Summary
Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.
Abstract
Doku kültürü, normal geliştirme hastalığı, hücre fonksiyonunda birçok yönlerini incelemek için paha biçilmez bir araç olmuştur. Geleneksel yöntemler, bir hücre kültürü, doku kültürü çanağı, bir katı alt döküm takmak ya da sıvı bir ortam içinde süspansiyon içinde büyümeye ya da hücrelerin kabiliyetine dayanır. Birden fazla ölümsüz hücre çizgileri birincil hücreler ex vivo büyümüş olması gerekir, ancak, bu yöntemler genellikle başarısız oluşturulur ve bu tür yaklaşımlar kullanılarak büyütülmüştür. Bu başarısızlık plastik doku kültürü, hücre büyümesi için bir yüzey olarak kullanılan standart sistemlerden doku mikro uygun hücre dışı matris bileşenlerinin yokluğunda atfedilmiştir. Hücre dışı matriks doku mikro ayrılmaz bir bileşeni olan ve bunun varlığı, hücre polarizasyon, hayatta kalma ve proliferasyon gibi fizyolojik fonksiyonların korunması için çok önemlidir. Burada bir 3 boyutlu doku kültürü yöntemi primer kemik iliği cel sunmakls, insan kemiği (RBM sistemi) mikro özetlemek için formüle hücre dışı matris içinde büyütülür. Hücre dışı matris içinde gömülü hücreler, böylece birincil dokusunun hücresel bileşimi korurken, hücre hayatta kalması ve çoğalması kadar 30 gün boyunca sürekli olabilir kapsamlı bir sistem sağlamaktadır, insan plazması ile desteklenmiş ortam boyunca besin ile temin edilmektedir. RBM sistemi kullanarak başarıyla normal donörlerin ve hastaların amiloidoz ile, ve çeşitli hematolojik maligniteler primer kemik iliği hücrelerini büyüdü. RBM sistemi yeni terapötiklerin klinik öncesi etki hücre davranış ve değerlendirme doğrudan, in-matris gerçek zamanlı görüntülenmesi için izin verir. Ayrıca, hücreler RBM izole edilir ve daha sonra in vivo nakli, hücre sıralama, akış sitometrisi, ve nükleik asit ve protein analizi için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, RBM yöntem primer kemik Marro büyümesi için güvenilir bir sistem sağlarfizyolojik koşullar altında w hücreleri.
Introduction
Doku kültürü dokunulmamış organizmalar çeşitli işlemleri karşılaştırırken sistemik değişkenliği en aza indirmek için, bir kontrollü bir ortamda hücre davranışını incelemek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, ilk olarak 1900'lerin başında 1,2 kurulan ve doku eksplantlar bir cam tabak içinde ex vivo kültürlenmiş bir teknik anlamına gelir edildi. 1900'lü yılların ortalarında sistem oldukça sağlam dokuların parçaları daha dağınık hücreleri büyümek için uyarlanmış ve terimleri 'doku kültürü' ve 'hücre kültürü' 3 eşanlamlı oldu. Bu tür geleneksel hücre kültürü sistemlerinde çeşitli hücre büyüme faktörü ile desteklenmiş büyüme ortamı ile kaplanmış doku kültür plastiğin yüzeyi üzerinde yetiştirilir. Yapışık hücre kültürü, hücre eklemek ve hücrelerin süspansiyon içinde yayılır doku kültürü plastik ve yapışkan olmayan kültürleri, yayılmış: kültürler iki tip çeşitli hücre yapışma kapasitesine göre ortaya çıkmıştır. Hücrenin ilk günlerinden beriKültür, çok ölümsüz hücre çizgileri örneğin HeLa 4, ilk insan kanser hücre çizgisi olarak, yaratılmıştır. Bu hücre hatları, hücre kültürü içinde süresiz olarak çoğalma kapasitesine sahip ve en canlılığını korumak için özel bir muamele gerekmez.
