים המתאימים של microenvironment הרקמה מהמערכות סטנדרטיות שבו פלסטיק תרבית רקמה משמש כמשטח לצמיחת תאים. מטריצה תאית היא מרכיב בלתי נפרד של microenvironment הרקמות ונוכחותה היא חיונית לשמירה על תפקודים פיסיולוגיים כגון קיטוב תא, הישרדות, ושגשוגם. כאן אנו מציגים שיטת תרבית רקמה 3 ממדים שבו cel מוח עצם העיקריls גדלים במטריצה תאית גובשה כדי לשחזר את microenvironment של עצמות אדם (מערכת RBM). משובץ במטריצה תאית, תאים מסופקים עם חומרים מזינים דרך המדיום בתוספת פלזמה אנושית, ובכך לספק מערכת מקיפה שבו הישרדות תא ושגשוגם יכולים להתקיים לעד 30 ימים תוך שמירה על ההרכב התאי של הרקמות ראשוניות. שימוש במערכת RBM יש לנו גדלו בהצלחה תאי מח העצם עיקריים מתורמים רגילים וחולים עם עמילואידוזיס, ומחלות דם ממאירות שונות. מערכת RBM מאפשרת הדמיה ישירה, במטריצה בזמן אמת של התנהגות התא וההערכה של יעילות קליני של תרופות חדשות. יתר על כן, ניתן לבודד תאים מRBM ולאחר מכן נעשה שימוש להשתלת in vivo, מיון תא, cytometry זרימה, וחומצות גרעין וניתוח חלבון. יחדיו, שיטת RBM מספקת מערכת אמינה לצמיחה של Marro עצם העיקריתאי w בתנאים פיסיולוגיים.
Introduction
תרבית רקמה פותחה כדי ללמוד על התנהגות תא בסביבה מבוקרת כדי למזער את ההשתנות המערכתית כאשר משווה תהליכים שונים באורגניזמים שלמים. שיטה זו הוקמה לראשונה ב 1900 1,2 המוקדם ומתייחסת לטכניקה שבה explants היה בתרבית הרקמה vivo לשעבר בצלחת זכוכית. באמצע שנתי ה 1900s-המערכת הותאמה לגדל תאים מפוזרים ולא שברי רקמות שלמות, ו'תרבית הרקמה 'התנאים ו'תרבית תאים' הפכו לשם נרדף 3. במערכות תרבית תאים קונבנציונליות כגון תאים גדלים על פני השטח של הפלסטיק בתרבית רקמה ועליהן מדיום גידול בתוספת גורמי גדילה שונים. שני סוגים של תרבויות צמחו מבוססים על יכולת ההדבקה של תאים שונים: תרבית תאים חסיד, שבו תאים לצרף ולהפיץ על הפלסטיק בתרבית רקמה ותרבויות nonadherent, שבו תאים מופצים בהשעיה. מאז הימים הראשונים של תאנוצרו תרבות, שורות תאים אלמותיים מרובות, כגון 4 הלה, שורת תאי סרטן האנושיים הראשונה. יש שורות תאים אלה את היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן בתרבית תאים, ורוב אינו דורשים כל טיפול מיוחד כדי לשמור על יכולת קיום.
הגישה הרדוקציוניסטית של שיטות תרבית תאים המקורית שנועדה לפשט את המערכת ככל האפשר על ידי כולל רק את רכיבי המינימום הנדרשים כדי לקיים את כדאיות תא ושגשוגם. עם זאת, גישות פשוטות תרבית תאים לא מצליחות לתמוך vivo לשעבר סוגים העיקריים ביותר תא אנושיים עם תוחלת חיים מוגבלת. לכן, מערכות התרבות חדשות שתוכננו משוערת microenvironment הרקמות, ככל שניתן, ובכך מאפשרות explants התא לגדול בתנאים פיסיולוגיים. בניגוד ל/ גישות קונבנציונליות הרדוקציוניסטית תרבית תאים, 3 ממדים (3-D) מערכות תרבות נמצאות כעת הופכות שיטה מועדפת ליעילות תרבות שונותשורות תאים אנושיות ותאים ראשוניים ללמוד לאחר מכן מנגנונים מעורבים במחלה ובריאות, בהקשר של microenvironment תומך. מערכות 3-D כאלה הן בדרך כלל הגדרה באמצעות מטריצות משוחזרות ו / או בינוני בתוספת גורמי גדילה, על מנת לשחזר את microenvironment הרקמות ללמוד סוגי תא של עניין. הראשון של דגמי תרבות 3 ממדים (3-D) אלה פותח כדי ללמוד התפתחות בלוטת החלב. כדי לספק את התאים עם תנאים מקומיים תאי אפיתל החלב היו משובצים בMatrigel, קולגן IV ומקור laminin עשיר של מטריצה תאית (ECM), ועליהן מדיום גידול. בתנאים אלה, תאי אפיתל החלב נוצרו אשכולות דומים acini החלב, ועל גירוי עם הורמוני lactogenic, acini אלה מופרשים קזאין, וחלבונים חלב אחרים, לlumena החלול של המבנים דמוי acini. הפרשת קזאין לא נצפתה בתרבויות סטנדרטיות גם לאחר תוספת של פרולקטין 5, תוך שימת דגש על תפקידו של המיקרו בשמירה על המאפיינים מורפולוגיים ופנוטיפי של תאים נוספים. הפגנה נוספת של אובדן התפקוד תאי נורמלי כאשר תאי לקוחים מתוך ההקשר של microenvironment הפיזיולוגי שלהם היא הפגנה שללא microenvironment תומך, קרטינוציטים להיכשל כדי ליצור האפידרמיס מרובדת 6. מספר 3-D מודלים אחרים נוצר כדי לאפשר ריבוי vivo לשעבר של תאים ראשוניים 7,8.
