Summary
En los métodos de cultivo estándar se toman células de su entorno fisiológico y se hicieron crecer en la superficie de plástico de un plato. Para estudiar el comportamiento de las células de médula ósea humana primaria hemos creado un sistema de cultivo de 3-D, donde las células se cultivan en condiciones que recapitulan el microambiente nativo del tejido.
Abstract
El cultivo de tejidos ha sido una herramienta muy valiosa para estudiar muchos aspectos de la función celular, desde el desarrollo normal a la enfermedad. Métodos de cultivo celular convencionales se basan en la capacidad de las células ya sea para unirse a un sustrato sólido de una placa de cultivo de tejido o para crecer en suspensión en medio líquido. Múltiples líneas celulares inmortales se han creado y crecido utilizando estos enfoques, sin embargo, estos métodos a menudo fallan cuando las células primarias necesitan ser cultivadas ex vivo. Dicha avería se ha atribuido a la ausencia de los componentes de la matriz extracelular apropiadas del microambiente del tejido de los sistemas estándar que se utiliza plástico de cultivo de tejidos como una superficie para el crecimiento celular. La matriz extracelular es un componente integral del microambiente del tejido y su presencia es crucial para el mantenimiento de las funciones fisiológicas tales como la polarización celular, la supervivencia y la proliferación. Aquí presentamos un método de cultivo de tejidos de 3 dimensiones donde cel hueso medular primariaLS se cultivan en matriz extracelular formulado para recapitular el microambiente de la médula humana (sistema de RBM). Incrustado en la matriz extracelular, las células se suministran con nutrientes a través del medio suplementado con plasma humano, proporcionando así un sistema integral donde la supervivencia y la proliferación celular se puede mantener durante hasta 30 días, mientras que el mantenimiento de la composición celular del tejido primario. Usando el sistema de gestión por resultados que hemos crecido con éxito células de médula ósea primarias de donantes sanos y en pacientes con amiloidosis, y diversas neoplasias hematológicas. El sistema de GBR permite, visualización directa en-matriz en tiempo real del comportamiento celular y evaluación de la eficacia preclínica de nuevas terapias. Por otra parte, las células se pueden aislar de la GBR y posteriormente utilizados para el trasplante in vivo, clasificación de células, citometría de flujo, y el ácido nucleico y el análisis de proteínas. En su conjunto, el método de gestión por resultados proporciona un sistema fiable para el crecimiento de huesos primario marrocélulas W en condiciones fisiológicas.
Introduction
El cultivo de tejidos se ha desarrollado para estudiar el comportamiento de células en un entorno controlado para minimizar la variabilidad sistémica cuando la comparación de diversos procesos en organismos intactos. Este método se estableció por primera vez en el 1900 y 1,2 se refiere a una técnica en explantes de tejidos fueron cultivadas ex vivo en un plato de cristal. A mediados de la década de 1900 el sistema fue adaptado para hacer crecer células dispersas en lugar de fragmentos de tejidos intactos, y los términos "cultivo de tejidos" y "cultivo celular" se convirtió en sinónimo de 3. En tales sistemas de cultivo celular convencionales células se cultivan en la superficie del plástico de cultivo de tejidos superpuestos con medio de crecimiento suplementado con varios factores de crecimiento. Dos tipos de culturas han surgido sobre la base de la capacidad de adhesión de varias células: cultivo de células adherentes, donde las células se adhieren y propagan en el plástico de cultivo de tejidos y cultivos no adherentes, donde las células se propagan en suspensión. Desde los primeros días de la célulaSe han creado de cultivo, múltiples líneas de células inmortales, tales como células HeLa 4, la primera línea celular de cáncer humano. Estas líneas celulares tienen la capacidad de proliferar indefinidamente en cultivo celular, y la mayoría no requiere ningún tratamiento especial para mantener la viabilidad.
