Summary
मानक संस्कृति तरीकों में कोशिकाओं को उनके मनोवैज्ञानिक वातावरण से बाहर ले जाया जाता है और एक पकवान की प्लास्टिक की सतह पर हो. प्राथमिक मानव अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए हम कोशिकाओं ऊतक के मूल निवासी microenvironment recapitulating परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं, जहां एक 3 डी संस्कृति सिस्टम बनाया.
Abstract
टिशू कल्चर सामान्य विकास से बीमारी के लिए, सेल समारोह के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण किया गया है. पारंपरिक सेल संस्कृति तरीकों एक टिशू कल्चर पकवान की एक ठोस बुनियाद को देते हैं या तरल माध्यम में निलंबन में विकसित करने के लिए या तो कोशिकाओं की क्षमता पर भरोसा करते हैं. एकाधिक अमर सेल लाइनों प्राथमिक कोशिकाओं पूर्व vivo बड़े हो जाने की जरूरत है लेकिन, जब इन तरीकों अक्सर विफल, बनाया है और इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग कर विकसित किया गया है. इस तरह की विफलता टिशू कल्चर प्लास्टिक सेल के विकास के लिए एक सतह के रूप में प्रयोग किया जाता है, जहां मानक सिस्टम से ऊतक microenvironment के उपयुक्त बाह्य मैट्रिक्स घटकों के अभाव को जिम्मेदार ठहराया गया है. बाह्य मैट्रिक्स ऊतक microenvironment का एक अभिन्न अंग है और अपनी उपस्थिति में इस तरह के सेल ध्रुवीकरण, अस्तित्व, और प्रसार के रूप में शारीरिक कार्यों के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम एक 3 आयामी टिशू कल्चर विधि जहां प्राथमिक अस्थि मज्जा सीईएल पेशलोकसभा मानव हड्डी (RBM प्रणाली) का microenvironment पुनरावृत्ति करने के लिए तैयार की बाह्य मैट्रिक्स में बड़े हो रहे हैं. बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेडेड, कोशिकाओं इस प्रकार प्राथमिक ऊतक के सेलुलर संरचना को बनाए रखते हुए सेल अस्तित्व और प्रसार करने के लिए 30 दिनों के लिए निरंतर किया जा सकता है, जहां एक व्यापक प्रणाली प्रदान करने, मानव प्लाज्मा के साथ पूरक मध्यम के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति की जाती है. Rbm सिस्टम का प्रयोग हम सफलतापूर्वक सामान्य दाताओं और रोगियों amyloidosis साथ, और विभिन्न हिमेटोलोजिकल malignancies से प्राथमिक अस्थि मज्जा की कोशिकाओं हो गए हैं. rbm प्रणाली उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के preclinical प्रभावकारिता के सेल व्यवहार और मूल्यांकन की प्रत्यक्ष, में मैट्रिक्स वास्तविक समय दृश्य के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, कोशिकाओं rbm से अलग किया और बाद में vivo में प्रत्यारोपण, सेल छँटाई, प्रवाह cytometry, और न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. साथ में ले ली, RBM विधि प्राथमिक हड्डी MARRO के विकास के लिए एक विश्वसनीय प्रणाली प्रदान करता हैशारीरिक शर्तों के तहत डब्ल्यू कोशिकाओं.
Introduction
टिशू कल्चर बरकरार जीवों में विभिन्न प्रक्रियाओं की तुलना करते समय प्रणालीगत परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक नियंत्रित वातावरण में सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. इस विधि पहली जल्दी 1900 1,2 में स्थापित और ऊतक explants एक गिलास पकवान में पूर्व vivo सुसंस्कृत थे जहां एक तकनीक को संदर्भित करता था. मध्य 1900 के दशक में यह व्यवस्था नहीं बल्कि बरकरार ऊतकों के टुकड़े से छितरी कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुकूलित, और शर्तों 'टिशू कल्चर' और 'सेल कल्चर' 3 पर्याय बन गया था. ऐसे पारंपरिक सेल संस्कृति प्रणालियों में कोशिकाओं विभिन्न वृद्धि कारकों के साथ पूरक मध्यम विकास के साथ मढ़ा टिशू कल्चर प्लास्टिक की सतह पर हो रहे हैं. पक्षपाती सेल संस्कृति, कोशिकाओं देते हैं और कोशिकाओं निलंबन में प्रचारित कर रहे हैं जहां टिशू कल्चर प्लास्टिक और nonadherent संस्कृतियों, पर फैल जहाँ: संस्कृतियों के दो प्रकार के विभिन्न कोशिकाओं के आसंजन क्षमता के आधार पर उभरा है. सेल के शुरुआती दिनों के बाद सेसंस्कृति, कई अमर सेल लाइनों ऐसे हेला 4, पहला मानव कैंसर कोशिका लाइन के रूप में बनाया गया है. ये सेल लाइनों सेल संस्कृति में अनिश्चित काल के लिए पैदा करने के लिए क्षमता है, और सबसे व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए कोई विशेष उपचार की आवश्यकता नहीं है.