התפקיד המכריע של microenvironment בהתנהגות תא הודגם אלגנטיות במחקר שבו תאי אפיתל החלב נוצרו acini "מבפנים החוצה" כאשר בתרבית בקולגן אני מטריקס, בהשוואה לacini המקוטב בצורה הנכונה שנוצרו בMatrigel. הפסד זה של מורפולוגיה התקינה היה חזר כאשר תאי myoepithelial ייצור laminin נוספו לקולגן I תרבויות 9. יתר על כן, microenvironment הנכון דרוש למדויקביטוי גנוטיפ. גדל בצלחת, תאי סרטן שד MCF7 transfected עם CEACAM1 מולקולת הידבקות תאי תאים מתנהגים בדיוק כמו התאים השליליים CEACAM untransfected. עם זאת, כאשר בתרבית בMatrigel, במגע עם ECM, מבנים כמו גידול בצורת MCF7 wildtype תוך MCF7 תאי transfected עם CEACAM1 לחזור לacini פנוטיפ והצורה נורמלי עם lumena החלול, כפי שכבר נקבעו באפיתל החלב nonmalignant 10. בדומה לכך, חסימה בתאי סרטן שד integrin-β1 אינו משנה את התנהגותם בתנאי תרבות סטנדרטיות, אבל על אותו הניסוי שבוצע בתרבויות 3-D מוכיח כי חסימת β1-integrin חוזרת תאים ממאירים לפנוטיפ נורמלי 11. לכן, microenvironment רקמות אינו נדרש רק כדי לשמור על כדאיות תא, אלא גם כדי לשמור על תפקוד תא תקין.
בנוסף לאספקת מערכת שבה התנהגות תא ניתן ללמוד בתנאים פיסיולוגייםים, תרבויות 3-D לתפקד מדיום חזק ואמין כמו לבדיקה קליני של הרפוי רומן 8,12,13. Culturing תאים ב 3-D מאפשר הקרנה של תרכובות investigational בתנאים של בתיווך סביבת סמים התנגדות 14, שבו התרומה של תאי תאים והידבקות התא-ECM יכולה להיות מוערכת. יתר על כן, רעילות מחוץ היעד של תרכובות חדשות ניתן לקביעה על ידי שילוב של תאים סלולריים שונים של רקמות שונות. ניתן לבצע מסכים כאלה במהירות רבה יותר ויותר יעיל וחסכוני יותר מהמחקרים דומים בvivo 8.
כאן אנו מציגים התקנה של 3-D מודל של מח עצם משוחזר (RBM) שבו תאי מח עצם נורמלי וממאירים (BM) להתרבות vivo לשעבר במערכת מחקה את microenvironment של BM האדם באופן הדוק. ניסיונות קודמים בגידול תאי BM אנושי ראשוניים בתרבויות 2-D, נוזל או cocultures חסיד עם רכיבים שונים של stroma BM, או 3-D, תרבויות אגר חצי מוצק נפגשו עם הצלחה מוגבלת בשל חוסר היכולת שלהם לספק את התאים עם הרכיבים של microenvironment הרקמה 15-18. במערכות אלה היו תאי BM עיקריים כדאיות עניות ולא הצליחו להתרבות vivo לשעבר. מערכת נוספת שבו תאי BM אדם גדלים בcocultures אליפטית עם תאי סטרומה BM היא מערכת 3-D בו כדאיות תא גזע hematopoietic ושגשוגם נשמרו במשך לפחות 96 שעה 19. עם זאת, למרות שמאוד מועיל להבנת הביולוגיה אבות היווצרות הדם, מערכת זו אינה נאמנות לשחזר את microenvironment של BM בשל היעדר רכיבי ECM, ולכן, מה שמגביל את השימושיות שלה. דגם RBM המתואר כאן מציג מערכת מקיפה שבו שני התאים סלולריים ותאיים של BM האדם משוחזרים במבחנה. אנו מראים כי תרבויות RBM יכולות לתמוך בצמיחת vivo לשעבר של תאים אנושיים BM רגילים, כפי שאנוll כמו תאים מבודדים מחולים עם הפרעות המטולוגיות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה מראש
- שמור טפטפות סרולוגיות סטרילי וטיפים פיפטה ב 4 ° C.