El enfoque reduccionista de los métodos de cultivo de células original fue diseñado para simplificar el sistema tanto como sea posible mediante la inclusión de sólo los componentes mínimo requerido para mantener la viabilidad celular y la proliferación. Sin embargo, los enfoques de cultivo celular simplificados no apoyan ex vivo la mayoría de los tipos de células humanas primarias con finito vida útil. Por lo tanto, los nuevos sistemas de cultivo están siendo diseñados para aproximar el microambiente del tejido lo más estrechamente posible, permitiendo así que los explantes de células para crecer en condiciones fisiológicas. En contraste con los enfoques de cultivo celular convencionales / reduccionistas, 3 dimensiones (3-D) sistemas de cultivo se están convirtiendo en un método preferido para la cultura de manera eficiente varioslíneas celulares humanas y células primarias para estudiar posteriormente los mecanismos implicados en la salud y la enfermedad, en el contexto de un microambiente de apoyo. Tales sistemas de 3-D se instalan generalmente usando matrices y / o reconstruidos medio suplementado con factores de crecimiento, con el fin de recapitular el microambiente del tejido para estudiar los tipos de células de interés. La primera de estas 3 dimensiones (3-D) modelos de cultivo fue desarrollado para estudiar el desarrollo de la glándula mamaria. Para proporcionar las células con condiciones nativas células epiteliales mamarias fueron incrustados en Matrigel, colágeno IV y laminina-fuente rica de la matriz extracelular (ECM), y sobrepuesto con medio de crecimiento. Bajo tales condiciones, las células epiteliales mamarias forman racimos se asemejan a los acinos mamaria, y a la estimulación con hormonas lactogénicas, estos acinos secretadas caseína, y otras proteínas de la leche, en el hueco lúmenes de las estructuras-acinos similares. La secreción de caseína no se observó en los cultivos estándar, incluso después de la adición de prolactina 5, Enfatizando el papel de microambiente en la preservación de las características morfológicas y fenotípicas de las células. Otra demostración de la pérdida de la función celular normal cuando se toman células fuera del contexto de su microambiente fisiológica es una demostración de que sin microambiente de apoyo, los queratinocitos no pueden formar epidermis estratificada 6. Un número de otros modelos en 3-D han sido creados para permitir la propagación ex vivo de células primarias 7,8.
El papel crucial de la microambiente en el comportamiento de las células se demostró con elegancia en un estudio en el que las células epiteliales mamarias forman "dentro-fuera" acinos cuando se cultiva en el colágeno I de la matriz, en comparación con los acinos polarizado correctamente que se formó en Matrigel. Esta pérdida de la morfología adecuada se revirtió cuando se añadieron las células mioepiteliales laminina productoras a las culturas de colágeno I 9. Por otra parte, se requiere microambiente adecuado para la exactamanifestación genotipo. Se cultiva en un plato, las células de cáncer de mama MCF7 transfectadas con una molécula de adhesión célula-célula CEACAM1 se comportan exactamente igual que las células negativas CEACAM no transfectadas. Sin embargo, cuando se cultivan en Matrigel, en contacto con ECM, forma MCF7 wildtype estructuras de tipo tumoral, mientras que las células MCF7 transfectadas con CEACAM1 revertir a un fenotipo y la forma acinos normal con lúmenes hueco, como se ha establecido con el epitelio mamario maligno 10. Del mismo modo, el bloqueo de β1-integrina en las células de cáncer de mama no cambia su comportamiento bajo condiciones de cultivo estándar, pero el mismo experimento llevado a cabo en cultivos de 3-D demuestra que el bloqueo de β1-integrina vuelve células malignas a un fenotipo normal 11. Por lo tanto, microambiente del tejido no sólo es necesaria para mantener la viabilidad celular, sino también para retener la función apropiada de la célula.
Además de proporcionar un sistema en el comportamiento de la célula puede ser estudiado bajo condiciones fisiológicass, culturas 3-D función de medio tan robusto y fiable para la prueba preclínica de nuevas terapias 8,12,13. El cultivo de las células en 3-D permite el cribado de compuestos en investigación en las condiciones de medio ambiente mediada por resistencia a las drogas 14, donde la contribución de célula-célula y célula-ECM adherencia puede ser evaluada. Además, fuera del objetivo toxicidad de nuevos compuestos puede determinarse mediante la incorporación de múltiples compartimentos celulares de diversos tejidos. Estas pantallas se pueden realizar más rápidamente y son más rentables que los de los estudios comparables en vivo 8.