Orijinal hücre kültürü yöntemleri indirgemeci yaklaşım, hücre canlılığı ve çoğalmasını sürdürmek için gereken minimum bileşenleri içerecek şekilde mümkün olduğu kadar sistem basitleştirmek için tasarlanmıştır. Ancak, basitleştirilmiş hücre kültürü yaklaşımlar sonlu ömrü ile ex vivo en temel insan hücre tiplerini desteklemek için başarısız. Bu nedenle, yeni bir kültür sistemleri böylece hücre eksplantlan fizyolojik koşullar altında büyümeye izin, mümkün olduğunca yakından doku mikroçevreyi yaklaştığı dizayn edilmektedir. Geleneksel / indirgemeci yaklaşımlar hücre kültürü, 3 boyutlu (3-D) aksine kültür sistemleri şimdi çeşitli etkin bir kültür için tercih edilen bir yöntem haline gelmektedirinsan hücre hatları ve primer hücreler daha sonra destekleyici bir mikro-bağlamında, sağlık ve hastalık ile ilgili mekanizmaların çalışılmasına. 3-B sistemleri genellikle ilgi hücre türlerini incelemek için doku mikroçevreyi özetlemek amacıyla, büyüme faktörleri ile takviye yeniden matrisler ve / veya orta kullanılarak ayarlanır. Bu 3-boyutlu (3-D) kültür modellerinin ilk meme bezi gelişimini incelemek için geliştirilmiştir. Meme epitelyal hücreleri, Matrigel gömülü olan yerel koşullar, kollajen IV ve hücre dışı matrisin (ECM) laminin-zengin bir kaynak ile hücre sağlamak ve büyüme ortamı ile kaplanmış için. Bu koşullar altında, meme epitelyum hücreleri meme asinüsü benzeyen kümeleri oluşturulmuş ve laktojenik hormonlar ile uyarılması üzerine, bu acininin acininin benzeri yapıların içi boş LUMENA içine, kazein ve diğer süt proteinleri salgılanır. Kazein salgılama bile prolaktin 5 ilave edildikten sonra standart kültürlerde gözlenmedi, Ayrıca hücrelerin morfolojik ve fenotipik özelliklerini koruyarak mikroçevresinin rolünü vurgulayarak. Hücreler fizyolojik mikroçevresinin bağlam dışına alınır, normal hücresel fonksiyonunun kaybı başka gösteri destekleyici mikro olmaksızın, keratinositler tabakalı epidermis 6 oluşturmak için başarısız bir gösteri. Diğer 3-D modellerin bir dizi birincil hücrelerinin ex vivo yayılmasını 7,8 izin yaratılmıştır.
Hücre davranış mikroçevresinin önemli rolü zarif ben matris zaman kollajen kültüre meme epitel hücreleri Matrigel'de oluşmuştur doğru polarize asinüs göre, "iç-dış" asinüsü oluşan bir çalışmada gösterildi. Laminin üreten miyoepitelial hücreler kolajen I 9 kültürlere ilave edildi zaman uygun morfoloji bu kayıp dönülmüştür. Ayrıca, doğru bir mikro-ortam doğru için gereklidirgenotip tezahürüdür. Bir tabak içinde yetiştirilen, bir hücre-hücre yapışma molekülü ile transfekte CEACAM1 MCF7 meme kanseri hücrelerinin transfekte edilmemiş CEACAM negatif hücreleri ile tam olarak aynı şekilde davranır. Ancak, habis olmayan meme epitel 10 ile kurulmuştur gibi CEACAM1 ile transfekte MCF7 hücreleri, oyuk LUMENA normal bir fenotip ve form asinüs dönmek ise ECM, vahşi tip bir şekilde MCF7 tümör benzeri yapılar ile temas halinde, Matrigel kültürlenmiştir. Benzer şekilde, β1-integrin meme kanseri hücrelerinde engelleme standart kültür koşulları altında davranışlarını değiştirmek, ancak 3-D kültürde gerçekleştirilen aynı deney β1-integrin bloke normal bir fenotip 11 malign hücrelerin döner göstermektedir etmez. Bu nedenle, yalnızca doku mikro çevre hücre canlılığını korumak için gerekli değildir, ancak, aynı zamanda, uygun hücre fonksiyonunu korumak için.
Hücre davranış, fizyolojik koşullar altında incelenebilir bir sistem sağlamaya ek olaraks, 3-B kültürleri yeni terapötik 8,12,13 klinik öncesi testleri için olduğu gibi sağlam ve güvenilir orta çalışır. 3-B hücrelerinin kültürlenmesi hücre-hücre ve hücre-ECM yapışmasının katkı değerlendirilebilir çevre aracılığında ilaç direnci 14, koşullarında araştırma bileşiklerin tarama sağlar. Bundan başka, yeni bileşimlerin hedef dışı toksisite çeşitli dokuların birden fazla hücre bölmeleri dahil edilmesi ile tespit edilebilir. Bu tür taramalar daha hızlı gerçekleştirilir ve daha düşük maliyetli bir in vivo 8 karşılaştırılabilir çalışmalara göre girmektedir.
Burada normal ve habis kemik iliği (BM) hücreleri yakından insan BM mikro taklit eden bir sistem içinde ex vivo çoğalan yeniden kemik iliği (RBM) bir 3-D modeli bir kurulum mevcut. BM stroma çeşitli bileşenleri ile 2-B kültürler, sıvı ya da yapışkan cocultures primer insan BM hücrelerinin büyüyen bir önceki girişimlerVeya 3-D, yarı katı agar kültürleri nedeniyle doku mikro 15-18 bileşenleri ile hücre kaynağı kendi yetersizlik sınırlı başarı ile bir araya geldi. Bu sistemlerde birincil BM hücreler kötü canlılığı vardı ve ex vivo çoğalırlar başarısız oldu. İnsan BM progenitör hücrelerin BM stromal hücreleri ile küremsi cocultures yetiştirilen bir başka sistem hematopoetik kök hücre canlılığı ve proliferasyonu, en az 96 saat 19 için sürekli bir 3-D sistemidir. Hematopoietik progenitör biyoloji anlaşılması için son derece faydalı olmasına rağmen, ancak, bu sistem sadık yararlılığını sınırlama, bu nedenle ECM bileşenlerinin bulunmaması nedeniyle DM'nin mikro özetlemek değildir. Burada açıklanan model, insan RBM DM'nin hem hücresel hem de hücre dışı bölme in vitro yeniden inşa edilir kapsamlı bir sistem sunar. Biz RBM kültürleri, normal insan BM hücrelerinin ex vivo büyümesini desteklemek olduğunu göstermektedir bizçeşitli hematolojik hastalıkları olan hastalardan izole edilen hücreler olarak Ll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Advance Hazırlık
- 4 ° C'de steril serolojik pipet ve pipet uçları tutun
Sorun Giderme: oda sıcaklığında (RT) Matrigel jeller, soğuk pipet ve ipuçlarını kullanarak kültür kurulumu sırasında jelleşmesini Matrigel önleyecektir. - Gece boyunca 4 ° C'de Matrigel bir şişe çözülme.