פתרון בעיות: ג'לי Matrigel בטמפרטורת חדר (RT); באמצעות טפטפות וטיפים קרים ימנע Matrigel מgelling במהלך הגדרת התרבות. - להפשיר בקבוק Matrigel על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה.
2. הכנת ריאגנטים
- הכנת פתרון מניות פיברונקטין: הפוך 1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של פיברונקטין על ידי המסת פיברונקטין אדם 100 מ"ג במים מזוקקים 100 מיליליטר. ברגע שפיברונקטין נמס, פילטר סטרילי, aliquot, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
פתרון בעיות: אם פיברונקטין אינו מתמוסס במהירות דגירה הפתרון לכמה דקות בסט אמבט מים ב 37 ° C. - הכנה של 10x PBS: ממיסים 80 כלורי NaCl נתרן גרם, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, KCl 2 גרם ו2.4 KH גרם 2 PO
- הכנה של חיץ נטרול 20: להפוך את תמיסה המכילה 100 HEPES מ"מ מלוחים 2x פוספט (PBS) באמצעות 1 M HEPES ו10x פתרונות מניות PBS. התאם את ה-pH של הפתרון ל7.0. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים.
- הכנת 2 פתרון מ"ג / מיליליטר של קולגן סוג זנב החולדה אני: הפוך 2 מ"ג / מיליליטר פתרון אני קולגן במאגר הנטרול (שלב 2.3). מערבולת הפתרון במהירות נמוכה ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. קולגן זה צמיג מאוד, להימנע מדור של בועות אוויר תוך pipetting. מומלץ להכין לי פתרון קולגן טרי בכל פעם. שמור את הפתרון על קרח עד לשימוש.
- הכנת ציפוי endosteal (לקרוע): מערבבים 1 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין המניה עם 2 מ"ג / מיליליטר קולגן אני המניה (שלבים 2.1 ו2.4) לריכוז סופי של 77 מיקרוגרם / מיליליטר ו29 מיקרוגרם / מ"ל בהתאמה, ב1x &# 160; PBS סטרילית. לערבב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1.
- הכנת העצם מטריקס המשוחזר (RBM):
- 1.5 Precool מיליליטר microcentrifuge צינורות על קרח. שמור את כל פתרונות המטריצה על קרח בכל העת.
- מערבבים 4 חלקים Matrigel (ריכוז Matrigel משתנה מהרבה להרבה, אבל הווריאציות נמצאו להיות זניח), 2.5 חלקים של 1 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין וחלק 1 של 2 מ"ג / מיליליטר קולגן אני על קרח על ידי pipetting הראשון Matrigel לתוך הצינור באמצעות טיפים פיפטה קרים ולאחר מכן להוסיף פיברונקטין ואני קולגן Matrigel יתחיל חיזוק בטמפרטורות מעל 4 מעלות צלזיוס, כך שעובד במהירות תוך pipetting Matrigel. מערבבים את המטריצה מאוד בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, למנוע החדרת בועות. שמור צינורות על קרח תוך כדי ערבוב RBM.
- הכנה של מדיום מח עצם צמיחה (BMGM): הפוך 500 מיליליטר של BMGM מכיל 6.2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 succinate נתרן -6 M, 10 -6 הידרוקורטיזון M, 20% פלזמה אנושית (ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין רגילים או ממאיר שנאסף מתורמים או מטופלים בריאים), בRPMI-1640. ניתן לאחסן CaCl 2, succinate נתרן, ותוספי הידרוקורטיזון ב-80 מעלות צלזיוס למשך> 6 חודשים כפתרונות מניות x 1,000. כאשר גידול שורות תאים, בסרום שור העובר (FBS) ניתן להחליף לפלזמה אנושית.
- הכנת פורמלין 10% הניטרלי שנאגרו (NBF): הוסף 37% מניות פתרון פורמלדהיד ל1X PBS ב10% v / נ מערבבים היטב ולאחסן בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שבועות המוגנים מפני אור.
- אופן ההכנה של 1% אלבומין בסרום שור (BSA): לשקול כמות מתאימה של ארגון ה-BSA ולפזר אותו ב1x PBS. חנות ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבוע 1. פתרון BSA נוטה לקבל מזוהם אם שמר בקירור לתקופות ארוכות יותר. לחלופין, פתרון BSA ניתן aliquoted והוקפא ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים.
- הכנת פתרון התאוששות תא (CRS): הפוך 5 מ"מ EDTA, vanadate נתרן 1 מ"מ (Na <פלואוריד הנתרן תת> 3 VO 4) ו1.5 מ"מ (פתרון NAF) ב 1x PBS. סינון סטרילי ולאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים.
3. תרבות 3-D גלום של תאי BM האדם nonmalignant ומאירה
- לטהר את התאים מונונוקלארים BM ראשוניים על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll-הרובד לפי הוראות יצרן.
שלב אופציונאלי: יכולים להיות מתויגים תאים עם diacetate 0.25 מיקרומטר carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר (CFSE) לפי הוראות יצרן לעקוב התפשטות תאים לאורך כל תקופת התרבות.
