Summary
In Standardkulturverfahren, Zellen aus ihrer physiologischen Umgebung genommen und auf die Kunststoffoberfläche einer Schale gezüchtet. Um das Verhalten von primären humanen Knochenmarkzellen untersuchen wir eine 3-D-Kultur-System, wo Zellen unter Bedingungen rekapituliert die native Mikroumgebung des Gewebes gewachsen erstellt.
Abstract
Gewebekultur ist ein wertvolles Werkzeug, um viele Aspekte der Zellfunktion zu untersuchen, von der normalen Entwicklung für Krankheiten. Herkömmliche Zellkulturverfahren beruhen auf der Fähigkeit von Zellen, entweder an einem festen Substrat einer Gewebekulturschale befestigen oder in Suspension in einem flüssigen Medium wachsen. Mehrere wurden unsterbliche Zelllinien erstellt und aufgewachsen mit solchen Ansätzen, aber diese Methoden häufig scheitern, wenn Primärzellen brauchen, um ex vivo kultiviert werden. Ein solches Versagen ist das Fehlen von geeigneten extrazellulären Matrixkomponenten des Gewebemikroumgebung von den Standardsystemen, bei denen Gewebekultur-Plastik ist als Oberfläche für Zellwachstum eingesetzt zurückzuführen. Extrazelluläre Matrix ist ein integraler Bestandteil der Gewebemikroumgebung und die Präsenz von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen, wie Zellpolarisation, das Überleben und die Proliferation ist. Hier präsentieren wir eine 3-dimensionale Gewebekultur-Methode, bei der primären Knochenmark-cells sind in der extrazellulären Matrix formuliert, um die Mikroumgebung des menschlichen Knochen (RBM-System) rekapitulieren gewachsen. Eingebettet in der extrazellulären Matrix werden die Zellen mit Nährstoffen durch das Medium, ergänzt mit Humanplasma zugeführt wird, wodurch ein umfassendes System, bei dem das Überleben der Zelle und die Proliferation kann für bis zu 30 Tage aufrechterhalten werden, während die zelluläre Zusammensetzung des primären Gewebes. Mit der rBM System haben wir erfolgreich primäre Knochenmarkszellen von normalen Spendern und Patienten mit Amyloidose und verschiedenen hämatologischen Malignomen gewachsen. Die rBM System ermöglicht direkte, in-Matrix Echtzeit-Visualisierung des Zellverhaltens und Bewertung von präklinischen Wirksamkeit neuer Therapeutika. Darüber hinaus können Zellen aus dem rBM isoliert und anschließend zur in vivo-Transplantation, Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Nukleinsäure-und Proteinanalyse. Zusammengenommen stellt die rBM Verfahren ein zuverlässiges System für das Wachstum von primären Knochen marrow Zellen unter physiologischen Bedingungen.
Introduction
Gewebekultur wurde entwickelt, um das Verhalten der Zelle in einer kontrollierten Umgebung zu studieren, um die Variabilität zu minimieren, wenn systemische Vergleich verschiedener Prozesse in intakten Organismen. Diese Methode wurde erstmals im Jahr 1900 1,2 festgelegt und bezieht sich auf eine Technik, bei der Gewebe-Explantate wurden in eine Glasschale kultiviert ex vivo. In der Mitte der 1900er Jahre wurde das System angepasst, um verstreuten Zellen eher als Fragmente intakter Gewebe wachsen, und die Begriffe "Gewebekultur" und "Zellkultur" wurde zum Synonym für drei. Bei solchen herkömmlichen Zellkultursystemen Zellen auf der Oberfläche der Gewebekultur-Plastik mit Wachstumsmedium mit verschiedenen Wachstumsfaktoren überlagert gewachsen. Adhärenten Zellkultur, in der Zellen anlagern und ausbreiten auf der Gewebekultur-Kunststoff und nicht-adhärenten Kulturen, wo Zellen in Suspension propagiert: Zwei Arten von Kulturen haben auf der Grundlage der Haftfähigkeit von verschiedenen Zellen entstanden. Seit den frühen Tagen des ZellEs wurden Kultur verschiedenen unsterblichen Zelllinien wie HeLa-4, der ersten menschlichen Krebszelllinie. Diese Zelllinien haben die Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in Zellkultur zu vermehren, und die meisten keine spezielle Behandlung erforderlich, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
Die reduktionistische Ansatz der ursprünglichen Zellkulturverfahren wurde entwickelt, um das System so weit wie möglich, indem die erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation aufrecht Minimum Komponenten vereinfachen. , Vereinfachte Zellkultur Ansätze scheitern jedoch ex vivo meisten primären humanen Zelltypen mit begrenzter Lebensdauer unterstützen. Daher neue Kultursysteme werden entwickelt, um die Gewebemikroumgebung so eng wie möglich anzunähern, wodurch Zell Explantate unter physiologischen Bedingungen zu wachsen. Im Gegensatz zu den herkömmlichen / Reduktionist Zellkulturansätze, 3-dimensionale (3-D) werden nun Kultursystemen zu einem bevorzugten Verfahren, um effizient verschiedene Kulturmenschlichen Zelllinien und Primärzellen anschließend untersuchen Mechanismen in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind, im Rahmen einer Mikroumgebung. Solche 3-D-Systeme sind in der Regel mit rekonstruierten Matrizen und / oder Medium mit Wachstumsfaktoren gesetzt, um die Gewebe-Mikroumgebung zu rekapitulieren, um Zelltypen von Interesse studieren. Die erste dieser 3-dimensionalen (3-D) Kulturmodelle entwickelt, um Brustdrüsenentwicklung zu untersuchen. Um die Zellen mit nativen Bedingungen Brustepithelzellen in Matrigel eingebettet, Collagen IV und Laminin-reiche Quelle von extrazellulärer Matrix (ECM) zu schaffen, und bedeckt mit Wachstumsmedium. Unter solchen Bedingungen, bildeten die Mamma-Epithelzellen Cluster ähnlich der Brust Acini und nach Stimulation mit laktogene Hormone, diese Azini sezerniert Kasein, Milchproteine und andere, in den Hohl Lumena der Acini artige Strukturen. Casein-Sekretion wurde nicht in Standard-Kulturen auch nach Zugabe von Prolaktin 5 beobachtetWeitere Betonung der Rolle der Mikroumgebung bei der Erhaltung der morphologischen und phänotypischen Eigenschaften von Zellen. Eine weitere Demonstration der Verlust der normalen Zellfunktion, wenn die Zellen aus dem Kontext ihrer physiologischen Mikroumgebung genommen ist eine Demonstration, dass ohne Mikroumgebung, Keratinozyten nicht, geschichtete Epidermis 6 zu bilden. Eine Anzahl von anderen 3-D-Modelle wurden entwickelt, um die ex vivo Vermehrung von primären Zellen 7,8 erlauben.