2. Reaktifler hazırlanması
- Fibronektin stok çözeltisinin hazırlanması: damıtılmış su, 100 ml 100 mg insan fibronektin eritilerek fibronektinin bir 1 mg / ml stok çözeltisi olun. En fazla 6 ay boyunca 4 ° C 'de fibronektin çözündükten sonra steril filtre, kısım ve mağaza.
Sorun: fibronektin hızlı bir şekilde çözülür, 37 ° C'de bir su banyosu kümesindeki bir kaç dakika için bir çözüm inkübe etmezse - 10x PBS hazırlanması: 80 g sodyum klorid NaCl, 14.4 g Na 2 HPO 4, 2 g KCI ve 2.4 g KH 2 PO çözündürülür
- Nötralizasyon tampon 20 preparasyonu: 1 M HEPES ve 10x PBS solüsyonları kullanılarak 2 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 100 mM HEPES içeren bir solüsyon yapın. 7.0 çözeltinin pH ayarlayın. 2-3 ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Fare kuyruk kolajeni tip 2 mg / ml eriyiğinin hazırlanması I: nötralizasyon tamponu (adım 2.3) de bir 2 mg / ml kolajen I çözüm olun. Düşük hızda çözüm vorteks ve aşağı yukarı pipetleme ve hafifçe karıştırın. Bu kollajen çok viskoz gibi, pipetleme sırasında hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek. Bu her zaman yeni kolajen I çözelti hazırlamak için tavsiye edilir. Kullanılana kadar buz üzerinde tutun çözeltisi.
- Endosteal kaplama (parçalamak) hazırlanması: 1x & in, 2 mg / ml kolajen I stok (2.1 ve 2.4 'e adımları) 77 ug / ml' lik bir nihai konsantrasyona kadar ve 29 ug / ml ile 1 mg / ml stok, sırasıyla fibronektin karıştırın# 160; steril PBS. Mix ve 1 aya kadar 4 ° C'de saklayın.
- Yeniden kemik matrisi (RBM) hazırlanması:
- Buz üzerinde ön soğutma 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri. Her zaman buz üzerinde bütün matris çözümleri tutun.
- 4 parça Matrigel (Matrigel konsantrasyon çok partiye değişiklik gösterir, ancak önemsiz varyasyonlar olduğu bulunmuştur), 1 mg / ml fibronektin 2.5 parça ve ilk pipetleme Matrigel ile buz üzerinde 2 mg / ml kolajen I halinde 1 parça karıştırın Tüp soğuk pipet uçları kullanılarak ve daha sonra Matrigel 4 ° C üzerinde sıcaklıklarda katılaşan başlar, bu Matrigel pipetleme ise hızlı bir şekilde çalışacak fibronektin ve kollajen I. ekleyin. Kabarcıkları tanıtan önlemek, aşağı yukarı pipetleme ve çok yavaşça matrisi karıştırın. RBM karıştırma sırasında buz üzerinde tüpler tutun.
- Kemik iliği büyüme ortamı (BMGM) hazırlanması: 6.2 x 10 -4 M CaCl2, 10 -6 M sodyum süksinat, 10 -6 M hidrokortizon,% 20 insan plazması içeren (BMGM 500 ml olunRPMI-1640), normal ve sağlıklı vericilerden veya hastalardan toplanan habis ve% 1 penisilin / streptomisin. CaCl2, sodyum süksinat, hidrokortizon ve ek 1000 x stok çözeltiler olarak> 6 ay boyunca -80 ° C'de saklanabilir. Hücre hatları büyüme olduğunda, fetal sığır serumu (FBS), insan plazma için ikame edilebilir.
- % 10 luk nötral tamponlu formalin (NBF) hazırlanması:% 10 v / v de PBS 1x% 37 formaldehit stok solüsyonu ekleyin İyice karıştırın ve ışıksız bir ortamda 2-3 hafta boyunca oda sıcaklığında saklayın.
- % 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlanması: BSA uygun miktarda tartılır ve 1 x PBS içinde çözülür. 4 ° C'de saklayın ve 1 hafta içinde kullanın. BSA çözüm daha uzun süreler için buzdolabında muhafaza edilmesi durumunda kontamine almak eğilimindedir. Seçenek olarak ise, BSA çözeltisi, uzun süreli depolama için parçalara ayrılmış ve -20 ° C de dondurulabilir. Donma-çözülme döngüleri kaçının.