मूल सेल संस्कृति तरीकों की न्यूनकारी दृष्टिकोण सेल व्यवहार्यता और प्रसार को बनाए रखने के लिए आवश्यक केवल न्यूनतम घटकों को शामिल करके जितना संभव प्रणाली को सरल बनाने के लिए डिजाइन किया गया था. हालांकि, सरलीकृत सेल संस्कृति दृष्टिकोण परिमित जीवन अवधि के साथ पूर्व vivo सबसे प्राथमिक मानव कोशिका प्रकार का समर्थन करने के लिए असफल. इसलिए, नई संस्कृति प्रणालियों इस प्रकार सेल explants शारीरिक शर्तों के तहत विकसित करने की अनुमति, यथासंभव ऊतक microenvironment अनुमान लगाने के लिए तैयार किया जा रहा. पारंपरिक / न्यूनीकारक सेल संस्कृति दृष्टिकोण, 3 आयामी (3 डी) के विपरीत संस्कृति सिस्टम अब विभिन्न कुशलता संस्कृति के लिए एक पसंदीदा तरीका बनता जा रहे हैंमानव कोशिका लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं बाद में एक सहायक microenvironment के संदर्भ में, स्वास्थ्य और रोग में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के लिए. इस तरह 3 डी सिस्टम आमतौर पर ब्याज की सेल प्रकार का अध्ययन करने के लिए ऊतक microenvironment पुनरावृत्ति करने के लिए, वृद्धि कारकों के साथ पूरक खंगाला matrices और / या माध्यम का उपयोग कर स्थापित कर रहे हैं. इन 3 आयामी (3 डी) संस्कृति मॉडल का पहला स्तन ग्रंथि विकास का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. स्तन उपकला कोशिकाओं Matrigel में एम्बेडेड थे देशी शर्तों, कोलेजन चतुर्थ और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के laminin अमीर स्रोत के साथ कोशिकाओं को प्रदान करते हैं, और मध्यम विकास के साथ मढ़ा है. ऐसी परिस्थितियों के अंतर्गत, स्तन उपकला कोशिकाओं स्तन acini जैसी समूहों का गठन, और दुग्धावण हार्मोन के साथ उत्तेजना पर, इन acini acini संरचनाओं की तरह खोखला lumena में, कैसिइन, और अन्य दूध प्रोटीन स्रावित. कैसिइन स्राव भी प्रोलैक्टिन 5 के बाद इसके अलावा मानक संस्कृतियों में नहीं मनाया गया, आगे कोशिकाओं की रूपात्मक और प्ररूपी विशेषताओं के संरक्षण में microenvironment की भूमिका पर बल. कोशिकाओं को अपनी शारीरिक microenvironment के संदर्भ से बाहर ले जाया जाता है जब सामान्य सेलुलर समारोह के नुकसान का एक और प्रदर्शन सहायक microenvironment के बिना, keratinocytes स्तरीकृत एपिडर्मिस 6 फार्म करने में विफल है कि एक प्रदर्शन है. अन्य 3 डी मॉडल की एक संख्या प्राथमिक कोशिकाओं के पूर्व vivo प्रचार 7,8 अनुमति देने के लिए बनाया गया है.
सेल व्यवहार में microenvironment की महत्वपूर्ण भूमिका सुंदर ढंग से मैं मैट्रिक्स जब कोलेजन में सुसंस्कृत स्तन उपकला कोशिकाओं Matrigel में गठन किया गया है कि सही ढंग से polarized acini की तुलना में, "अंदर बाहर" acini गठन जहां एक अध्ययन में प्रदर्शन किया गया. Laminin उत्पादक myoepithelial कोशिकाओं कोलेजन मैं संस्कृतियों 9 के लिए जोड़ा गया था जब उचित आकारिकी का यह नुकसान लौट रहा था. इसके अलावा, सही microenvironment सटीक के लिए आवश्यक हैजीनोटाइप अभिव्यक्ति. एक थाली में बढ़ी, एक सेल कोशिका आसंजन अणु CEACAM1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट MCF7 स्तन कैंसर की कोशिकाओं untransfected CEACAM नकारात्मक कोशिकाओं के रूप में बिल्कुल वैसा ही व्यवहार करते हैं. हालांकि, जब nonmalignant स्तन उपकला 10 के साथ स्थापित किया गया है के रूप में CEACAM1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट MCF7 कोशिकाओं, खोखले lumena के साथ एक सामान्य phenotype और फार्म acini पर वापस लौटने जबकि ईसीएम, wildtype MCF7 फॉर्म ट्यूमर जैसी संरचनाओं के साथ संपर्क में, Matrigel में सुसंस्कृत. इसी तरह, β1-integrin स्तन कैंसर की कोशिकाओं में अवरुद्ध मानक संस्कृति परिस्थितियों में उनके व्यवहार को बदलने, लेकिन 3 डी संस्कृतियों में प्रदर्शन ही प्रयोग β1-integrin अवरुद्ध एक सामान्य phenotype 11 को घातक कोशिकाओं में बदल जाती दर्शाता है कि नहीं करता है. इसलिए, ऊतक microenvironment केवल सेल व्यवहार्यता बनाए रखने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन यह भी उचित सेल समारोह को बनाए रखने के लिए.
सेल व्यवहार शारीरिक हालत के अधीन अध्ययन किया जा सकता है, जहां एक प्रणाली प्रदान करने के अलावाएस, 3 डी संस्कृतियों उपन्यास चिकित्सा 8,12,13 के preclinical परीक्षण के लिए के रूप में मजबूत और विश्वसनीय मध्यम कार्य करते हैं. 3 डी में संवर्धन कोशिकाओं सेल सेल और सेल ईसीएम आसंजन के योगदान का आकलन किया जा सकता है जहां पर्यावरण की मध्यस्थता दवा प्रतिरोध 14, की शर्तों के तहत investigational यौगिकों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है. इसके अलावा, नए यौगिकों के बंद लक्ष्य विषाक्तता विभिन्न ऊतकों के कई सेलुलर डिब्बों को शामिल करके पता लगाया जा सकता है. इस तरह की स्क्रीन और अधिक तेजी से प्रदर्शन और अधिक लागत प्रभावी विवो 8 में तुलनीय पढ़ाई से किया जा सकता है.
यहाँ हम सामान्य और घातक अस्थि मज्जा (बीएम) कोशिकाओं निकट मानव बी.एम. का microenvironment नकल उतार एक प्रणाली में पूर्व vivo पैदा करना जहां खंगाला अस्थि मज्जा (RBM) के एक 3 डी मॉडल की एक सेटअप प्रस्तुत करते हैं. बी.एम. स्ट्रोमा के विभिन्न घटकों के साथ 2 डी संस्कृतियों, तरल या पक्षपाती cocultures में प्राथमिक मानव बी.एम. कोशिकाओं से बढ़ पर पिछले प्रयास, या 3 डी, अर्द्ध ठोस अगर संस्कृतियों की वजह से ऊतक microenvironment 15-18 के घटकों के साथ कोशिकाओं की आपूर्ति करने में अपनी असमर्थता को सीमित सफलता मिली है. इन पद्धतियों में प्राथमिक बी.एम. कोशिकाओं गरीब व्यवहार्यता था और पूर्व vivo पैदा करना असफल रहा. मानव बी.एम. पूर्वज कोशिकाओं बी.एम. stromal कोशिकाओं के साथ अंडाकार आकृति cocultures में बड़े हो रहे हैं, जहां एक और प्रणाली hematopoietic स्टेम सेल व्यवहार्यता और प्रसार को कम से कम 96 घंटे 19 के लिए निरंतर था जहां एक 3 डी प्रणाली है. Hematopoietic पूर्वज जीव विज्ञान को समझने के लिए अत्यधिक लाभकारी हालांकि, हालांकि, इस प्रणाली ईमानदारी से इसकी उपयोगिता सीमित है, इसलिए, ईसीएम घटकों के अभाव के कारण बी.एम. का microenvironment पुनरावृत्ति नहीं करता है. यहाँ वर्णित rbm मॉडल मानव बी.एम. के दोनों सेलुलर और बाह्य डिब्बों विट्रो में पुनर्निर्मित कर रहे हैं, जहां एक व्यापक प्रणाली प्रस्तुत करता है. हम rbm संस्कृतियों, सामान्य मानव बी.एम. कोशिकाओं के पूर्व vivo विकास का समर्थन कर सकते हैं दिखाने के रूप में हमविभिन्न हिमेटोलोजिकल विकारों के साथ रोगियों से अलग कोशिकाओं के रूप में करूँगा.