פתרון בעיות: אם תאים מתים לאחר צביעת CFSE, לכיל את כמות CFSE כריכוז תלוי בסוג התא; 0.25 מיקרומטר עובד היטב עבור תאים מונונוקלארים BM עיקריים. - הוספת 65 μl של פתרון קורע לבאר כל צלחת תרבות טופלה רקמות 48 היטב. מורחים את הפתרון באופן שווה על מנת לכסות את כל פני השטח של היטב דגירה ל> 30דקות ב RT.
- הכן את ההשעיה התא בצפיפות של 0.5 x 10 6 תאים ב10 μl של 1x PBS לכל גם צלחת 48 היטב. בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר לערבב את ההשעיה התא עם מטריצה של RBM 100 μl לכל טוב. מערבבים את התאים ומטריקס RBM ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה; למנוע החדרת בועות. שמור את תערובת תא / מטריצה על קרח, כדי למנוע gelling של מטריקס.
הערה: מערכת RBM היא להרחבה מלאה; להגדיר את המערכת בפורמט שאינם 48 היטב, להתאים את הכמויות של כל חומרים כימיים (מטריצות ובינוניות) המבוסס על פני השטח של הצלחת בשימוש. קנה מידה של מספר התאים להיות מצופה בהתאם. - לשאוב לקרוע שנותר ומוסיף את תערובת תא / מטריצה למרכז גם. במהירות, מורח את תערובת תא / מטריצה על מנת לכסות את כל פני השטח של היטב באופן שווה. מניחים את הצלחת ל30-60 דקות ב37 מעלות צלזיוס, 5% תרבות חממת CO 2 רקמה כדי לאפשר את המטריצה כדי לחזק. אין לנער או דיסturb הצלחת במהלך דגירה.
פתרון בעיות: כדי למנוע חלוקה לא שווה של תאים בRBM, ומערבב היטב לפני ציפוי. מערבבים אחרי כל 5 גם ה מצופים להימנע מתאי שיקוע לחלק התחתון של הצינור. מצופים ברגע, תאים לא ישקעו לתחתית הבאר בשל שטח מתח במטריצה.
פתרון בעיות: כדי למנוע חלוקה לא שווה של תאים בRBM, ומערבב היטב לפני ציפוי. מערבבים אחרי כל 5 גם ה מצופים להימנע מתאי שיקוע לחלק התחתון של הצינור. מצופים ברגע, תאים לא ישקעו לתחתית הבאר בשל שטח מתח במטריצה. - Prewarm BMGM באמבט מים מוגדר 37 ° C.
- לאחר 30 דקות, בדוק שהמטריצה יש להגדיר כראוי; זה יהיה בצורת ג'ל רך כמו שכבה שאינו זז בעת הצלחת מוטה. Overlay שכבת תאים / מטריצה עם 1 מיליליטר של BMGM החם. כדי להימנע מקריעה של פיפטה מטריקס הבינוני מאוד בעדינות (מחלק טיפה אחר טיפה) באמצעותפיפטה סרולוגיות. הנח את תרבות RBM התאסף לתוך ° C 37, 5% חממת CO 2 רקמת תרבות ותרבות לתקופה הזמן הרצויה.
הערה: כדאיות תא נשמר לפחות 30 ימים ללא שינוי בינוני, ואם נדרש שינוי בינוני רק לשנות 50% מבינוניים בכל פעם.
שלב קריטי: זה חיוני כי המדיום הוא לא קר כמו טמפרטורה קרה עלולה להפריע מטריקס כבר נקבע. יש להיזהר שלא להשפריץ בינוני על גבי המטריצה בזה עלול לשבור את שכבת המטריצה הרכה.
פתרון בעיות: אם כדאיות תא במערכת RBM היא נמוכות, צפיפות תאים תצטרך להיקבע באופן ניסיוני בעבודה עם תאים אחרים מאשר תאים חד גרעיניים עיקריים מaspirates BM. כאשר עובד עם שורות תאים, להקטין את המספר הסלולרי של פי 10, כמו שורות תאים הונצחו מתרבות מהר יותר מאשר תאים ראשוניים.
4. הדמיה "במטריצה"
- תמונת התאים בתרבית באופן ישיר בRBM באמצעות שדה בהיר, התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), confocal או כל טכניקות הדמיה אחרות המאפשרות הדמיה למרחקים ארוכים כמטריצה היא כ 1 מ"מ עובי. השתמש בתכונת Z-המחסנית נגיש בהרבה של המיקרוסקופים לתמונה כל התרבות מלמעלה עד למטה.
טיפ: לקבלת פרוטוקול immunostaining מתחת להימנע aspirating פתרונות מכתים / כביסה, במקום להטות את הצלחת ולהסיר את הפתרונות באמצעות פיפטה.
- הסר את BMGM באמצעות פיפטה ולשטוף 2-3x עם 100 μl / לשטוף / היטב RT 1x PBS. ודא כי מספיק PBS משמש כדי לכסות את כל פני השטח של הבאר.