Die entscheidende Rolle der Mikroumgebung der Zellverhalten wurde elegant in einer Studie, in Brustepithelzellen gebildet "inside-out", wenn Acini in Kollagen kultivierten I Matrix, verglichen mit dem vollständig polarisiert Acini, die in Matrigel gebildet wurden demonstriert. Dieser Verlust der korrekten Morphologie wurde rückgängig gemacht, wenn Laminin-produzierenden Myoepithelzellen wurden den Kulturen Kollagen I 9 aufgenommen. Darüber hinaus ist die richtige Mikroumgebung für die genaue erforderlichGenotyp Manifestation. In einer Schale gezüchtet, MCF7-Brustkrebszellen mit einem Zell-Zell-Adhäsionsmolekül CEACAM1 transfiziert verhalten sich genau die gleiche wie die nicht-transfizierten CEACAM negativen Zellen. Wenn jedoch in Matrigel kultiviert, in Kontakt mit ECM, Wildtyp MCF7 Form tumorartige Strukturen, während MCF7 Zellen mit CEACAM1 transfiziert wieder zu einem normalen Phänotyp und Form Acini mit Hohl Lumena, wie mit nicht-malignen Brustepithel 10 eingerichtet. Ebenso Sperr β1-Integrin in Brustkrebszellen nicht deren Verhalten unter Standardkulturbedingungen zu ändern, aber der gleiche Versuch in 3-D-Kulturen durchgeführt zeigt, dass die Blockierung β1-Integrin kehrt malignen Zellen zu einem normalen Phänotyp 11. Daher wird das Gewebe-Mikroumgebung nicht nur erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht zu erhalten, sondern auch um die richtige Zellfunktion beizubehalten.
Neben der Bereitstellung eines Systems, wo das Zellverhalten unter physiologischen Zustand untersucht werdens, funktionieren 3-D-Kulturen als robustes und zuverlässiges Medium für die präklinische Testung neuer Therapeutika 8,12,13. Kultivieren von Zellen in 3-D ermöglicht Screening von Verbindungen unter den experimentellen Bedingungen der Umwelt-vermittelte Resistenz-14, wo der Beitrag der Zell-Zell-und Zell-ECM-Adhäsion beurteilt werden konnte. Darüber hinaus können Off-Target-Toxizität neuer Verbindungen, die durch die mehrfache zellulären Kompartimenten verschiedener Gewebe festgestellt werden. Solche Bildschirme können schneller durchgeführt werden und sind kostengünstiger als vergleichbare Studien in vivo 8.
Hier präsentieren wir ein Setup von einem 3-D-Modell des rekonstruierten Knochenmark (RBM), wo normalen und malignen Knochenmark (BM)-Zellen vermehren ex vivo in einem System eng imitiert die Mikroumgebung des menschlichen BM. Frühere Versuche zur wachsenden primären humanen Zellen BM in 2-D-Kulturen, flüssigen oder haft Co-Kulturen mit verschiedenen Komponenten des BM StromaOder 3-D, halbfesten Agarkulturen haben mit beschränktem Erfolg aufgrund ihrer Unfähigkeit, die Zellen mit den Komponenten der Gewebemikroumgebung liefern 15-18 erfüllt. In diesen Systemen hatte BM primären Zellen schlechte Rentabilität und nicht zu vermehren ex vivo. Ein anderes System, wo menschliche BM Vorläuferzellen in Sphäroid-Co-Kulturen mit BM Stromazellen gewachsen ist ein 3-D-System, wo hämatopoetischen Stammzelllebensfähigkeit und Proliferation wurde für mindestens 96 Stunden 19 getragen. Obwohl sehr nützlich für das Verständnis der hämatopoetischen Vorläufer Biologie, dieses System nicht getreu rekapitulieren die Mikroumgebung des BM aufgrund der Abwesenheit von ECM-Komponenten, also die Begrenzung ihrer Nützlichkeit. Die hier beschriebene rBM Modell präsentiert ein umfassendes System, wo beide zellulären und extrazellulären Kompartimenten des menschlichen BM werden in vitro rekonstruiert. Wir zeigen, dass rBM Kulturen ex vivo Wachstum von normalen menschlichen BM-Zellen unterstützen, wie wirll als Zellen von Patienten mit verschiedenen hämatologischen Störungen isoliert.