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Protocol
1. अग्रिम तैयारी
- 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ सीरम वैज्ञानिक pipettes और विंदुक युक्तियाँ रखें
समस्या निवारण: कमरे के तापमान (आर टी) पर Matrigel जैल, ठंड pipettes और सुझावों का उपयोग संस्कृति सेटअप के दौरान बीच बढ़िया तालमेल से Matrigel कर पाएगा. - 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर Matrigel की एक बोतल पिघलना.
2. अभिकर्मकों की तैयारी
- फ़ाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान की तैयारी: आसुत पानी की 100 मिलीलीटर में 100 मिलीग्राम मानव fibronectin भंग करके fibronectin की एक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान करें. अप करने के लिए 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ़ाइब्रोनेक्टिन भंग कर दिया है, बाँझ फिल्टर, विभाज्य, और दुकान.
समस्या निवारण: फ़ाइब्रोनेक्टिन जल्दी भंग 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान सेट में कुछ मिनट के लिए समाधान सेते नहीं है, तो - 10x पीबीएस की तैयारी: 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड NaCl, 14.4 जी ना 2 4 HPO, 2 जी KCl और 2.4 जी के.एच. 2 पीओ भंग
- बेअसर बफर 20 की तैयारी: 1 एम HEPES और 10x पीबीएस स्टॉक समाधान का उपयोग 2x फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में 100 मिमी HEPES युक्त एक समाधान करें. 7.0 समाधान के पीएच को समायोजित करें. 2-3 महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
- चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार के 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान की तैयारी मैं: बेअसर बफर (2.3 कदम) में 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन मैं समाधान करें. कम गति से समाधान भंवर और नीचे से ऊपर pipetting और धीरे मिश्रण. इस कोलेजन बहुत चिपचिपा है, pipetting जबकि हवाई बुलबुले की पीढ़ी से बचें. यह ताजा हर समय कोलेजन मैं समाधान तैयार करने के लिए सिफारिश की है. उपयोग करें जब तक बर्फ पर समाधान रखें.
- Endosteal कोटिंग (उखड़ना) की तैयारी: 1x और में, 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन मैं शेयर (2.1 और 2.4 कदम) 77 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए और 29 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ 1 मिलीग्राम / एमएल fibronectin शेयर क्रमशः मिक्स# 160; बाँझ पीबीएस. मिक्स और अप करने के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
- खंगाला हड्डी मैट्रिक्स (RBM) की तैयारी:
- बर्फ पर Precool 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों. हर समय बर्फ पर सभी मैट्रिक्स समाधान रखें.
- 4 भागों Matrigel (Matrigel एकाग्रता बहुत कुछ करने के लिए बहुत से भिन्न होता है, लेकिन विविधताओं नगण्य होना पाया गया), 1 मिलीग्राम / एमएल fibronectin की 2.5 भागों और पहली pipetting Matrigel द्वारा बर्फ पर 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन मैं में से 1 भाग मिक्स ट्यूब ठंड पिपेट युक्तियों का उपयोग और फिर Matrigel 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर solidifying शुरू, तो Matrigel pipetting जबकि जल्दी से काम करेंगे फ़ाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन मैं जोड़ें. बुलबुले शुरू करने से बचने, ऊपर और नीचे pipetting और से बहुत धीरे मैट्रिक्स मिलाएं. Rbm जबकि मिश्रण बर्फ पर ट्यूबों रखें.
- अस्थि मज्जा मध्यम विकास (BMGM) की तैयारी: 6.2 x 10 -4 एम 2 CaCl, 10 -6 एम सोडियम succinate, 10 -6 एम hydrocortisone, 20% मानव प्लाज्मा (युक्त BMGM की 500 मिलीलीटरRPMI 1640 में) सामान्य या स्वस्थ दाताओं या रोगियों से एकत्र घातक है, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन. 2 CaCl, सोडियम succinate, और hydrocortisone की खुराक 1,000 एक्स शेयर समाधान के रूप में> 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है. सेल लाइनों से बढ़ रही है, जब भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) मानव प्लाज्मा के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
- 10% तटस्थ बफर formalin (NBF) की तैयारी: 10% वी / वी पर पीबीएस 1x करने के लिए 37% formaldehyde के शेयर समाधान जोड़ें अच्छी तरह मिक्स और प्रकाश से रक्षा 2-3 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर.
- 1% गोजातीय सीरम albumin (BSA) की तैयारी: बीएसए की उचित मात्रा में वजन और 1x पीबीएस में भंग. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और 1 सप्ताह के भीतर का उपयोग करें. बीएसए समाधान लंबी अवधि के लिए प्रशीतित रखा अगर दूषित हो जाता है. वैकल्पिक रूप से, बीएसए समाधान लंबी अवधि के भंडारण के लिए aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर किया जा सकता है. फ्रीज पिघलना चक्र से बचें.
- सेल वसूली समाधान (सीआरएस) की तैयारी: 5 मिमी EDTA, 1 मिमी सोडियम वैनेडेट (ना <बनाओ1x पीबीएस में उप> 3 वीओ 4) और 1.5 मिमी सोडियम फ्लोराइड (NAF) समाधान. 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ फिल्टर और दुकान.