- תקן את התאים במטריצה על ידי הוספת 100 μl / טוב (לצלחת 48 היטב) של 10% NBF 15 דקות ב RT. הסר NBF ולשטוף תאים פעמיים עם 100 μl / לשטוף / היטב RT 1x PBS.
פתק: הימנע משימוש בNBF הקרה כפי שהוא עשוי נזל המטריצה. - הסר PBS, להוסיף BSA 1% עבור שעה 1 ב RT או 4 ° C למשך הלילה כדי לחסום ספציפי מחייב של נוגדנים.
- הכן את פתרון נוגדן ראשוני בBSA 1% בדילול הנדרש. דילול ישתנה עבור כל נוגדן, בדוק עם היצרן או לכיל כדי לקבוע את ריכוז נוגדנים האופטימלי. הוספה 100 μl / טוב של פתרון נוגדן ראשוני ודגירה על פי הוראות היצרן.
שלב קריטי: יש לבצע כל incubations מעורב נוגדנים מצומדות כדי fluorophores או צבעי ניאון בחושך. - הסר פתרון נוגדן ראשוני ולשטוף 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות.
- עבור מכתים immunofluorescence עקיף, דגירה עם נוגדנים משני מצומדת לבדיקת ניאון עבור שעה 1 ב RT. לדלל את הנוגדנים בBSA 1% בריכוז שהוצע על ידי היצרן.
- הסר את המשניפתרון ntibody ולשטוף 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות.
פתרון בעיות: כדי להימנע מרקע גבוה במהלך הדמיה, לכיל נוגדנים משני מצומדות fluorescently ולהשתמש בריכוז הנמוך ביותר המספק אות מספקת. אם רקע גבוה הוא עדיין בעיה, להגדיל את המספר ומשך צעדים לשטוף, או להשתמש בנוגדנים ראשוניים מצומדת באופן ישיר, ולדלג על שלב 4.2.6. - כדי להכתים את הגרעינים להוסיף 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון מכתים גרעיני, בדילול שהוצע על ידי היצרן, ודגירה של 7-10 דקות ב RT.
- הסר פתרון מכתים גרעיני ולשטוף 2x עם 1x PBS במשך 5 דקות.
- הסר את PBS מהשטיפה האחרונה ולהוסיף טיפה של מדיום הרכבה (סט קבוע), על המדגם לשמר הקרינה. תמונה באמצעות הגדרות עירור / פליטה מתאימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal.
שים לב: הדמיה צריכה להיעשות בתוך 2 ימים של מכתיםכדי להימנע משפלה של מטריצה ואובדן שלמות RBM ואובדן אות ניאון. אם לא צילמו באופן מיידי, יש לשמור דגימות מוכתמות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עד הדמיה.
5. בידוד של תאים מRBM
- הסר בינוני בעדינות מבלי להפריע את שכבת מטריקס. לא לשאוב.
- שטפו תאי 2X עם סטרילי 1X PBS. לא לשאוב.
- הוסף 0.5 מיליליטר של CRS קר כקרח היטב כל אחד ולהסיר את כל שכבת מטריקס יחד עם התאים, על ידי במרץ pipetting למעלה ולמטה. לאסוף את התאים, מטריקס, וCRS בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. מניחים על קרח.
- הוספת 0.5 מיליליטר CRS נוסף לאותו היטב ולאסוף את כל חומרים שנותרו. העבר לאותו הצינור microcentrifuge.
- מערבולת התערובת של תאים, מטריקס, וCRS ולדגור על קרח למשך 1 שעות. תאי ורטקס כל 15 דקות כדי להקל על שחרור מהמטריצה.
- בדוק את התערובת לאחר 1 שעות, ללא גושים נראים לעיןשל מטריצה צריך להיות נוכח.
פתרון בעיות: אם גושים של מטריצה הם עדיין גלויים לאחר 1 שעות, תאי העברה / מטריצה / תערובת CRS לצינור גדול יותר, תוסיף 2-5 מיליליטר נוסף של CRS, ודגירה של 30-60 דקות נוספות. - צנטריפוגה תאים בCRS ב1,000 סל"ד 5-10 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של 1x PBS הקר.
- צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד 5-10 דקות ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף PBS עוד פעם אחת.