- Hücre elde çözeltisi (CRS) hazırlanması: 5 mM EDTA, 1 mM sodyum vanadat (Na <Yap1x PBS sub> 3 VO 4) ve 1.5 mM sodyum flüorür (NaF) çözeltisi. 6 aya kadar 4 ° C'de steril filtre ve mağaza.
3. Malign olmayan ve Malign İnsan BM Hücreleri Gömülü 3-D Kültürü
- Üreticinin talimatlarına göre Ficoll-Plaque gradyan santrifüj ile primer mononükleer hücreleri BM arındırın.
İsteğe bağlı adım: hücreler kültür süresi boyunca hücre çoğalmasını takip etmek, üretici talimatlarına göre 0,25 uM carboxyfluorescein diasetat süksinimidil ester (CFSE) ile etiketlenebilir.
Sorun Giderme: hücreler CFSE boyama sonra ölürsem, konsantrasyon hücre türüne bağlıdır olarak CFSE miktarını titre; 0.25 mikron birincil BM mononükleer hücreler için iyi çalışır. - 48-çukurlu bir doku kültür plakasının her tedavi oyuğuna parçalamak çözeltisinin 65 ul ekle. Kuyunun tüm yüzeyini kapsayacak şekilde eşit olarak yayıldı ve çözelti> 30 kuluçkalayınoda sıcaklığında min.
- Bir 48-yuvalı plaka içinde çukur başına 1 x PBS içinde 10 ul 0.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda hücre süspansiyonu hazırlayın. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, göz başına RBM matris 100 ul hücre süspansiyonu karıştırılır. Hafifçe aşağı yukarı pipetleme hücreleri ve RBM matris karıştırın; kabarcıkları tanıtan kaçının. Matrisin jelleşmesini önlemek için buz üzerinde hücre / matris karışımı tutun.
Not: RBM sistemi tam olarak ölçeklenebilir, kullanılan plakanın yüzey alanına dayalı tüm reaktifleri (matrisler ve orta) miktarlarını ayarlamak olmayan bir 48-çukurlu formatta, sistemi kurmak için. Buna göre kaplama için hücre sayısını Scale. - Kalan parçalamak aspire ve bir kuyunun merkezi haline hücre / matris karışımı ekleyin. Hızlı, eşit kuyunun bütün yüzeyini kapsayacak şekilde hücre / matris karışımı yayıldı. 37 ° C de 30-60 dakika için plakayı,% 5 CO2 doku kültürü kuluçka makinesi matris katılaşmaya izin vermek. Sallamayın ya da dis etmeyinKuluçka sırasında plakayı TURB.
Sorun Giderme: RBM hücrelerin eşitsiz dağılımını önlemek kaplama için de önce karıştırın. Her 5. de tüpün altına yerleşen hücreleri önlemek için kaplama sonrası karıştırın. Bir kez kaplama, hücreler, matris içinde yüzey gerilimi nedeniyle kuyunun dibine çöker yoktur.
Sorun Giderme: RBM hücrelerin eşitsiz dağılımını önlemek kaplama için de önce karıştırın. Her 5. de tüpün altına yerleşen hücreleri önlemek için kaplama sonrası karıştırın. Bir kez kaplama, hücreler, matris içinde yüzey gerilimi nedeniyle kuyunun dibine çöker yoktur. - Bir su banyosu içinde ön ısıtılması BMGM 37 ° C olarak ayarlanmış
- 30 dakika sonra, matris doğru ayarlanmış olduğunu kontrol edin, bu plaka hareket ettirildiğinde hareket etmiyor tabakası gibi yumuşak bir jel oluşturur. Sıcak BMGM 1 ml hücre / matris katmanı kaplar. Çok nazikçe matris pipet orta yırtılmasını önlemek için kullanıyor (drop-by-damla dağıtım)serolojik bir pipet. 37 ° C, istenilen süre boyunca% 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe ve kültür içine monte RBM kültür yerleştirin.
Not: Hücre canlılığı, orta değiştirmeden en az 30 gün boyunca muhafaza edilir; ortam değişim gerekli ise, sadece her zaman ortam% 50 değiştirin.
Kritik adım: Soğuk sıcaklığı önceden ayarlanmış matris rahatsız olabilir gibi orta soğuk olmadığı önemlidir. Bu yumuşak matris katmanı bozabilir de matriks üstüne orta fışkırtma dikkat çekmek.
Sorun: RBM sisteminde hücre canlılığı düşük ise, hücre yoğunluğu BM sıvıda primer mononükleer hücrelerde hem diğer hücrelerde ile çalışırken deneysel olarak tespit edilmesi gerekebilir. Hücre hatları ile birlikte çalışırken, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, primer hücrelerde daha hızlı prolifere olarak, hücre sayısı 10-kat azaltılır.
4. 'In-matris' Görüntüleme
- Resim parlak alan kullanılarak doğrudan RBM olarak kültürlenmiş hücreler, diferansiyel-interferans-kontrast (DIC), konfokal veya matris yaklaşık olarak 1 mm kalınlığında olduğu gibi uzun mesafe görüntüleme izin veren herhangi bir diğer görüntüleme teknikleri. Yukarıdan aşağıya görüntüye tüm kültür mikroskoplar çok üzerinde mevcut Z-yığın özelliğini kullanın.