Aquí les presentamos una configuración de un modelo 3-D de la médula ósea reconstruida (RBM), donde las células de la médula ósea normal y maligno (BM) proliferan ex vivo en un sistema que imita muy de cerca el microambiente de la BM humano. Los intentos previos de cultivo de células primarias BM humanos en cultivos de 2-D, líquido o co-cultivos adherentes con diversos componentes de la BM estromaO 3-D, cultivos de agar semi-sólidos han tenido un éxito limitado debido a su incapacidad para abastecer las células con los componentes del microambiente del tejido 15-18. En estos sistemas de células primarias de BM tenían escasa viabilidad y no lograron proliferar ex vivo. Otro sistema donde las células progenitoras BM humanos se cultivan en co-cultivos de esferoides con células estromales de BM es un sistema de 3-D que se sufrió la viabilidad de células madre hematopoyéticas y la proliferación durante al menos 96 h 19. Sin embargo, aunque altamente beneficioso para la comprensión de la biología progenitoras hematopoyéticas, este sistema no recapitula fielmente el microambiente de la BM debido a la ausencia de componentes de ECM, por lo tanto, limitando su utilidad. El modelo de gestión por resultados descritos aquí presenta un sistema integral donde ambos compartimentos celulares y extracelulares del BM humana se reconstruyen in vitro. Se demuestra que las culturas de gestión por resultados pueden apoyar el crecimiento ex vivo de las células BM humanos normales, como hemosLL como células aisladas de pacientes con diversos trastornos hematológicos.
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Protocol
1. Anticipo para la Preparación
- Mantenga pipetas serológicas estériles y puntas de pipeta a 4 ° C.
Solución de problemas: geles de Matrigel a temperatura ambiente (RT); utilizando pipetas fríos y consejos evitarán Matrigel gelifique durante la configuración de la cultura. - Descongelar una botella de Matrigel en 4 ° C durante la noche.
2. Preparación de los reactivos
- Preparación de la solución de fibronectina existencia: Haga una solución de 1 mg / ml de fibronectina disolviendo 100 mg de fibronectina humana en 100 ml de agua destilada. Una vez que la fibronectina se ha disuelto, filtro estéril, alícuota y almacena a 4 º C durante un máximo de 6 meses.
Solución de problemas: Si la fibronectina no se disuelve rápidamente incubar la solución durante unos minutos en un juego de baño de agua a 37 ° C. - Preparación de 10x PBS: Disolver 80 g de cloruro de sodio NaCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2 g de KCl y 2,4 g de KH 2 PO
- Preparación de tampón de neutralización 20: Hacer una solución que contenía HEPES 100 mM en 2x tampón fosfato salino (PBS) usando 1 M de HEPES y 10x soluciones madre de PBS. Ajustar el pH de la solución a 7,0. Almacenar a 4 ° C durante 2-3 meses.
- Preparación de 2 mg / ml solución de cola de rata colágeno de tipo I: Hacer una solución de 2 mg / ml de colágeno I en el tampón de neutralización (etapa 2.3). Agite la solución a baja velocidad y mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Como este colágeno es muy viscoso, evitar la generación de burbujas de aire, mientras que el pipeteado. Se recomienda preparar la solución de colágeno I fresca cada vez. Guardar la solución en hielo hasta su uso.
- Preparación de recubrimiento endosteal (rend): Mezclar 1 mg / ml de stock fibronectina con 2 mg / ml de colágeno I Stock (pasos 2,1 y 2,4) a una concentración final de 77 mg / ml y 29 mg / ml, respectivamente, en 1x y# 160; PBS estéril. Mezclar y almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes.
- Preparación de la matriz del hueso reconstruido (RBM):
- PreCool 1,5 ml tubos de microcentrífuga en hielo. Mantenga todas las soluciones de la matriz en el hielo en todo momento.