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Protocol
1. Advance-Vorbereitung
- Halten sterilen serologischen Pipetten und Pipettenspitzen bei 4 ° C
Fehlerbehebung: Matrigel Gele bei Raumtemperatur (RT), mit kaltem Pipetten und Tipps werden Matrigel geliert während der Kultur-Setup verhindern. - Tauen Sie eine Flasche Matrigel bei 4 ° C über Nacht.
2. Vorbereitung der Reagenzien
- Vorbereitung von Fibronektin-Stammlösung: Machen Sie eine 1 mg / ml Stammlösung von Fibronektin durch Auflösen von 100 mg humanem Fibronektin in 100 ml destilliertem Wasser. Sobald die Fibronektin gelöst hat, Sterilfilter, aliquote, und bei 4 ° C bis zu 6 Monaten.
Fehlerbehebung: Wenn Fibronektin nicht schnell auflösen inkubieren Sie die Lösung für ein paar Minuten in einem Wasserbad Satz bei 37 ° C - Herstellung von 10x PBS: Man löst 80 g Natriumchlorid NaCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2 g KCl und 2,4 g KH 2 PO
- Vorbereitung der Neutralisationspuffer 20: Machen Sie eine Lösung, die 100 mM HEPES 2x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 1 M HEPES und 10x PBS-Stammlösungen. Einstellen des pH der Lösung auf 7,0. Lagern bei 4 ° C für 2-3 Monate.
- Herstellung von 2 mg / ml-Lösung von Rattenschwanz-Kollagen Typ I: Einen 2 mg / ml Kollagen-I-Lösung in der Neutralisationspuffer (Schritt 2.3). Mischen Sie die Lösung bei niedriger Geschwindigkeit und vorsichtig durch Pipettieren von oben und unten. Da diese Kollagen sehr zähflüssig ist, zu vermeiden Erzeugung von Luftblasen beim Pipettieren. Es wird empfohlen, Kollagen I-Lösung jedes Mal frisch zubereiten. Die Lösung wird auf Eis bis zum Gebrauch.
- Vorbereitung der endostalen Beschichtung (Rend): Mischen Sie 1 mg / ml Fibronektin-Lager mit 2 mg / ml Kollagen I Lager (Schritte 2.1 und 2.4) bis zu einer Endkonzentration von 77 pg / ml und 29 pg / ml, in 1x &# 160; sterilem PBS. Mischen und bei 4 ° C bis zu 1 Monat.
- Vorbereitung der rekonstruierten Knochenmatrix (RBM):
- Vorkühlen 1,5 ml Reaktionsgefäße auf Eis. Halten Sie alle Matrix-Lösungen auf Eis zu allen Zeiten.
- Mischung 4 Teile Matrigel (Matrigel-Konzentration variiert von Charge zu Charge, aber die Variationen gefunden vernachlässigbar ist), 2,5 Teile 1 mg / ml Fibronektin und 1 Teil von 2 mg / ml Kollagen I auf Eis durch erste Pipettieren in Matrigel der Schlauch mit kaltem Pipettenspitzen und fügen Sie dann Fibronektin und Kollagen I. Matrigel beginnt Erstarren bei Temperaturen über 4 ° C, so schnell arbeiten beim Pipettieren Matrigel. Mischen Sie die Matrix sehr vorsichtig durch Pipettieren von oben und unten, vermeiden die Einführung Blasen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, während das Mischen der rBM.
- Vorbereitung der Knochenmarkwachstumsmedium (BMGM): Stellen Sie 500 ml BMGM enthält 6,2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 -6 M Natrium-Succinat, 10 -6 M Hydrocortison, 20% Humanplasma (normalen oder malignen von gesunden Spendern oder Patienten gesammelt) und 1% Penicillin / Streptomycin in RPMI-1640. CaCl 2, Natrium-Succinat, und Hydroergänzungsmittel können bei -80 ° C für> 6 Monate 1.000 x Stammlösungen aufbewahrt werden. Wenn wachsende Zelllinien können fetales Rinderserum (FBS) für Humanplasma ersetzt werden.
- Herstellung von 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF): In 37% Formaldehyd-Stammlösung PBS bei 10% v / v 1x Gut mischen und bei Raumtemperatur lagern 2-3 Wochen vor Licht geschützt.
- Herstellung von 1% Rinderserumalbumin (BSA): Wiegen geeignete Menge BSA und löst ihn in 1x PBS. Lagerung bei 4 ° C und innerhalb von 1 Woche. BSA-Lösung neigt dazu, verunreinigt, wenn für längere Zeit gehalten gekühlt zu werden. Alternativ können BSA-Lösung aliquotiert und bei -20 ° C eingefroren werden für die Langzeitlagerung. Vermeiden Frost-Tau-Zyklen.