İpucu: Aşağıdaki immünoboyama protokol boyama / yıkama solüsyonları aspire önlemek için, yerine plakasını eğilme ve bir pipet kullanarak çözüm çıkarın.
- Bir pipet kullanarak BMGM çıkarın ve RT 1x PBS içinde 100 ul / yıkama / well ile 2-3 kez yıkayın. Yeterince PBS kuyunun tüm yüzeyini kapsayacak şekilde kullanıldığından emin olun.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 10 luk NBF (48-çukurlu bir plaka için) 100 ul / yuva eklenerek matris içinde, hücreler. NBF çıkarın ve RT 1x PBS 100 ul / yıkama / kuyu ile iki kez hücreleri yıkayın.
Not: Bu matris sıvılaştırabilen soğuk NBF kullanmaktan kaçının. - , Gece boyunca PBS çıkarın antikorların spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de, 1 saat boyunca% 1 BSA ekleyin.
- Gerekli seyreltme,% 1 BSA içinde primer antikor çözeltisi hazırlayın. Seyreltme üretici ile kontrol veya optimal bir antikor konsantrasyonunu belirlemek için titre, her bir antikor için değişecektir. Primer antikor solüsyonu, 100 ul / oyuk ilave edin ve üreticinin talimatlarına uygun olarak inkübe edin.
Kritik adım: florofor ya da floresan boyalar konjüge edilmiş antikorları içeren tüm inkübasyonlar karanlıkta yapılmalıdır. - Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve 5 dakika için 1 x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Dolaylı immünofloresans boyama için, oda sıcaklığında 1 saat için floresan prob konjüge edilmiş ikincil bir antikor ile inkübe edin. Üretici tarafından önerilen yoğunlukta% 1 BSA içinde antikorların seyreltin.
- Ikincil a çıkarınntibody çözeltisi ve 5 dakika süre ile 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
Sorun: yüksek bir arka plan önlemek için görüntüleme sırasında, floresan konjuge sekonder antikor titre ve yeterli sinyal sağlayan en düşük konsantrasyonu kullanın. Yüksek arka plan hala bir sorun varsa, yıkama adımların sayısını ve süresini artırmak veya doğrudan konjuge primer antikorlar kullanmak ve adımı 4.2.6 atlayın. - Çekirdekleri üretici tarafından önerilen dilüsyonda, ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer boyama çözeltisi 4 eklemek leke ve oda sıcaklığında 7-10 dakika boyunca inkübe etmek.
- Nükleer boyama çözeltisini çıkarın ve 5 dakika süre ile 1x PBS ile 2x yıkayın.
- Son yıkamadan gelen PBS çıkarın ve floresan korumak için numune üzerinde, montaj orta bir damla (normal set) ekleyin. Bir floresan veya konfokal mikroskop uygun uyarma / emisyon ayarları kullanarak görüntü.
Not: Görüntüleme boyama 2 gün içinde yapılmalıdırmatris ve RBM bütünlüğü ve flüoresan sinyal kaybı kaybı bozulmasını önlemek için. Hemen görüntülenmiş Değilse, lekeli örnekleri görüntüleme kadar, ışıktan korunan, 4 ° C'de tutulmalıdır.
5. RBM ikinci Hücre İzolasyonu
- Matris katmanı bozmadan nazikçe orta çıkarın. Aspire etmeyin.
- Yıkama hücreler steril 1 x PBS ile 2x. Aspire etmeyin.
- Her bir oyuğa, buzla soğutulmuş CRS 0.5 ml ilave edilir ve kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleme ile, hücreleri ile birlikte tüm matris çıkartılmamalıdır. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücreleri, matris ve CRS toplayın. Buz üzerine yerleştirin.
- Aynı oyuğuna ilave bir 0.5 mi CRS ekleyin ve geri kalan malzeme toplamak. Aynı mikrosantrifüj tüpüne transfer edin.
- Vortex hücreleri, matris ve CRS karışımı ve 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Vortex hücreleri her 15 dakika matrisinden salınmasını kolaylaştırmak için.
- 1 saat, görünür bir kümeleri sonra karışımın kontrolmatrisin mevcut olması gerekmektedir.
Sorun: matris kümeleri 1 saat sonra hala görünür ise, daha büyük bir boru transfer hücre / matris / CRS kanşımı, CRS ek 2-5 ml ekleyin ve ek bir 30-60 dakika boyunca inkübe edin. - 4 ° C'de 5-10 dakika süreyle 1000 rpm'de CRS Santrifüj hücreleri Süpernatantı ve soğuk 1 x PBS içinde 1 ml hücre pelletini.
- 5-10 dakika 1.000 rpm'de santrifüj ve süpernatant kaldırmak. PBS yıkandıkları bir kez daha tekrarlayın.