- לשטוף PBS השני משלים את ההחלמה של תאים ממטריצה ותאים מבודדים יכולה לשמש לכל יישומים במורד כגון בידוד DNA / RNA / חלבון, cytometry זרימה, in vivo השתלה, וכו '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכיוון שתאי מח עצם העיקרי אינם מצליחים להתרבות בתנאי תרבית רקמה רגילים, מערכת RBM נוצרה כדי לחקות באופן הדוק microenvironment העצם, מתן מערכת לתרבות ולהרחיב את תאי BM vivo לשעבר. המרכיבים העיקריים של מטריצת BM תאית, פיברונקטין, קולגן I, קולגן IV, וlaminin 21, שולבו מטריצת RBM לספק הפיגום המבני לתרבות 3-D. Endosteum, הממשק בין העצם וBM, עשיר בקולגן ופיברונקטין אני, שוחזר על ידי ציפוי פני השטח של צלחת תרבית רקמה עם חלבונים אלה. דיבור בין תאים סלולריים המרובים בתוך BM תורם להומאוסטזיס הכולל של הרקמה. כדי להבטיח שאף אחד מהמרכיבים התאיים נותרים בחוץ, תרבות RBM הוקמה באמצעות תאים מונונוקלארים unfractionated מביופסיות מחט לשאוב האנושיות BM. כדי להבטיח שהמערכת מסופקת עם הורמונים, גורמי גדילה,ציטוקינים ד נוכחים בסביבת מחזור הדם, התרבות בינונית שהשלימו עם פלזמה אנושית מתאימה לדגימה שתרבית (כלומר פלזמה מתורמים רגילים נוספה כאשר תאי BM nonmalignant הונחו בRBM, ואילו בפלזמה של חולים נוספת לתרבויות של ממאיר תאים) (איור 1).
בע"מ ודגימות דם של תורמים בריאים וחולים עם מחלות דם ממאירות שונות נאספו לאחר אישור מאוניברסיטת Purdue ואוניברסיטת אלברטה לוחות מחקר מוסדי ולאחר כתב הסכמה מדעת בהתאם להצהרת הלסינקי (הטבלה 1). תאי mononuclear מבודדים מביופסיות BM להתרבות ולשמור על יכולת הקיום במערכת RBM לתקופה של עד 30 ימים (איור 2). ריכוז התא של 0.5 x 10 6 cells/100μl של מטריקס RBM נקבע להיות הצפיפות האופטימלית לתאי BM עיקריים. הולך מעבר thiצפיפות של overcrowds המערכת יורדת כדאיות תא ושיעורי תפוצה לאורך זמן. צפיפות נמוכה יותר גם הוכח להיות מזיק להית הכוללת של המערכת כאנשי קשר תאי תאים הוכיחו חיוניים לצמיחת תאים חזקה. צמיחה בתוך RBM יכולה להיות אחרי אחרי תיוג תאים עם diacetate carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר (CFSE). עוצמת הקרינה של CFSE חצי עם כל חלוקת תא, ובכך התפשטות תאים יכולה להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ או cytometry זרימה לאורך זמן. יתר על כן, התאים הסלולריים בתוך תרבות RBM נשמרים בשיעורים הדומים לשיעור נכחו בדגימות הביופסיה 8. בנוסף לתאים של שושלות דם, תאי סטרומה להפגין צמיחה איתנה בRBM. phosphatase אלקליין להביע osteoblasts מסוגל סידן mineralizing, osteoclasts מכתים phosphatase חומצה עמיד tartrate, adipocytes החיובית האדומה הנפט, ופיברונקטין ייצור תאי סטרומה נמצאים בendosteum/ ממשק BM של מערכת RBM (איור 3).
יחדיו, הנתונים שלנו מראים כי מודל RBM מספק מערכת vivo לשעבר ראשונה שבו תאי BM אנושיים ראשוניים מתורמים וחולים עם מחלות דם ממאירות שונות, כגון לוקמיה, לימפומה, מיאלומה נפוצה ובריאים יכולים להתקיים והתרחבו עד 30 ימים. RBM מספק מודל מקיף כדי ללמוד על התנהגות תא בתנאים פיסיולוגיים בהקשר של microenvironment BM הילידים. מערכת זו נוצלה בעבר על ידי המעבדה שלנו לזהות את הפנוטיפ של תאי הגזע סרטני מיאלומה נפוצה וללמוד את יחסי הגומלין בין התאים הממאירים והמטריצה תאית BM כמו גם דיבורים הצולבים בין התאים הממאירים וstroma BM.
| אבחון | סוג התא | הישרדות | |
| Nonmalignant | BM | מתון | מתון |
| עמילואידוזיס | BM | גבוה | גבוה |
| gammopathy חד שבטי בעלי משמעות לא ברורה | BM | גבוה | גבוה |
| PBMC | לא | לא | |
| Plasmacytoma | BM | גבוה | גבוה |
| עשנים מיאלומה נפוצה | BM | גבוה | גבוה |
| מיאלומה נפוצה | BM | גבוה | גבוה |
| PBMC | לא | לא | |
| MB | גבוה | גבוה | |
| לוקמיה של תאי פלזמה | BM | גבוה | גבוה |
| macroglobulenemia Waldenstroms | BM | גדולותשעות | גבוה |
| לוקמיה מיאלואידית אקוטית | BM | גבוה | גבוה |
| לוקמיה פרומיילוציטית | BM | גבוה | גבוה |
| PBMC | לא | לא | |
| לוקמיה לימפוציטית חריפה | BM | מתון | מתון |
| לוקמיה מיאלואידית כרונית | BM | מתון | גבוה |
| לוקמיה לימפוציטית כרונית | BM | נמוך | לאט |
| PBMC | לא | לא | |
| לימפומה שאינו הודג'קין | BM | מתון | לאט |
| PBMC | לא | לא |
טבלת 1. הישרדותם ושגשוגם של דגימות שונות בתרבית RBM. מ 'מח עצםononuclear תאים (BM), תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMC), או דוגמאות מגויסות דם (MB) מתורמים בריאים וחולים שאובחנו עם ממאירות שונות היו בתרבית בRBM. הטבלה מפרטת את כל סוגי הדגימה שהיו בתרבית בRBM יחד עם סוג התא (כלומר BM, PBMC, או MB). הישרדות תא ושגשוגם בRBM המידה הם ציינו. בעוד בע"מ וMB להפגין צמיחה איתנה בRBM, PBMCs מבודדת מחולים עם ממאירויות שונות לא היתה בר קיימא בRBM.