3. Nonmalignant और घातक मानव बी.एम. प्रकोष्ठों के एम्बेडेड 3 डी संस्कृति
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार Ficoll पट्टिका ढाल centrifugation द्वारा प्राथमिक बी.एम. mononuclear कोशिकाओं को शुद्ध.
वैकल्पिक कदम: कोशिकाओं संस्कृति अवधि के दौरान सेल प्रसार का पालन करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार 0.25 माइक्रोन carboxyfluorescein Diacetate, succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ लेबल किया जा सकता है.
समस्या निवारण: कोशिकाओं CFSE धुंधला के बाद मर जाते हैं, एकाग्रता सेल प्रकार पर निर्भर करता है के रूप में CFSE की राशि टाइट्रेट, 0.25 माइक्रोन प्राथमिक बी.एम. mononuclear कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है. - एक 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर इलाज थाली में से प्रत्येक कुएं में उखड़ना समाधान के 65 μl जोड़ें. अच्छी तरह से पूरी सतह को कवर करने के लिए समान रूप से समाधान बिखरा हुआ है और> 30 के लिए सेतेआरटी पर मिनट.
- एक 48 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति 1x पीबीएस के 10 μl में 0.5 x 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर सेल निलंबन की तैयारी. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में अच्छी तरह से प्रति RBM मैट्रिक्स के 100 μl के साथ सेल निलंबन मिश्रण. धीरे ऊपर और नीचे pipetting और से कोशिकाओं और RBM मैट्रिक्स मिक्स, बुलबुले शुरू करने से बचें. मैट्रिक्स के बीच बढ़िया तालमेल से बचने के लिए बर्फ पर सेल / मैट्रिक्स मिश्रण रखें.
नोट: RBM प्रणाली पूरी तरह से स्केलेबल है; इस्तेमाल किया प्लेट की सतह क्षेत्र के आधार पर सभी अभिकर्मकों (matrices और मध्यम) की मात्रा समायोजित, एक गैर 48 अच्छी तरह प्रारूप में सिस्टम स्थापित करने के लिए. तदनुसार चढ़ाया जा कोशिकाओं की संख्या को मापें. - शेष उखड़ना Aspirate और एक अच्छी तरह से केंद्र में सेल / मैट्रिक्स मिश्रण जोड़ें. जल्दी से, समान रूप से अच्छी तरह से पूरी सतह को कवर करने के लिए सेल / मैट्रिक्स मिश्रण फैल गया. 37 डिग्री सेल्सियस में 30-60 मिनट के लिए थाली प्लेस, 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर मैट्रिक्स दृढ़ करने की अनुमति देने के लिए. हिला या जिले मत करोऊष्मायन के दौरान प्लेट turb.
समस्या निवारण:, RBM में कोशिकाओं के असमान वितरण को रोकने चढ़ाना को अच्छी तरह से पूर्व मिश्रण करने के लिए. हर 5 वीं अच्छी तरह से ट्यूब के नीचे बसने कोशिकाओं से बचने के लिए चढ़ाया बाद मिलाएं. एक बार चढ़ाया, कोशिकाओं मैट्रिक्स में तनाव के कारण सतह अच्छी तरह से नीचे सिंक नहीं है.
समस्या निवारण:, RBM में कोशिकाओं के असमान वितरण को रोकने चढ़ाना को अच्छी तरह से पूर्व मिश्रण करने के लिए. हर 5 वीं अच्छी तरह से ट्यूब के नीचे बसने कोशिकाओं से बचने के लिए चढ़ाया बाद मिलाएं. एक बार चढ़ाया, कोशिकाओं मैट्रिक्स में तनाव के कारण सतह अच्छी तरह से नीचे सिंक नहीं है. - एक पानी के स्नान में Prewarm BMGM 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट
- 30 मिनट के बाद, मैट्रिक्स ठीक तरह से स्थापित किया गया है कि देखने के लिए जाँच, यह प्लेट झुका हुआ है जब कदम नहीं करता है कि परत की तरह एक नरम जेल बनेगी. गर्म BMGM के 1 मिलीलीटर के साथ सेल / मैट्रिक्स परत ढ़कें. बहुत धीरे मैट्रिक्स पिपेट मध्यम फाड़ से बचने के लिए उपयोग कर (ड्रॉप द्वारा ड्रॉप वितरण)एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक. एक 37 डिग्री सेल्सियस, वांछित समय अवधि के लिए 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर और संस्कृति में इकट्ठे rbm संस्कृति रखें.
नोट: सेल व्यवहार्यता मध्यम बदलने के बिना कम से कम 30 दिनों के लिए रखा जाता है; मध्यम परिवर्तन आवश्यक है, तो केवल हर बार माध्यम के 50% बदल जाते हैं.
महत्वपूर्ण कदम: यह ठंडा तापमान पहले से ही सेट मैट्रिक्स परेशान हो सकता है के रूप में मध्यम ठंड नहीं है कि महत्वपूर्ण है. यह नरम मैट्रिक्स परत टूट सकता है पर मैट्रिक्स के शीर्ष पर मध्यम धार नहीं ख्याल रखना.
समस्या निवारण: RBM प्रणाली में सेल व्यवहार्यता कम है, तो सेल घनत्व बी.एम. रेस्पायरेट्रस से प्राथमिक mononuclear कोशिकाओं की तुलना में अन्य कोशिकाओं के साथ काम जब प्रयोगात्मक निर्धारित किया जा सकता है. सेल लाइनों के साथ काम करते समय अमर सेल लाइनों प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में तेजी से पैदा करना, के रूप में, सेल संख्या 10 गुना कम होती है.
4. 'में मैट्रिक्स' इमेजिंग
- छवि उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग सीधे rbm में संवर्धित कोशिकाओं, अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी), confocal या मैट्रिक्स लगभग 1 मिमी मोटी है के रूप में लंबी दूरी की इमेजिंग की अनुमति है कि किसी भी अन्य इमेजिंग तकनीक. ऊपर से नीचे तक छवि को पूरी संस्कृति सूक्ष्मदर्शी से कई पर उपलब्ध Z-ढेर सुविधा का उपयोग करें.
सुझाव: नीचे immunostaining प्रोटोकॉल धुंधला / वाशिंग समाधान aspirating से बचने के लिए, बजाय थाली झुकाव और एक पिपेट का उपयोग कर समाधान निकालने के लिए.