- İkinci PBS yıkama matris ve izole edilmiş hücrelerden hücreleri kurtarma sitometresi in vivo nakli, vb akış, DNA / RNA / protein izolasyonu gibi herhangi bir alt uygulamalar için kullanılabilir tamamlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primer kemik iliği hücreleri standart doku kültürü koşulları altında çoğalırlar başarısız yana, RBM sistemi yakından kültürüne bir sistem sağlayarak, kemik mikroçevreyi taklit ve ex vivo BM hücreleri genişletmek için kuruldu. BM dışı matrisin, fibronektin, kolajen I, kolajen IV, laminin ve 21 ana bileşenleri, bu 3-D kültürüne yapısal iskele temin etmek üzere RBM matris içine dahil edilmiştir. Endosteum, kolajen I ve fibronektin zengin kemik ve BM arasında arayüz, bu proteinlerle çalışan bir doku kültürü çanağı yüzeyinin kaplanması ile yeniden inşa edildi. BM içinde birden çok hücre bölmeleri arasındaki çapraz karışma doku genel homeostazı katkıda bulunur. Hücresel bileşenleri hiçbirinin dışında kalan sağlamak için, RBM kültür, insan BM iğne aspirasyon biyopsisi gelen fraksiyonlanmamış mononükleer hücreleri kullanılarak kurulmuştur. Sistem hormonlar, büyüme faktörleri, bir birlikte olduğundan emin olmak içindolaşım ortamında mevcut d sitokinler, kültür ortamı, insan plazma habis olmayan BM hücrelerinin RBM yerleştirildi zaman hastaların plazma habis kültürlere ilave edildi iken (yani, normal vericilerden alınan plazma, ilave edilmiş olan numune kültürlendi tekabül ile takviye edilmiştir hücreleri) (Şekil 1).
BM ve çeşitli hematolojik maligniteler Purdue Üniversitesi ve Alberta Kurumsal Araştırma Kurulları Üniversitesi onayından sonra ve Helsinki Bildirgesi (Tablo 1) uyarınca yazılı onam sonra toplandı sağlıklı donörlerden ve hastalardan alınan kan örnekleri. BM biyopsilerinden izole edilen mononükleer hücreler çoğalmaya ve 30 gün boyunca RBM sistemindeki canlılığı (Şekil 2) sağlamak. RBM matris, 0.5 x 10 6 cells/100μl ait hücre yoğunluğu birincil BM hücrelerinin için en uygun yoğunluk olduğu tespit edilmiştir. Thi ötesindes yoğunluğu zamanla hücre canlılığı ve çoğalması oranları azalan sistemini overcrowds. Hücre-hücre temas sağlam bir hücre büyümesi için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır gibi bir daha düşük yoğunluklu, aynı zamanda sistemin genel sağlık için zararlı olduğu gösterilmiştir. RBM içindeki büyüme carboxyfluorescein diasetat'ın, sukinimidil ester (KAKE) ile hücrelerin etiketlenmesi sonra takip edilebilir. CFSE flüoresans şiddeti her bir hücre bölünmesi, bu nedenle hücre çoğalması mikroskobu ile takip edilebilir ya da zaman içinde akış sitometrisi ile yarıya düşer. Biyopsi örneklerinde 8 mevcuttu gibi Ayrıca, RBM kültürü içinde hücre bölmeleri aynı oranlarda tutulur. Hematopoietik soylarının hücrelere ilave olarak, stromal bölmeler RBM sağlam bir büyüme sergilerler. Alkalin fosfataz mineralleştirici kalsiyum, tartrat dirençli asit fosfataz boyama osteoklastlar, yağ Kırmızı pozitif adipositler ve fibronektin stromal hücreler üretme kapasitesine sahip osteoblastlar ifade endosteum bulunurlar/ RBM sisteminin BM arayüzü (Şekil 3).
Birlikte ele alındığında, veriler, RBM modeli sağlıklı donörlerden ve lösemi, lenfoma, ve çok merkezli miyelom gibi çeşitli hematolojik hastalığı olan hastalardan alınan primer insan hücreleri, BM 30 gün için sürekli ve genişletilebilir bir birinci ex vivo sistem sağladığını gösterir. RBM yerli BM mikro bağlamında, fizyolojik koşullar altında hücre davranışını incelemek için kapsamlı bir model sağlar. Bu sistem, çok sayıda miyelom kanser kök hücrelerinin fenotipi belirlemek için ve habis hücreler ve BM dışı matris arasındaki etkileşimleri hem de kötü huylu hücrelerin ve BM stroma arasındaki çapraz-çalışma için laboratuvar tarafından kullanılmaktadır.
| Tanı | Hücre tipi | Hayatta kalma | |
| Selim | BM | Ilımlı | Ilımlı |
| Amiloidoz | BM | Yüksek | Yüksek |
| Belirlenemeyen monoklonal gamopati | BM | Yüksek | Yüksek |
| PBMC | Hayır | Hayır | |
| Plazmasitom | BM | Yüksek | Yüksek |
| Multipl miyeloma | BM | Yüksek | Yüksek |
| Multipl miyelom | BM | Yüksek | Yüksek |
| PBMC | Hayır | Hayır | |
| MB | Yüksek | Yüksek | |
| Plazma hücreli lösemi | BM | Yüksek | Yüksek |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | High | Yüksek |
| Akut miyelojen lösemi | BM | Yüksek | Yüksek |
| Akut promiyelositik lösemi | BM | Yüksek | Yüksek |
| PBMC | Hayır | Hayır | |
| Akut lenfositik lösemi | BM | Ilımlı | Ilımlı |
| Kronik miyeloid lösemi | BM | Ilımlı | Yüksek |
| Kronik lenfositik lösemi | BM | Düşük | Yavaş |
| PBMC | Hayır | Hayır | |
| Non-Hodgkin lenfoma | BM | Ilımlı | Yavaş |
| PBMC | Hayır | Hayır |
Tablo 1. Yaşam ve RBM kültürlenebilir çeşitli örneklerin çoğalması. Kemik iliği mhücrelerinin (BM) ononuclear, çeşitli habis tanısı sağlıklı donörlerden ve hastalardan alınan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ya da harekete kan numuneleri (MB) RBM kültürlenmiştir. Tablo hücre tipi (yani BM, PBMC, ya MB) ile birlikte RBM kültüre edildi tüm numune türlerini listeler. Hücre hayatta kalma ve RBM içinde çoğalma derecesi belirtilmiştir. BM ve MB RBM sağlam bir büyüme sergilerken, çeşitli Kanserli hastalarda izole PBMCler RBM yaşayabilir değildi.