- Herstellung von Zell Recovery-Lösung (CRS): Stellen Sie 5 mM EDTA, 1 mM Natriumvanadat (Na <sub> 3 VO 4) und 1,5 mM Natriumfluorid (NaF)-Lösung in 1x PBS. Sterilfilter und bei 4 ° C bis zu 6 Monaten.
3. Eingebettete 3D-Kultur von nicht-malignen und malignen humanen BM-Zellen
- Reinige Primär BM mononuklearen Zellen durch Ficoll-Plaque-Zentrifugation den Anweisungen des Herstellers.
Optionaler Schritt: Zellen mit 0,25 uM Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFSE) den Anweisungen des Herstellers, die Zellproliferation in der gesamten Kulturperiode folgen beschriftet werden.
Fehlerbehebung: Wenn Zellen sterben nach CFSE-Färbung titriert die Menge der CFSE die Konzentration hängt vom Zelltyp, 0,25 uM funktioniert gut für Primär BM mononuklearen Zellen. - In 65 ul Rend-Lösung in jede Vertiefung einer 48-Well-Gewebekulturplatte behandelt. Verbreiten Sie die Lösung gleichmäßig auf die gesamte Fläche der gut decken und Inkubation für> 30min bei RT.
- Vorbereitung der Zellsuspension in einer Dichte von 0,5 × 10 6 Zellen in 10 ul 1x PBS pro Vertiefung einer 48-Well-Platte. In einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mischen die Zellsuspension mit 100 ul rBM Matrix pro Vertiefung. Mischen Sie die Zellen und rBM Matrix durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren; vermeiden Einführung Blasen. Halten die Zell / Matrix-Mischung auf Eis, um ein Gelieren der Matrix zu vermeiden.
Hinweis: Die rBM System ist vollständig skalierbar, um das System in einem nicht-48-Well-Format einzurichten, passen Sie die Mengen aller Reagenzien (Matrizen und Medium) auf der Grundlage der Fläche der Platte verwendet. Skalieren der Anzahl von Zellen entsprechend beschichtet werden. - Saugen Sie den verbleibenden zerreißen und fügen Sie die Zell / Matrix-Mischung in der Mitte der Brunnen. Schnell verbreitete die Zell / Matrix-Gemisch, um die gesamte Oberfläche der Wanne gleichmäßig bedecken. Die Platte wird für 30-60 min bei 37 ° C, 5% CO 2-Gewebekultur-Inkubator, damit die Matrix zu verfestigen. Schütteln oder dissiertem die Platte während der Inkubation.
Fehlerbehebung: Um ungleichmäßige Verteilung der Zellen in rBM verhindern, gut mischen vor dem Beschichten. Mischen, nachdem jeder 5. Vertiefung ausplattiert, um Zellen sich am Boden des Rohrs zu vermeiden. Sobald zogen, keine Zellen, die nicht auf den Boden des Bohrlochs durch Zug an der Matrixoberfläche sinken.
Fehlerbehebung: Um ungleichmäßige Verteilung der Zellen in rBM verhindern, gut mischen vor dem Beschichten. Mischen, nachdem jeder 5. Vertiefung ausplattiert, um Zellen sich am Boden des Rohrs zu vermeiden. Sobald zogen, keine Zellen, die nicht auf den Boden des Bohrlochs durch Zug an der Matrixoberfläche sinken. - Vorwärmen BMGM in einem Wasserbad auf 37 ° C eingestellt
- Nach 30 Minuten, um zu sehen, dass die Matrix richtig eingestellt, es wird wie ein weiches Gel-Schicht, die sich nicht bewegt, wenn die Platte gekippt bilden. Überlagern der Zell / Matrix-Schicht mit 1 ml warmem BMGM. Reißen der Matrix Pipette das Medium sehr leicht zu vermeiden (Abgabe Tropfen für Tropfen) unter Verwendungeine serologische Pipette. Legen Sie die zusammengebauten rBM Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator und Kultur für den gewünschten Zeitraum.
Hinweis: die Lebensfähigkeit der Zellen wird für mindestens 30 Tage gehalten, ohne Medium; wenn Mediumwechsel ist erforderlich, jedes Mal ändern, nur 50% des Mediums.
Critical Schritt: Es ist entscheidend, dass das Medium nicht kalt wie Kälte könnte den bereits festgelegt Matrix stören. Achten Sie darauf, um das Medium auf der Matrix zu spritzen, es könnte die weiche Matrix-Schicht brechen.
Fehlerbehebung: Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen in der rBM System niedrig ist, kann die Zelldichte müssen experimentell bei der Arbeit mit anderen als primäre mononuklearen Zellen aus BM saugt Zellen bestimmt werden. Bei der Arbeit mit Zelllinien, verringern Sie die Anzahl der Zellen 10-fach, als immortalisierte Zelllinien vermehren sich schneller als Primärzellen.
4. 'In-Matrix "Imaging
- Bild die kultivierten Zellen direkt in rBM mit Hellfeld, Differential-Interferenzkontrast (DIC), konfokale oder andere bildgebende Verfahren, Fern Bildgebung zu ermöglichen, wie die Matrix ist etwa 1 mm dick. Verwenden Sie die Z-Stapel-Funktion auf vielen der Mikroskope zur Verfügung, um Bild die gesamte Kultur von oben nach unten.