- एक पिपेट का उपयोग करके BMGM निकालें और आरटी 1x पीबीएस के 100 μl / धो / अच्छी तरह से साथ 2-3X धो लो. पर्याप्त पीबीएस अच्छी तरह से पूरी सतह को कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि सुनिश्चित करें.
- आरटी पर 15 मिनट के लिए 10% NBF की (एक 48 अच्छी तरह से थाली के लिए) 100 μl / अच्छी तरह से जोड़कर मैट्रिक्स में कोशिकाओं को ठीक करें. NBF निकालें और आरटी 1x पीबीएस के 100 μl / धो / अच्छी तरह से कोशिकाओं को दो बार धो लो.
नोट: यह मैट्रिक्स दव्र सकता है के रूप में ठंड NBF प्रयोग से बचें. - , पीबीएस निकालें रातोंरात एंटीबॉडी के अविशिष्ट बंधन ब्लॉक करने के क्रम में आरटी पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 1% BSA जोड़ने.
- आवश्यक कमजोर पड़ने पर 1% BSA में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है. कमजोर पड़ने निर्माता के साथ जांच या इष्टतम प्रतिरक्षी एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए टाइट्रेट, प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अलग अलग होंगे. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μl / अच्छी तरह से जोड़ें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेते हैं.
महत्वपूर्ण कदम: fluorophores या फ्लोरोसेंट रंगों संयुग्मित एंटीबॉडी से जुड़े सभी incubations अंधेरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. - प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 3x धो लो.
- अप्रत्यक्ष immunofluorescence धुंधला के लिए, आरटी पर 1 घंटे के लिए फ्लोरोसेंट जांच संयुग्मित एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. निर्माता ने सुझाव दिया है एकाग्रता में 1% BSA में एंटीबॉडी पतला.
- माध्यमिक एक निकालेंntibody समाधान और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 3x धो लो.
समस्या निवारण: उच्च पृष्ठभूमि से बचने के लिए इमेजिंग के दौरान, fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी टाइट्रेट और पर्याप्त संकेत देता है कि सबसे कम एकाग्रता का उपयोग करें. उच्च पृष्ठभूमि अभी भी एक मुद्दा है, तो धोने कदम की संख्या और अवधि बढ़ाने, या सीधे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग, और कदम 4.2.6 छोड़. - नाभिक निर्माता द्वारा सुझाए कमजोर पड़ने पर, ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) परमाणु धुंधला समाधान 4 जोड़ने के दाग, और आरटी पर 7-10 मिनट के लिए सेते हैं.
- परमाणु धुंधला समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 2x धो लो.
- पिछले धोने से पीबीएस निकालें और प्रतिदीप्ति संरक्षित करने के लिए नमूना पर, बढ़ते मध्यम की एक बूंद (नियमित सेट) जोड़ें. एक फ्लोरोसेंट या confocal खुर्दबीन पर उचित उत्तेजना / उत्सर्जन सेटिंग्स का उपयोग कर छवि.
नोट: इमेजिंग धुंधला के 2 दिनों के भीतर किया जाना चाहिएमैट्रिक्स और rbm अखंडता और फ्लोरोसेंट संकेत के नुकसान के नुकसान की गिरावट से बचने के लिए. तुरंत imaged यदि नहीं, तो दाग नमूनों इमेजिंग तक, प्रकाश से सुरक्षित, 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए.
5. Rbm से कोशिकाओं के अलगाव
- मैट्रिक्स परत परेशान बिना धीरे मध्यम निकालें. महाप्राण मत करो.
- धो कोशिकाओं बाँझ 1x पीबीएस के साथ 2x. महाप्राण मत करो.
- प्रत्येक अच्छी तरह से ठंडा सीआरएस की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और सख्ती ऊपर और नीचे pipetting और से, कोशिकाओं के साथ साथ पूरे मैट्रिक्स परत को हटा दें. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं, मैट्रिक्स, और सीआरएस लीजिए. बर्फ पर रखें.
- एक ही अच्छी तरह से करने के लिए एक अतिरिक्त 0.5 मिलीलीटर सीआरएस जोड़ें और सभी शेष सामग्री इकट्ठा. एक ही microcentrifuge ट्यूब पर स्थानांतरण.
- भंवर कोशिकाओं, मैट्रिक्स, और सीआरएस के मिश्रण और 1hr के लिए बर्फ पर सेते हैं. भंवर कोशिकाओं हर 15 मिनट मैट्रिक्स से रिहाई की सुविधा के लिए.
- 1 घंटा, नहीं दिखाई clumps के बाद मिश्रण की जाँच करेंमैट्रिक्स का मौजूद होना चाहिए.
समस्या निवारण: मैट्रिक्स के clumps 1 घंटा के बाद अभी भी दिखाई दे रहे हैं, तो एक बड़ा ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण / मैट्रिक्स / सीआरएस मिश्रण, सीआरएस की अतिरिक्त 2-5 मिलीलीटर जोड़ने, और एक अतिरिक्त 30-60 मिनट के लिए सेते हैं. - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए 1000 rpm पर सीआरएस में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंड 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
- 5-10 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें. पीबीएस धोने एक और बार दोहराएँ.
- दूसरी पीबीएस धोने मैट्रिक्स और अलग कक्षों से कोशिकाओं की वसूली, cytometry में vivo प्रत्यारोपण, आदि प्रवाह, डीएनए / आरएनए / प्रोटीन अलगाव के रूप में किसी भी बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पूरा करता है.