Şekil 1. 1). Endosteal kaplama (fibronektin, kolajen I (CI)) ve 2) RBM matrisi (fibronektin, kolajen I (CI), kolajen IV (CIV) ve laminin) Not:. RBM kurulum şematik temsili RBM iki aşamadan oluşmaktadır : kollajen IV ve laminin m vardırMatrigel ajor bileşenleri, bu nedenle bu proteinlerin ayrı eklenmesi gereklidir. Bu aşamalar endosteal matrisinin ince kaplamanın üzerine RBM matris / hücre karışımı kaplayan iki adımda ayarlanır. Zaman içinde hücre çoğalmasını izlemek için, hücreler, önceden RBM matris ile karıştırılmadan CFSE ile etiketlenebilir. Kültürün süresi boyunca hücrelerin mikroskobu ile görselleştirilebilir ve Hücre göçü, bir sıcaklık / CO2 kontrol odası ile donatılmış bir mikroskop kullanarak gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Kültür hücrelerinde 14-30 gün matris izole edilmiş ve in vitro ve in vivo prosedürlerde dahil olmak üzere alt analizler, çeşitli tabi sonra. büyük resim görüntülemek için.
Şekil 2. RBM hücresel bölmelerin kendi kendine ayrıştırma zaman akışı. BM hücrelerinin gün belirtilen sayıda RBM yetiştirildi. Stromal elemanları gün 14 ile belirgin hale gelir, ancak erken RBM günde 5 olarak tespit edilebilir. Kültür döneminde, hücre boyunca RBM matris boyunca göç eden ve ayrı kümeler halinde bir araya görülebilir. Malign hücrelerin Kitleler zaman (günde 9-30 arasında küme boyutları karşılaştırmak) üzerinde genişletin. Her zaman noktasında kültürün temsilcisi görünümü ters bir mikroskop (büyütme: 200X) aydınlık alan mikroskobu kullanılarak yakalandı. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Stromal bölmeleri RBM içinde "sağlanır 'vardır. RBM içinde büyümek stromal bileşenlerinin bileşimi değerlendirmek için, RBM matris ve endosteal kaplama arasındaki geçişte fibroblast hücreleri, osteoblastlar, adiposit ve osteoklast özgü morfolojik ve markör ekspresyon için değerlendirildi . (a) fibroblastlar tespit etmek için, hücreler, fibronektin (yeşil) için boyandı, aktin (kırmızı) ve çekirdek (mavi) ve konfokal mikroskop görüntüsü (büyütme: 200X). (b) stromal hücreler morfolojiye sahip olduğu gösterildi lipid damlacıkları görünür bir varlığı ile yüksek alkali fosfataz aktivitesi (b.1) seviyeleri ve Alizarin kırmızı boyama (b.2) ile belirlendiği gibi kalsiyum mineralleştirici yeteneğine sahip preosteoblasts. (c) pozitif boyama ile hücreler göre adipositler olarak tanımlandı arada çok çekirdekli yağ Kırmızı (c.1). (d) Hücreler pr olarak kabul edildieosteoclasts ve tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) (d.1) pozitif bulunmuştur. Parlak alan ve renk (nonfluorescent) görüntüleri bir renkli kamera (büyütme: 200X) ile donatılmış bir inverted mikroskop elde edildi. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RBM modeli BM hücresel kompozisyonu kadar 30 gün boyunca ex vivo korunur kapsamlı bir sistem sağlar. Onların fonksiyonu yakından in vivo bulunan BM mimarisini taklit göre RBM kendini katmanlaştırma yetişen BM hücreler. Ayrıca, bu çoklu miyelom klon 8 genişlemesi için izin veren ilk sistemdir. BM hücrelerinin güçlü büyüme ve kültür genel başarı sağlanması için en önemli adımlar şunlardır: 1)>% 70 canlılığı ve kırmızı kan hücreleri daha çok serbest ile BM hücrelerinin sağlıklı bir nüfus elde etmek için, 2) sağlamak için bu matris bileşenleri iyice karıştırılmış ve hücreler matrisi boyunca homojen olarak dağıtılır, ve 3) bir büyüme ortamı, sisteme ilave edildiğinde matris zarar vermemeye dikkat çekmek için vardır. Habis hücrelerin çoğalmasını sağlam sağlamak için, büyüme ortamı hücre kültür edilmektedir hastanın teşhisi eşleşen insan plazması ile desteklenmiş olmalıdır. Ofark edildi RBM sisteminin ne sınırlama DM'nin stromal bölmesinde olmadan CD34 + hematopoietik kök hücreleri, CD20 + B hücreleri, ve CD138 + plazma hücrelerinin saflaştırılmış popülasyonları destekleme yetersizliğidir.