Tipp: Für die Immunfärbung Protokoll unten vermeiden Absaugen Färbung / Waschlösungen, statt die Platte zu kippen und Lösungen zu entfernen mit einer Pipette.
- Entfernen Sie die BMGM mit Hilfe einer Pipette und waschen 2-3x mit 100 ul / Wäsche / Vertiefung RT 1x PBS. Stellen Sie sicher, dass genügend PBS wird verwendet, um die gesamte Oberfläche des gut abzudecken.
- Zellen in der Matrix zu fixieren, indem 100 ul / Vertiefung (für eine 48-Well-Platte) von 10% NBF für 15 min bei RT. NBF entfernen und waschen die Zellen zweimal mit 100 ul / Wäsche / Vertiefung RT 1x PBS.
Anmerkung: Vermeiden Sie kalte NBF, da es die Matrix zu verflüssigen. - PBS entfernen, fügen Sie 1% BSA für 1 h bei RT oder bei 4 ° C über Nacht, um unspezifische Bindung von Antikörpern zu blockieren.
- Vorbereitung Primärantikörperlösung in 1% BSA in der erforderlichen Verdünnung. Die Verdünnung wird für jeden Antikörper ändern, bitte mit dem Hersteller oder titriert, um die optimale Antikörperkonzentration zu bestimmen. Füge 100 &mgr; l / Vertiefung von primärem Antikörper-Lösung und Inkubation nach den Anweisungen des Herstellers.
Kritischer Schritt: Alle Inkubationen mit Antikörpern gegen Fluorophore oder Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert im Dunkeln durchgeführt werden. - Entfernen primären Antikörperlösung und waschen 3x mit 1x PBS für 5 min.
- Für die indirekte Immunfluoreszenzfärbung, Inkubation mit einem sekundären Antikörper, um fluoreszierende Sonde für 1 Stunde bei Raumtemperatur konjugiert. Verdünnte Antikörper in 1% BSA in einer Konzentration vom Hersteller vorgeschlagen.
- Entfernen Sie die Sekundär einntibody Lösung und waschen 3x mit 1x PBS für 5 min.
Fehlerbehebung: Um zu vermeiden, hohen Hintergrund während der Bildgebung, titriert die fluoreszenz konjugierten Sekundärantikörper und die niedrigste Konzentration, die eine angemessene Signal liefert. Wenn hohe Hintergrund ist immer noch ein Problem ist, erhöhen Sie die Anzahl und die Dauer der Waschschritte, oder nutzen Sie direkt konjugiert primären Antikörper und überspringen Sie Schritt 4.2.6. - Um die Kerne färben hinzufügen 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) Kernfärbung Lösung, bei der Verdünnung durch den Hersteller empfohlen, und Inkubation für 7-10 min bei RT.
- Entfernen Kernfärbung Lösung und waschen 2x mit 1x PBS für 5 min.
- Entfernen Sie die PBS aus dem letzten Wasch und fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium (regulärer Satz), auf die Probe, um die Fluoreszenz zu bewahren. Bild mit entsprechender Anregung / Emission Einstellungen auf einem Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop.
Hinweis: Imaging sollte innerhalb von 2 Tagen nach der Färbung durchgeführt werden, um den Abbau der Matrix und der Verlust von rBM Integrität und Verlust der Fluoreszenzsignals zu vermeiden. Wenn es nicht sofort abgebildet werden, sollte gefärbten Proben bei 4 ° C aufbewahrt werden, vor Licht geschützt, bis Bildgebung.
5. Isolierung von Zellen aus rBM
- Medium vorsichtig entfernen, ohne die Matrix-Schicht zu stören. Saugen Sie nicht.
- Waschen Sie die Zellen 2x mit sterilem 1x PBS. Saugen Sie nicht.
- 0,5 ml eiskaltem CRS in jede Vertiefung und entfernen Sie die gesamte Matrix-Schicht zusammen mit den Zellen, durch kräftiges Auf-und Abpipettieren. Sammeln Sie die Zellen, Matrix und CRS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zeigen auf Eis.
- Fügen Sie eine zusätzliche 0,5 ml CRS auf den gleichen gut und sammeln Sie alle verbleibenden Materials. Transfer zum selben Reaktionsgefäß.
- Vortex die Mischung von Zellen, Matrix und CRS und Inkubation auf Eis für 1 Stunde. Vortex-Zellen alle 15 Minuten, um die Freisetzung aus der Matrix zu erleichtern.
- Überprüfen Sie die Mischung nach 1 Stunde, ohne sichtbare Klumpender Matrix vorhanden sein.
Fehlerbehebung: Wenn Klumpen von Matrix noch nach 1 Stunde sichtbar, Transfer Zellen / Matrix / CRS Mischung zu einem größeren Rohr, fügen zusätzliche 2-5 ml CRS, und Inkubation für weitere 30 bis 60 min. - Zentrifuge Zellen in CRS bei 1.000 UpM für 5-10 Minuten bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml kaltem PBS 1x.
- Zentrifugieren bei 1.000 rpm für 5-10 min und Überstand. Wiederholen Sie den PBS-Wasch noch einmal.
- Der zweite PBS-Wasch vervollständigt die Wiederherstellung von Zellen von Matrix und isolierte Zellen können für beliebige nachfolgende Anwendungen wie DNA / RNA / Protein-Isolierung verwendet werden, Durchflusszytometrie, in vivo Transplantation usw..