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Representative Results
प्राथमिक अस्थि मज्जा की कोशिकाओं मानक टिशू कल्चर परिस्थितियों में पैदा करना असफल चूंकि, RBM प्रणाली बारीकी संस्कृति के लिए एक प्रणाली प्रदान करने, हड्डी microenvironment नकल और पूर्व vivo बी.एम. कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए बनाया गया था. बी.एम. बाह्य मैट्रिक्स, fibronectin, कोलेजन मैं, कोलेजन चतुर्थ, और laminin 21 के प्रमुख घटक, यह 3 डी संस्कृति के लिए संरचनात्मक पाड़ प्रदान करने के लिए RBM मैट्रिक्स में शामिल थे. अन्तर्स्थिकला, कोलेजन मैं और fibronectin में अमीर हड्डी और बीएम, बीच इंटरफेस, ये प्रोटीन के साथ एक टिशू कल्चर पकवान की सतह कोटिंग से खंगाला गया था. बी.एम. के भीतर कई सेलुलर डिब्बों के बीच crosstalk ऊतक के समग्र होमियोस्टेसिस लिए योगदान देता है. सेलुलर घटकों की है कि कोई भी बाहर छोड़ दिया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए, RBM संस्कृति मानव बी.एम. सुई महाप्राण बायोप्सी से unfractionated mononuclear कोशिकाओं का उपयोग कर स्थापित किया गया था. प्रणाली हार्मोन, वृद्धि कारक है, एक साथ आपूर्ति की है कि यह सुनिश्चित करने के लिएसंचार वातावरण में मौजूद डी साइटोकिन्स, संस्कृति के माध्यम से मानव प्लाज्मा nonmalignant बी.एम. कोशिकाओं rbm में रखा गया है जब मरीजों से प्लाज्मा घातक की संस्कृतियों को जोड़ा गया है, जबकि (यानी सामान्य दाताओं से प्लाज्मा, जोड़ा गया है नमूना सुसंस्कृत किया जा रहा है इसी के साथ पूरक गया था कोशिकाओं) (चित्रा 1).
बी.एम. और विभिन्न हिमेटोलोजिकल malignancies पर्ड्यू विश्वविद्यालय और अलबर्टा संस्थागत अनुसंधान बोर्ड के विश्वविद्यालय से अनुमोदन के बाद और हेलसिंकी की घोषणा (तालिका 1) के अनुसार लिखित सूचित सहमति के बाद एकत्र किए गए थे के साथ स्वस्थ दाताओं और रोगियों से रक्त के नमूनों. बी.एम. बायोप्सी से अलग mononuclear कोशिकाओं को पैदा करना और करने के लिए 30 दिनों के लिए rbm प्रणाली में उनकी व्यवहार्यता (चित्रा 2) बनाए रखें. RBM मैट्रिक्स के 0.5 x 10 6 cells/100μl की सेल एकाग्रता प्राथमिक बी.एम. कोशिकाओं के लिए अधिकतम घनत्व होने के लिए निर्धारित किया गया है. थी परे जा रहे हैंघनत्व समय के साथ सेल व्यवहार्यता और प्रसार दर में कमी प्रणाली overcrowds. सेल सेल संपर्कों एक मजबूत सेल के विकास के लिए महत्वपूर्ण सिद्ध कर दिया है के रूप में एक कम घनत्व भी प्रणाली के समग्र हीथ के लिए हानिकारक हो दिखाया गया है. Rbm भीतर विकास carboxyfluorescein Diacetate, succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के बाद पीछा किया जा सकता. CFSE प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रत्येक कोशिका विभाजन, इस प्रकार सेल प्रसार माइक्रोस्कोपी से लगाया जा सकता है या समय के साथ प्रवाह cytometry के साथ आधा कर देगा. बायोप्सी नमूनों 8 में उपस्थित थे के रूप में इसके अलावा, RBM संस्कृति के भीतर सेलुलर डिब्बों में उसी अनुपात में बनाए रखा है. Hematopoietic प्रजातियों की कोशिकाओं के अलावा, stromal डिब्बों rbm में मजबूत वृद्धि दिखा रहे हैं. Alkaline फॉस्फेट mineralizing कैल्शियम, tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट धुंधला osteoclasts, तेल लाल सकारात्मक adipocytes, और fibronectin stromal कोशिकाओं के उत्पादन में सक्षम अस्थिकोरक व्यक्त अन्तर्स्थिकला में पाए जाते हैं/ Rbm प्रणाली के बीएम इंटरफेस (चित्रा 3).
साथ में ले ली, हमारे डेटा rbm मॉडल स्वस्थ दाताओं और ऐसे ल्यूकेमिया, लिम्फोमा, और एकाधिक myeloma के रूप में विभिन्न हिमेटोलोजिकल malignancies के साथ रोगियों से प्राथमिक मानव बी.एम. कोशिकाओं को 30 दिनों के लिए निरंतर और विस्तारित किया जा सकता है, जहां पहली बार एक पूर्व vivo प्रणाली प्रदान करता है कि प्रदर्शित करता है. rbm देशी बी.एम. microenvironment के संदर्भ में शारीरिक शर्तों के तहत सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक मॉडल उपलब्ध कराता है. इस प्रणाली के कई मायलोमा कैंसर स्टेम कोशिकाओं के phenotype की पहचान करने के लिए और घातक कोशिकाओं और बीएम बाह्य मैट्रिक्स के बीच बातचीत के साथ ही घातक कोशिकाओं और बीएम स्ट्रोमा के बीच परस्पर बात का अध्ययन करने के लिए हमारी प्रयोगशाला द्वारा इस्तेमाल किया गया है.
| निदान | सेल प्रकार | उत्तरजीविता | |
| Nonmalignant | बी.एम. | मध्यम | मध्यम |
| यह एक ऐसा रोग है जिसमें एमाइलॉयड कोशिकाओं से बाहर ऊतकों एवं अंगों में जमा हो जाता है | बी.एम. | उच्च | उच्च |
| अनिर्धारित महत्व के मोनोक्लोनल gammopathy | बी.एम. | उच्च | उच्च |
| PBMC | नहीं | नहीं | |
| Plasmacytoma | बी.एम. | उच्च | उच्च |
| एकाधिक myeloma सुलगनेवाला | बी.एम. | उच्च | उच्च |
| मल्टीपल मायलोमा | बी.एम. | उच्च | उच्च |
| PBMC | नहीं | नहीं | |
| एमबी | उच्च | उच्च | |
| प्लाज्मा सेल ल्यूकेमिया | बी.एम. | उच्च | उच्च |
| Waldenstroms macroglobulenemia | बी.एम. | Higज | उच्च |
| तीव्र माइलोजेनस ल्यूकेमिया | बी.एम. | उच्च | उच्च |
| घातक प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया | बी.एम. | उच्च | उच्च |
| PBMC | नहीं | नहीं | |
| तीव्र lymphocytic लेकिमिया | बी.एम. | मध्यम | मध्यम |
| पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया | बी.एम. | मध्यम | उच्च |
| पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया | बी.एम. | निम्न | धीरे |
| PBMC | नहीं | नहीं | |
| गैर Hodgkin लिंफोमा | बी.एम. | मध्यम | धीरे |
| PBMC | नहीं | नहीं |
तालिका 1. जीवन रक्षा और rbm में सुसंस्कृत विभिन्न नमूनों का प्रसार. अस्थि मज्जा एमकोशिकाओं (बीएम) ononuclear, विभिन्न malignancies के साथ का निदान स्वस्थ दाताओं और रोगियों से परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC), या जुटाए रक्त के नमूने (एमबी) rbm में सुसंस्कृत थे. तालिका सेल प्रकार (यानी बी.एम., PBMC, या एमबी) के साथ rbm में सुसंस्कृत थे कि सभी नमूना प्रकार सूचीबद्ध करता है. सेल अस्तित्व और rbm में प्रसार की हद तक ध्यान दिया जाता है. बी.एम. और एमबी rbm में मजबूत विकास का प्रदर्शन करते हुए विभिन्न malignancies के साथ रोगियों से अलग PBMCs rbm में व्यवहार्य नहीं थे.