איור 1. . ייצוג סכמטי של התקנת RBM RBM מורכב משני שלבים: 1) ציפוי endosteal (פיברונקטין, קולגן אני (CI)) ו -2) מטריצת RBM (פיברונקטין, קולגן אני (CI), קולגן IV (CIV) וlaminin) הערה. : IV קולגן וlaminin הם מ 'רכיבי ajor של Matrigel, ובכך ללא תוספת נפרדת של חלבונים אלה נדרשים. שלבים אלה מוגדרים בשני שלבים על ידי כיסה את המטריצה / תערובת תא RBM על גבי הציפוי הדק של מטריקס endosteal. לעקוב תא התפשטות לאורך זמן, יכולים להיות מתויגים תאים עם CFSE לפני ערבוב עם מטריצת RBM. על משך הזמן של התרבות, יכולים להיות דמיינו תאים על ידי מיקרוסקופ ונדידת תאים ניתן בעקבות בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ מצויד בטמפרטורת חדר 2 / CO מבוקר. לאחר יכולים להיות מבודדים 14-30 ימים בתאי תרבות מהמטריצה וחשוף למגוון רחב של ניתוחים במורד הזרם, ובם הן במבחנה ובנהלי vivo. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. כמובן זמן של הפרדה עצמית של תאים סלולריים בRBM. תאי BM גדלו בRBM למספר מצויינים של ימים. אלמנטי סטרומה להיות ברורים ביום 14, אך יכולים להתגלות כבר ביום 5 בRBM. במהלך תקופת תרבות התאים ניתן לראות נודד דרך מטריצת RBM וצבירה לאשכולות שונים. המוני תאים ממאירים להרחיב לאורך זמן (להשוות גדלי אשכול בין היום 9-30). צפה בנציג של התרבות בכל נקודת זמן שנתפס באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר על מיקרוסקופ הפוכה (הגדלה: 200X). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. תאי סטרומה הם 'סיפקו' בתוך RBM. כדי להעריך את ההרכב של רכיבי סטרומה שמתגברים בRBM, תאים במעבר בין מטריצת RBM וציפוי endosteal הוערכו על מורפולוגיה פיברובלסטים, osteoblast, adipocyte, וosteoclast ספציפי וביטוי סמן . (א) כדי לזהות fibroblasts, תאים היו מוכתמים לפיברונקטין (ירוק), אקטין (אדום), וגרעינים (כחול) וצלם על מיקרוסקופ confocal (הגדלה: 200X). (ב) תאים עם מורפולוגיה סטרומה הוצגו להיות preosteoblasts עם רמות גבוהות של פעילות אלקליין phosphatase (.1) ומסוגלים mineralizing סידן כפי שנקבע על ידי צביעת אליזרין האדום (ב .2). (ג) תאים עם נוכחות בולטת של טיפות שומנים, אשר זוהו כadipocytes מבוססת על צביעה חיובית עם שמן אדום (ג 1). (ד) תאים עם גרעינים מרובים מדי פעם הוכרו כיחסי ציבורeosteoclasts והיו חיוביים לphosphatase חומצה עמיד tartarate (TRAP) (ד .1). שדה וצבע בהירים תמונות (nonfluorescent) נרכשו על מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במצלמת צבע (הגדלה: 200X). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דגם RBM מספק מערכת מקיפה שבו הרכב תאי של BM נשמר vivo לשעבר לתקופה של עד 30 ימים. תאי BM גדלו בRBM עצמי רבד פי הפונקציה שלהם מחקה את ארכיטקטורת BM מצאה in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, זוהי המערכת הראשונה המאפשרת להרחבת שיבוט מיאלומה הנפוצה 8. השלבים הקריטיים ביותר להבטחת הצמיחה החזקה של תאים בע"מ וההצלחה הכוללת של התרבות הם: 1) כדי לקבל אוכלוסייה בריאה של תאי BM עם כדאיות> 70% ובעיקר חופשי של תאי דם אדומים, 2) כדי להבטיח כי רכיבי המטריצה מעורבבים היטב וכי התאים מפוזרים באופן אחיד לאורך כל המטריצה, ו3) לדאוג שלא לפגוע במטריצה כאשר מדיום גידול מתווסף למערכת. כדי להבטיח את ההתפשטות החזקה של תאים ממאירים, מדיום גידול צריך להיות בתוספת הפלזמה אנושית האבחון של המטופל שהתאים נמצאים בתרבית תואמת. Oהגבלת ne של מערכת RBM שהיה שם לב היא חוסר היכולת שלה לתמוך באוכלוסיות מטוהרת של תאי CD34 + גזע hematopoietic, CD20 + תאי B, ותאי CD138 + פלזמה ללא תא סטרומה של BM.