RBM sistem çok yönlü ve en iyi özel çalışmalar hedeflerinize uygun birçok şekilde modifiye edilebilir. Endotel bölmesi DM'nin ve matris konsantrasyonlarının in vivo makyaj mümkün olduğu kadar yakın bir matris bileşimi getirmek için temin edilebilir BM ve ek hücre dışı matris bileşenlerinin vaskülarizasyonunu taklit etmek için sisteme eklenebilir için ayarlanabilir Her bir matris bileşenlerinin konsantrasyonları 21, değişmiş olabilir hastalık durumlarını yansıtmaktadır. Birincil hücrelerin kültürlenmesi ek olarak, RBM sistem belirli bir hücre popülasyonları arasında hücre-hücre etkileşimini incelemek için çeşitli hücre soyları coculturing için uygundur. Örneğin, sistem kokültür Stroma olarak ayarlanabilirl hücreler endosteal kaplama üzerine plakalanır, hematopoietik hücreler stromal hücrelerin üzerine ilave edilir ve tamamı stromal / kokültürü hematopoietik büyüme ortamı ilk RBM matris ile ve daha sonra kaplama. Aynı zamanda faydalı olanlar, çözünür faktörler hücre davranışını 12 nasıl etkilediği stroma ile şartlandırılmış çeşitli kaynaklardan ya da ortam, plazma dahil etmek için ortam kompozisyonunun değişiklikler olabilir. Sitokinler, büyüme faktörleri, hormonlar ve aynı zamanda, ancak, bir defa bakım RBM hücreleri tarafından salgılanan büyüme idame edildi faktörleri olarak da kültür içinde bütün büyüme ortamı değiştirmek için değil alınır, böylece kaybolabilir olmalı, büyüme ortamına eklenebilir , sistemin genel canlılığını etkileyen. Seferde ortam% 50 kadarının yerini göstermektedir.
RBM sistemi her iki hücre davranışını (örn. çoğalma, canlılığı, göç, vb) çalışma ve gücü değerlendirmek ve yeni bir terapötik hedef dışı etkiler için kullanılabilen8,12 s. Dolayısıyla, bu sistem, mikro-doku özetlemek için ayarlanmış, araştırma ilaçların etkinliği çevre aracılı ilaç direncinin 14 koşulları altında değerlendirilebilir. Canlı hücre gerçek zamanlı mikroskobu kullanarak, tedavinin seyri boyunca hücre canlılığı ölü / canlı boyanması ile tespit edilebilir ve diğer organeller tedavinin etkisi kolayca nüfuz RBM matris çok ticari olarak temin edilebilir bir organel-spesifik boyalar kullanılarak değerlendirilmiştir edilebilir ve alınan-up olan hücreleri tarafından görüntüleme etkileyebilecek önemli arka plan oluşturmadan.
RBM sistemi BM bozuklukları incelemek için bir çok yönlü ve uyumlu modeli sağlar. Standart 2-D kültürleri ile karşılaştırıldığında, örneğin 3-D kültür yönteminin yararı hücreleri basa izole zaman çok etkileşimlerin etkileri cevapsız değildir sağlayarak mikro-doku bağlamında hücre davranışını incelemek için yeteneği olanological çevre ve plastik bir kaba yerleştirilir. In vivo modelleri üzerinde RBM sisteminin itiraz nedeniyle görüntüleme teknikleri sınırlamaları in vivo görülemez etkileşimleri kolayca disseke edilebilir sistemin şeffaflık yatıyor. Araştırmacı, araştırma altındaki moleküler mekanizmaları incelemek için izin verecek şekilde, genel olarak doku bileşimi tutulurken RBM sistem bileşenlerinin kolay manipülasyon için bir ortam sağlamaktadır. Ayrıca, sistem, yeni terapötik RBM 8,12 klinik öncesi çalışmalar yapmak için, in vivo test ile karşılaştırıldığında, düşük maliyetli bir yol olarak doğrulandı. Birlikte ele alındığında, RBM modeli doku biyoloji birçok yönü birinci örnekler kullanılarak ex vivo araştırılabilir bir sistem sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Bakanlığı, Ulusal Kanser Enstitüsü (1R21CA141039), BD Biosciences Araştırma Bursu Ödülü, Kanser için Purdue University Center Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG # 58-006-53), Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından finanse edildi Araştırma ve Sağlık Araştırma ve Alberta Kanser Araştırma Kurulu Girişimleri Programı Kanada Enstitüleri. MP Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Önleme Staj Programı tarafından desteklenmiştir (R25CA128770; PI: D. Teegarden) Onkolojik Bilimler Merkezi ve Purdue Üniversitesi Discovery Öğrenme Araştırma Merkezi tarafından yönetilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