चित्रा 1. 1.) Endosteal कोटिंग (फ़ाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन मैं (सीआई)) और 2) RBM मैट्रिक्स (फ़ाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन मैं (सीआई), कोलेजन चतुर्थ (CIV) और laminin) नोट:. Rbm सेटअप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व rbm दो चरणों के होते हैं : कोलेजन चतुर्थ और laminin मी हैंMatrigel की ajor घटकों, इस प्रकार इन प्रोटीनों की कोई अलग से इसके लिए आवश्यक है. इन चरणों endosteal मैट्रिक्स की पतली परत के शीर्ष पर RBM मैट्रिक्स / सेल मिश्रण overlaying द्वारा दो चरणों में स्थापित कर रहे हैं. समय के साथ सेल प्रसार का पालन करने के लिए, कोशिकाओं पूर्व RBM मैट्रिक्स के साथ मिश्रण करने के लिए CFSE के साथ लेबल किया जा सकता है. संस्कृति की अवधि के दौरान, कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं और सेल प्रवास एक तापमान / सीओ 2 नियंत्रित चैम्बर से लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता. संस्कृति कोशिकाओं में 14-30 दिनों मैट्रिक्स से अलग और इन विट्रो और इन विवो प्रक्रियाओं में दोनों सहित बहाव के विश्लेषण की एक किस्म के अधीन किया जा सकता है के बाद. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. Rbm में सेलुलर डिब्बों की आत्म - अलगाव के समय के पाठ्यक्रम. बी.एम. कोशिकाओं दिनों का संकेत दिया संख्या के लिए rbm में बड़े हो रहे थे. Stromal तत्वों 14 दिन से स्पष्ट हो गया है, लेकिन रूप में जल्दी rbm में सुबह 5 के रूप में पता लगाया जा सकता है. संस्कृति अवधि कोशिकाओं के पाठ्यक्रम पर RBM मैट्रिक्स के माध्यम से पलायन और अलग समूहों में कुल देखा जा सकता है. घातक कोशिकाओं की जनता समय (सुबह 9-30 के बीच क्लस्टर आकार की तुलना) से अधिक का विस्तार. हर समय बिंदु पर संस्कृति का प्रतिनिधि देखें एक औंधा माइक्रोस्कोप (बढ़ाई: 200X) पर उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिया गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. Stromal डिब्बों rbm भीतर 'आपूर्ति' कर रहे हैं. Rbm में विकसित हो जाना कि stromal घटकों की रचना का मूल्यांकन करने के लिए, RBM मैट्रिक्स और endosteal कोटिंग के बीच संक्रमण पर कोशिकाओं fibroblast, अस्थिकोरक, वसाकोशिका, और अस्थिशोषक विशेष आकारिकी और मार्कर अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकन किया गया, . (एक) fibroblasts का पता लगाने के लिए, कोशिकाओं fibronectin (हरा) के लिए दाग रहे थे, actin (लाल), और नाभिक (नीला) और एक confocal खुर्दबीन पर imaged (बढ़ाई: 200X). (ख) स्ट्रोमल आकारिकी साथ कोशिकाओं को दिखाया गया है लिपिड बूंदों के एक दृश्य उपस्थिति के साथ उच्च alkaline फॉस्फेट गतिविधि (B.1) का स्तर और Alizarin लाल धुंधला (B.2) द्वारा निर्धारित रूप में कैल्शियम mineralizing में सक्षम के साथ preosteoblasts. (ग) कक्ष सकारात्मक धुंधला के साथ पर आधारित adipocytes के रूप में पहचान की गई कभी कभी कई नाभिक के साथ तेल लाल (C.1). (डी) कक्ष जनसंपर्क के रूप में पहचाना गयाeosteoclasts और tartarate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) (D.1) के लिए सकारात्मक थे. उज्ज्वल क्षेत्र और रंग (nonfluorescent) छवियों को एक रंग कैमरा (बढ़ाई: 200X) के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप पर हासिल किया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
rbm मॉडल बी.एम. के सेलुलर संरचना करने के लिए 30 दिनों के लिए पूर्व vivo बनाए रखा है, जहां एक व्यापक प्रणाली प्रदान करता है. उनके कार्य को बारीकी से vivo में पाया बी.एम. वास्तुकला की नकल उतार के अनुसार rbm स्वयं विभक्त में उगाई बी.एम. कोशिकाओं. इसके अलावा, यह एकाधिक myeloma क्लोन 8 के विस्तार के लिए अनुमति देता है कि पहली प्रणाली है. बी.एम. कोशिकाओं की मजबूत विकास और संस्कृति के समग्र सफलता सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1)> 70% व्यवहार्यता और लाल रक्त कोशिकाओं के ज्यादातर मुक्त साथ बी.एम. कोशिकाओं की एक स्वस्थ आबादी प्राप्त करने के लिए, 2) सुनिश्चित करने के लिए कि मैट्रिक्स घटकों अच्छी तरह मिलाया जाता है और कोशिकाओं मैट्रिक्स भर में समान रूप से वितरित कर रहे हैं, और 3) मध्यम विकास प्रणाली को जोड़ा जाता है जब मैट्रिक्स नुकसान नहीं ख्याल रखना है कि कर रहे हैं. घातक कोशिकाओं की मजबूत प्रसार सुनिश्चित करने के लिए मध्यम विकास कोशिकाओं जिसका सुसंस्कृत किया जा रहा है रोगी के निदान मिलान मानव प्लाज्मा के साथ पूरक होना चाहिए. हेदेखा गया है कि rbm प्रणाली की पूर्वोत्तर सीमा बी.एम. के stromal डिब्बे बिना CD34 + hematopoietic स्टेम सेल, CD20 + बी कोशिकाओं, और CD138 + प्लाज्मा कोशिकाओं के शुद्ध आबादी का समर्थन करने की अक्षमता है.