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Representative Results
Da primäre Knochenmarkszellen nicht, unter Standard-Zellkulturbedingungen vermehren, wurde die rBM System geschaffen, um genau imitieren die Knochen-Mikroumgebung, die Bereitstellung eines Systems zur Kultur und zu erweitern BM Zellen ex vivo. Die Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix BM, Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und 21 wurden in rBM Matrix eingebaut, um die strukturelle Gerüst des 3-D-Kultur bereitzustellen. Endosteum, die Schnittstelle zwischen dem Knochen und dem BM, reich an Kollagen und Fibronectin wurde durch Beschichten der Oberfläche einer Gewebekulturschale mit diesen Proteinen rekonstruiert. Übersprechen zwischen mehreren zellulären Kompartimenten innerhalb der BM zur Gesamt Homöostase des Gewebes. Um sicherzustellen, dass keine der zellulären Komponenten ausgelassen wurde die Kultur bis rBM mit unfraktioniertem mononuklearen Zellen aus dem menschlichen BM Nadelbiopsien absaugen gesetzt. Um sicherzustellen, dass das System mit Hormonen, Wachstumsfaktoren, eine zugeführteim Kreislauf Umgebung vorhanden d Zytokine, wurde das Kulturmedium mit menschlichem Plasma entspricht, wobei die Probe kultiviert (dh Plasma von gesunden Spendern wurde hinzugefügt, als BM maligne Zellen wurden in rBM gelegt, während Plasma von Patienten zu den Kulturen von malignen hinzugefügt ergänzt Zellen) (Abbildung 1).
BM-und Blutproben von gesunden Spendern und Patienten mit verschiedenen hämatologischen Malignomen wurden nach Genehmigung von der Purdue University und der University of Alberta Institutional Research Boards und nach schriftlicher Einwilligung in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki (Tabelle 1) gesammelt. Mononuklearen Zellen aus BM Biopsien isoliert vermehren und ihre Lebensfähigkeit in rBM System für bis zu 30 Tage (Abbildung 2) zu halten. Die Zellkonzentration von 0,5 x 10 6 cells/100μl von rBM Matrix bestimmt wurde, die optimale Dichte für die Primär BM-Zellen sein. Jenseits this Dichte overcrowds das System abnehmender Zelllebensfähigkeit und Proliferationsraten über die Zeit. Eine geringere Dichte hat sich auch gezeigt nachteilig auf die Gesamt Heide des Systems sein, wie Zell-Zell-Kontakte wichtig für ein Zellwachstum robust erwiesen. Wachstum innerhalb der rBM kann nach Markierung von Zellen mit Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFSE) verfolgt werden. Fluoreszenzintensität von CFSE Hälften bei jeder Zellteilung, so kann die Zellproliferation durch Mikroskopie verfolgt oder Durchflusszytometrie Laufe der Zeit. Darüber hinaus sind die zellulären Kompartimenten innerhalb der rBM Kultur in den gleichen Verhältnissen gehalten, wie in den Biopsie-Proben 8 vorhanden waren. Zusätzlich zu den Zellen der hämatopoetischen Abstammungslinien, Stromazellen Abteile aufweisen robustes Wachstum rBM. Alkalische Phosphatase exprimieren Osteoblasten in der Lage Mineralisierungs Calcium-, Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung Osteoklasten, Öl rot positive Adipozyten, und Fibronektin Herstellung Stromazellen an der Endosteum gefunden/ BM-Schnittstelle des rBM System (Abbildung 3).
Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass das Modell eine rBM ersten Ex-vivo-System, in dem primäre humane BM-Zellen von gesunden Spendern und Patienten mit verschiedenen hämatologischen Malignitäten, wie Leukämie, Lymphom, multiplem Myelom und aufrechterhalten und für bis zu 30 Tage ausgedehnt werden. rBM bietet ein umfassendes Modell, um das Verhalten der Zelle unter physiologischen Bedingungen im Rahmen der nativen BM Mikroumgebung zu studieren. Dieses System wurde von unserem Labor verwendet worden, um den Phänotyp der multiplen Myelom Krebsstammzellen zu identifizieren und die Wechselwirkungen zwischen den malignen Zellen und der extrazellulären Matrix BM und die Kreuzkopplung zwischen den malignen Zellen und BM Stroma studieren.