מערכת RBM היא תכליתית מאוד ויכולה להיות שונה במובנים רבים בצורה הטובה ביותר את המטרות של מחקרים ספציפיים. תא אנדותל ניתן להוסיף למערכת כדי לחקות את כלי הדם של בע"מ ורכיבי מטריצה תאיים נוספים יכול להיות מסופק להביא את הרכב המטריצה הקרוב ככל האפשר לin vivo האיפור של בע"מ וריכוזי המטריצה יכול להיות מותאם ל משקף את מצבי המחלה שבה הריכוזים של רכיבי מטריצה בודדים עשויים להשתנות 21. בנוסף לculturing תאים ראשוניים, מערכת RBM מתאימה לcoculturing שורות תאים שונים ללמוד תאי תאי אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים ספציפיות. לדוגמא, המערכת יכולה להיות מוגדרת כcoculture בי stromaתאי l צופה מעל ציפוי endosteal, תאי hematopoietic מתווספים על גבי תאי סטרומה, וcoculture סטרומה / hematopoietic כולו מעולף ראשון עם מטריצת RBM ולאחר מכן עם מדיום הגידול. גם שימושי, יכולים להיות השינויים בהרכב הבינוני עד כולל פלזמה ממקורות שונים או בינוני מותנים בstroma ללמוד כיצד גורמים מסיסים משפיעים על התנהגות תא 12. ציטוקינים, גורמי גדילה והורמונים ניתן גם להוסיף למדיום הגידול, לעומת זאת, יש להקפיד שלא להחליף את כל מדיום הגידול בתרבות בבת אחת כגורמים לקיום צמיחה שמופרשים על ידי התאים בRBM עלול ללכת לאיבוד, ובכך , המשפיע על הכדאיות הכוללת של המערכת. אנו ממליצים להחליף עד 50% מבינוניים בכל פעם.
מערכת RBM יכול לשמש כדי לחקור שתי התנהגות התא (כלומר התפשטות, כדאיות, הגירה, וכו ') ועל מנת להעריך את העוצמה ואת ההשפעות מחוץ היעד של טיפולי חדשניזה 8,12. המערכת מוגדרת לשחזר microenvironment הרקמות, ובכך, את היעילות של תרופות ניסיוניות ניתן להעריך בתנאים של בתיווך סביבת סמים התנגדות 14. באמצעות מיקרוסקופ בזמן אמת לחיות תאים, תא כדאיות במהלך הטיפול ניתן להעריך על ידי מכתים חי / מת והשפעת הטיפול על האברונים שונים ניתן להעריך באמצעות צבעים אברון הספציפי זמינים מסחרי מרובים שבקלות לחדור את מטריצת RBM ו הם נאספים על ידי התאים מבלי ליצור רקע משמעותי שיכול להשפיע על הדמיה.
מערכת RBM מספקת מודל תכליתי וישימה מאוד ללמוד הפרעות BM. היתרון של שיטת תרבות 3-D, כגון בהשוואה לתרבויות 2-D הסטנדרטי הוא ביכולת ללמוד התנהגות תא בהקשר של microenvironment הרקמה להבטיח כי ההשפעות של האינטראקציות מרובות לא החמיצו כאשר תאים מבודדים מphysiסביבת ological והניח בצלחת פלסטיק. הערעור של מערכת RBM מעל in vivo מודלים טמון בשקיפות של המערכת שבה האינטראקציות שלא ניתן לראות in vivo בשל המגבלות של שיטות הדמיה יכולה להיות גזורים בקלות. מערכת RBM מספקת אמצעי למניפולציה קלה של רכיבים תוך שמירה על הרכב רקמות הכללי, ובכך מאפשר לחוקר לנתח את המנגנונים המולקולריים תחת חקירה. יתר על כן, מערכת RBM אומתה כדרך יעילה וחסכונית, בהשוואה לבדיקות in vivo, לערוך מחקרים פרה הרפוי רומן 8,12. יחדיו, מודל RBM מספק מערכת שבה היבטים רבים של ביולוגיה רקמה יכולים להיחקר vivo לשעבר באמצעות דגימות ראשוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן (1R21CA141039), BD Biosciences מענק מחקר פרס, האגודה האמריקנית לסרטן המחקר המוסדי גרנט (IRG # 58-006-53), למרכז אוניברסיטת פרדו למלחמה בסרטן מחקר, והמכון הקנדי לבריאות מחקר והתכנית ליוזמות מחקר אלברטה סרטן הדירקטוריון. חבר הפרלמנט נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן, תכנית למניעת סרטן התמחות (R25CA128770; PI: ד טיגרדן) מנוהל על ידי המרכז למדעי אונקולוגית ומרכז המחקר למידה הגילוי באוניברסיטת פרדו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