rbm प्रणाली अत्यधिक बहुमुखी है और सबसे अच्छा विशिष्ट अध्ययन के लक्ष्यों के अनुरूप करने के लिए कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है. Endothelial डिब्बे बी.एम. और मैट्रिक्स सांद्रता के vivo मेकअप करने के लिए संभव के रूप में बंद मैट्रिक्स संरचना को लाने के लिए आपूर्ति की जा सकती बी.एम. और अतिरिक्त बाह्य मैट्रिक्स घटकों के vascularization की नकल करने की प्रणाली को जोड़ा जा सकता है समायोजित किया जा सकता है व्यक्तिगत मैट्रिक्स घटकों की सांद्रता 21 से बदला जा सकता है, जहां रोग राज्यों को दर्शाते हैं. प्राथमिक संवर्धन कोशिकाओं के अलावा, RBM प्रणाली विशेष सेल आबादी के बीच सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों coculturing के लिए उपयुक्त है. उदाहरण के लिए, सिस्टम एक coculture जहां स्ट्रोमा के रूप में स्थापित किया जा सकता हैएल कोशिकाओं endosteal कोटिंग के ऊपर चढ़ाया जाता है, hematopoietic कोशिकाओं stromal कोशिकाओं के शीर्ष पर जोड़ रहे हैं, और पूरे स्ट्रोमल / hematopoietic coculture मध्यम विकास के साथ पहली RBM मैट्रिक्स के साथ और फिर मढ़ा है. इसके अलावा उपयोगी, घुलनशील कारकों सेल व्यवहार 12 कैसे प्रभावित अध्ययन करने के लिए स्ट्रोमा से वातानुकूलित विभिन्न स्रोतों या माध्यम से प्लाज्मा शामिल करने के लिए मध्यम रचना का संशोधन हो सकता है. साइटोकिन्स, वृद्धि कारक है, और हार्मोन भी हालाँकि, ध्यान एक बार rbm में कोशिकाओं द्वारा secreted गया कि विकास को बनाए रखने के कारक के रूप में संस्कृति के सभी मध्यम विकास की जगह नहीं लिया है, इस प्रकार नष्ट हो सकता है किया जाना चाहिए, विकास के माध्यम से जोड़ा जा सकता है , प्रणाली के समग्र व्यवहार्यता को प्रभावित. हम एक समय में मध्यम से 50% तक की जगह का सुझाव.
rbm प्रणाली दोनों सेल व्यवहार (यानी प्रसार, व्यवहार्यता, प्रवास, आदि) का अध्ययन करने के लिए और शक्ति का आकलन और उपन्यास चिकित्सकीय के बंद लक्ष्य प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है8,12 है. प्रणाली इस प्रकार, ऊतक microenvironment पुनरावृत्ति के लिए सेट है, investigational दवाओं की प्रभावकारिता पर्यावरण की मध्यस्थता दवा प्रतिरोध 14 की परिस्थितियों में मूल्यांकन किया जा सकता. रहने कक्ष वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, उपचार के पाठ्यक्रम पर सेल व्यवहार्यता लाइव / मृत धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और विभिन्न अंगों पर इलाज का असर आसानी RBM मैट्रिक्स घुसना कि कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध organelle विशिष्ट रंगों का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है लिया हुआ रहे कोशिकाओं द्वारा इमेजिंग प्रभावित हो सकता है कि महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि पैदा करने के बिना.
rbm प्रणाली बी.एम. विकारों का अध्ययन करने के लिए एक बहुत बहुमुखी और अनुकूलनीय मॉडल उपलब्ध कराता है. मानक 2 डी संस्कृतियों की तुलना में इस तरह के 3 डी संस्कृति विधि का लाभ कोशिकाओं उनके श्री बुश से अलग कर रहे हैं जब कई मुलाकातों के प्रभाव से चूक नहीं रहे हैं यह सुनिश्चित करना कि ऊतक microenvironment के संदर्भ में सेल व्यवहार का अध्ययन करने की क्षमता में हैological वातावरण और एक प्लास्टिक पकवान में रखा. vivo मॉडल से अधिक rbm प्रणाली की अपील के कारण इमेजिंग तकनीक की सीमाओं को विवो में नहीं देखा जा सकता है कि बातचीत आसानी से विच्छेदित किया जा सकता है, जहां प्रणाली की पारदर्शिता में निहित है. शोधकर्ता जांच के तहत आणविक तंत्र काटना करने की अनुमति इस प्रकार, समग्र ऊतक संरचना को बनाए रखते हुए rbm प्रणाली घटकों के आसान हेरफेर के लिए एक माध्यम प्रदान करता है. इसके अलावा, RBM प्रणाली उपन्यास चिकित्सा 8,12 के preclinical अध्ययन का संचालन करने के लिए, vivo परीक्षण की तुलना में, एक लागत प्रभावी तरीके के रूप में मान्य किया गया है. साथ में ले ली, RBM मॉडल ऊतक जीव विज्ञान के कई पहलुओं को प्राथमिक नमूनों का उपयोग पूर्व vivo जांच की जा सकती है, जहां एक प्रणाली प्रदान करता है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (1R21CA141039), बी.डी. बायोसाइंसेज अनुसंधान अनुदान पुरस्कार, कैंसर के लिए पर्ड्यू विश्वविद्यालय केंद्र के लिए अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान (IRG # 58-006-53) के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया अनुसंधान, और स्वास्थ्य अनुसंधान और अलबर्टा कैंसर बोर्ड अनुसंधान पहल कार्यक्रम की कनाडा के संस्थानों. सांसद के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, कैंसर की रोकथाम इंटर्नशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया (R25CA128770, पीआई: डी. Teegarden) आंकलोजिकल विज्ञान केंद्र और पर्ड्यू विश्वविद्यालय में डिस्कवरी लर्निंग अनुसंधान केंद्र द्वारा प्रशासित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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