| Diagnose | Zelltyp | Überleben | |
| Maligne | BM | Mäßig | Mäßig |
| Amyloidose | BM | Hoch | Hoch |
| Monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz | BM | Hoch | Hoch |
| PBMC | Nicht | Nicht | |
| Plasmozytom | BM | Hoch | Hoch |
| Schwelbrand multiplem Myelom | BM | Hoch | Hoch |
| Das Multiple Myelom | BM | Hoch | Hoch |
| PBMC | Nicht | Nicht | |
| MB | Hoch | Hoch | |
| Plasma-Zell-Leukämie | BM | Hoch | Hoch |
| Walden macroglobulenemia | BM | High | Hoch |
| Akuter myeloischer Leukämie | BM | Hoch | Hoch |
| Akute Promyelozytenleukämie | BM | Hoch | Hoch |
| PBMC | Nicht | Nicht | |
| Akuter lymphozytischer Leukämie | BM | Mäßig | Mäßig |
| Chronische myeloische Leukämie | BM | Mäßig | Hoch |
| Chronische lymphatische Leukämie | BM | Niedrig | Schleppend |
| PBMC | Nicht | Nicht | |
| Non-Hodgkin-Lymphom | BM | Mäßig | Schleppend |
| PBMC | Nicht | Nicht |
Tabelle 1. Überleben und die Vermehrung von verschiedenen Proben in rBM kultiviert. Knochenmark mononuclear Zellen (BM), waren periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) oder mobilisiert Blutproben (MB) von gesunden Spendern und Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen diagnostiziert in rBM kultiviert. Die Tabelle listet alle Probentypen, die in kultivierten rBM zusammen mit dem Zelltyp (dh BM, PBMC oder MB) waren. Das Ausmaß des Zellüberlebens und der Proliferation in rBM sind angegeben. Während BM MB aufweisen und robustes Wachstum in rBM wurden PBMCs von Patienten mit verschiedenen malignen Erkrankungen isoliert nicht lebensfähig rBM.
Fig. 1 ist. . Schematische Darstellung der rBM rBM Setup besteht aus zwei Phasen: 1) die endostalen Beschichtung (Fibronektin, Kollagen I (CI)) und 2) rBM Matrix (Fibronektin, Kollagen I (CI), Kollagen IV (CIV) und Laminin) Hinweis. : Kollagen IV und Laminin sind die michtige Komponenten Matrigel, wodurch keine separate Zugabe dieser Proteine erforderlich. Diese Phasen werden in zwei Schritten durch Überlagerung der rBM Matrix / Zellgemisch auf der dünnen Beschichtung aus endostale Matrix gesetzt. Um die Zellproliferation im Laufe der Zeit folgen, können Zellen mit CFSE vor dem Mischen mit dem rBM Matrix gekennzeichnet werden. Während der Dauer der Kultur können die Zellen unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden und die Zellmigration in Echtzeit unter Verwendung eines Mikroskops mit einer Temperatur / CO 2 gesteuert Kammer ausgestattet folgen. Nach 14 bis 30 Tagen in Kultur-Zellen können aus der Matrix isoliert und auf eine Vielzahl von Downstream-Analysen, die sowohl in vitro und in vivo-Verfahren unterzogen werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Zeitverlauf der Selbsttrennung von zellulären Kompartimenten in rBM. BM-Zellen wurden in rBM für die angegebene Anzahl von Tagen gezüchtet. Stromaelemente deutlich werden am Tag 14, kann aber bereits an Tag 5 in rBM detektiert werden. Im Laufe der Kulturperiode Zellen gesehen Migration durch rBM Matrix und Aggregation in verschiedene Cluster werden. Massen von malignen Zellen im Laufe der Zeit zu erweitern (vgl. Clustergrößen zwischen Tag 9-30). Repräsentativen Überblick über die Kultur zu jedem Zeitpunkt wurde mit Hellfeldmikroskopie an einem inversen Mikroskop (Vergrößerung: 200X) eingefangen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Stroma-Fächer "geliefert" im rBM. Um die Zusammensetzung der Stroma-Komponenten, die in rBM hinauswachsen zu bewerten, wurden die Zellen am Übergang zwischen rBM Matrix und endostalen Beschichtung für Fibroblasten, Osteoblasten, Adipozyten und Osteoklasten-spezifische Morphologie und Marker Ausdruck ausgewertet . (a) Fibroblasten zu erfassen, wurden die Zellen auf Fibronektin (grün) angefärbt, Aktin (rot) und Kerne (blau) und auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet wird (Vergrößerung: 200 x). (b) Zellen, die mit Stromazellen Morphologie wurde gezeigt, dass Präosteoblasten mit einer hohen alkalischen Phosphatase-Aktivität (b.1) und geeignet zur Mineralisierung Calcium wie Alizarin-Rot-Färbung (b.2) bestimmt. (c) Zellen, die mit einem sichtbaren Gegenwart von Lipidtropfen wurden als Adipozyten basierend auf positive Färbung mit identifizierten Oil Red (c.1). (d) Zellen mit gelegentlichen mehrere Kerne wurden als pr erkannteosteoclasts und waren positiv für Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) (D.1). Hellfeld und Farbe (nicht fluoreszierend) Bilder wurden auf einem inversen Mikroskop mit einer Farbkamera (Vergrößerung: 200X) ausgestattet erworben. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Die rBM Modell bietet ein umfassendes System, in dem zellulären Zusammensetzung des BM wird ex vivo für bis zu 30 Tage gehalten. BM-Zellen in rBM Selbst Schichtung nach ihrer Funktion eng imitiert die BM-Architektur in vivo gefunden gewachsen. Außerdem ist das erste System, das für die Expansion des multiplen Myeloms Klon 8 ermöglicht. Die wichtigsten Schritte für die Gewährleistung der robuste Wachstum der BM-Zellen und den Gesamterfolg der Kultur sind: 1), um eine gesunde Population der BM-Zellen mit> 70% Rentabilität und meist frei von roten Blutzellen zu erhalten, 2), um sicherzustellen, dass die Matrix-Komponenten sind gut gemischt, dass die Zellen gleichförmig in der Matrix verteilt sind, und 3) zu sorgen, um die Matrix nicht beschädigen, wenn Wachstumsmedium ist mit dem System zugegeben. Um die stabile Proliferation von bösartigen Zellen zu gewährleisten, sollte Wachstumsmedium mit humanem Plasma entsprechend der Diagnose des Patienten, deren Zellen kultiviert, ergänzt werden. One Begrenzung der rBM System, das bemerkt wurde, ist ihre Unfähigkeit, gereinigte Populationen von CD34 + hämatopoetischen Stammzellen CD20 +-B-Zellen und CD138 + Plasmazellen ohne stromale Raum des BM unterstützen.
Die rBM System ist sehr vielseitig und kann in vielerlei Hinsicht um die Ziele der spezifischen Studien am besten entsprechen geändert werden. Endothelzellen Raum kann dem System hinzugefügt, um die Vaskularisation des BM und zusätzliche extrazelluläre Matrix-Komponenten zugeführt, um die Matrix-Zusammensetzung auf die in vivo-Make-up von der BM und die Matrixkonzentration so nahe wie möglich zu beenden imitieren kann angepasst werden spiegeln die Leiden, bei denen die Konzentrationen der einzelnen Matrixkomponenten 21 geändert werden. Zusätzlich zur primären Kultivierung Zellen ist rBM geeignet für Cokultivierung verschiedenen Zelllinien auf Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen spezifischen Zellpopulationen zu untersuchen. Zum Beispiel kann das System als eine Co-Kultur, wo Stroma eingestellt werdenL-Zellen werden über den enossalen Beschichtung plattiert werden hämatopoetische Zellen auf der Stromazellen zugegeben und die gesamte Stromazellen / hämatopoetischen Kokultur zuerst mit dem rBM Matrix und dann mit Wachstumsmedium überschichtet. Auch nützlich, könnten die Änderungen des Mediums Zusammensetzung sein, um Plasma aus verschiedenen Quellen oder Medium durch Stroma Anlage zu untersuchen, wie lösliche Faktoren beeinflussen das Verhalten der Zelle 12 umfassen. Cytokine, Wachstumsfaktoren und Hormone können zu dem Wachstumsmedium hinzugefügt werden, jedoch sollte darauf geachtet werden, dass alle Wachstumsmedium in der Kultur auf einmal als Wachstumsfaktoren erhalt, die von den Zellen sezerniert wurden in rBM ersetzen kann verloren gehen, wodurch , die sich auf die Gesamtüberlebensfähigkeit des Systems. Wir schlagen vor, ersetzt bis zu 50% des Mediums zu einer Zeit.
Die rBM System kann verwendet werden, um sowohl das Zellverhalten (dh Proliferation, Lebensfähigkeit, Migration, etc.) zu untersuchen und die Wirksamkeit zu bewerten und Off-Target-Effekte neuer therapeutischer werdens 8,12. Das System ist, um das Gewebe-Mikroumgebung zu rekapitulieren, was eingestellt ist, kann die Wirksamkeit der Prüfpräparate unter den Bedingungen der Umwelt-vermittelte Resistenz-14 ausgewertet werden. Mit Live-Zell-Echtzeit-Mikroskopie kann die Lebensfähigkeit der Zellen im Verlauf der Behandlung durch Live / Dead-Färbung beurteilt werden und die Auswirkungen der Behandlung auf die verschiedenen Organellen mit mehreren handelsüblichen Organell-spezifische Farbstoffe, die leicht durchdringen die rBM Matrix ausgewertet und von den Zellen ohne dass signifikante Hintergrund, das Bildgebung auswirken könnten aufgewickelt.
Die rBM System bietet eine sehr vielseitige und anpassungsfähige Modell BM Erkrankungen zu studieren. Der Vorteil einer solchen 3-D Kulturverfahren im Vergleich zu den Standard-2D-Kulturen in der Fähigkeit, das Zellverhalten im Zusammenhang mit der Gewebemikroumgebung sicherzustellen, dass die Effekte der mehrfachen Wechselwirkungen sind nicht verfehlt, wenn die Zellen von ihren physikalisch isoliert studierengischen Umwelt und in einer Kunststoffschale gelegt. Die Attraktivität des rBM System über in-vivo-Modellen liegt in der Transparenz des Systems, wenn die Interaktionen, die nicht in vivo aufgrund der Beschränkungen der Abbildungstechniken sehen kann leicht zerlegt werden. Die rBM System stellt ein Medium für die einfache Manipulation von Komponenten unter Wahrung des Gesamtgewebezusammensetzung, so dass die Forscher die molekularen Mechanismen untersucht sezieren. Darüber hinaus hat die rBM System als kostengünstige Weise bestätigt worden, im Vergleich zu in vivo-Tests, um vorklinische Untersuchungen neuartiger Therapeutika 8,12 durchzuführen. Zusammengenommen stellt der rBM Modell ein System, wo viele Aspekte der Gewebebiologie können ex vivo mit primären Proben untersucht werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine Interessenskonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award der American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53), an die Purdue University Center for Cancer finanziert Forschung, und die kanadischen Institutes of Health Research und dem Alberta Cancer Research Initiatives Vorstand Programm. MP wurde von der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Internship Program unterstützt (R25CA128770; PI: D. Teegarden) durch die Onkologische Sciences Center und dem Discovery-Learning Research Center an der Purdue University, verabreicht.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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