- Mezclar 4 partes de Matrigel (concentración Matrigel varía de lote a lote, pero no se encontraron las variaciones insignificantes), 2,5 partes de 1 mg / ml de fibronectina y 1 parte de 2 mg / ml de colágeno I en el hielo por primera pipeta Matrigel en el tubo utilizando puntas de pipeta frías y luego añadir la fibronectina y el colágeno I. Matrigel se iniciará la solidificación a temperaturas superiores a 4 ° C, por lo que trabajar rápidamente, mientras que el pipeteado de Matrigel. Mezclar la matriz muy suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo, evitar la introducción de burbujas. Mantener los tubos en hielo mientras se mezcla la RBM.
- Preparación del medio de cultivo de médula ósea (BMGM): Hacer 500 ml de BMGM contienen 6,2 x 10 -4 M CaCl 2, succinato sódico 10 -6 M, 10 -6 M hidrocortisona, 20% de plasma humano (normal o maligna recogida de donantes sanos o pacientes), y 1% de penicilina / estreptomicina en medio RPMI-1640. CaCl2, succinato de sodio, y suplementos de hidrocortisona pueden ser almacenadas a -80 ° C durante> 6 meses como 1000 x soluciones madre. Al crecer líneas celulares, suero bovino fetal (FBS) puede ser sustituido por el plasma humano.
- Preparación de 10% neutros formalina tamponada (NBF): Añadir una solución de formaldehído al 37% de stock a 1x PBS a 10% v / v Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente durante 2-3 semanas protegidos de la luz.
- Preparación de 1% de albúmina de suero bovino (BSA): Pesar cantidad apropiada de BSA y disolverlo en 1x PBS. Almacenar a 4 ° C y utilizar dentro de 1 semana. Solución de BSA tiende a contaminarse si se mantiene refrigerado por períodos más largos. Alternativamente, solución de BSA se puede dividió en alícuotas y se congeló a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Evite los ciclos de congelación-descongelación.
- Preparación de la solución de recuperación de células (CRS): Marca EDTA 5 mM, vanadato de sodio 1 mM (Na <sub> 3 VO 4) y 1,5 mM de fluoruro de sodio solución (NaF) en 1x PBS. Filtro estéril y se almacena a 4 ° C hasta 6 meses.
3. Embedded 3-D cultivo de células BM humano no malignas y malignas
- Purificar células mononucleares primarias de BM de Ficoll-Plaque centrifugación en gradiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Paso opcional: las células se pueden etiquetar con 0,25 M de diacetato de carboxifluoresceína, succinimidil éster (CFSE) según las instrucciones del fabricante para seguir la proliferación celular durante todo el período de cultivo.
Solución de problemas: Si las células mueren después de la tinción CFSE, se valora la cantidad de CFSE como la concentración depende del tipo de célula; 0,25 M funciona bien para las células mononucleares primarias de BM. - Añadir 65 l de solución Rend en cada pocillo de una placa de cultivo tratado de tejidos de 48 pocillos. Corre la solución de manera uniforme para cubrir toda la superficie del pocillo e incubar durante> 30min a TA.
- Preparar la suspensión de células a una densidad de células de 0,5 x 10 6 en 10 l de 1x PBS por pocillo de una placa de 48 pocillos. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml mezclar la suspensión de células con 100 l de matriz de la GBR por pocillo. Mezclar las células y la matriz de gestión por resultados con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo; evitar la introducción de burbujas. Mantener la mezcla de células / matriz sobre hielo para evitar la gelificación de la matriz.
Nota: el sistema de gestión por resultados es totalmente escalable, para configurar el sistema en un formato que no sea de 48 pocillos, ajustar las cantidades de todos los reactivos (matrices y medianas) en base a la superficie de la placa utilizada. Escala el número de células para ser chapados en consecuencia. - Aspirar el restante Rend y agregue la mezcla de células / matriz en el centro de un pozo. Rápidamente, se extendió la mezcla de células / matriz para cubrir toda la superficie del pozo de manera uniforme. Coloque la placa durante 30-60 min en 37 ° C, 5% de CO 2 incubador de cultivo de tejido para permitir que la matriz se solidifique. No sacuda ni disTurb la placa durante la incubación.
Solución de problemas: Para evitar la distribución desigual de las células en la RBM, mezclar bien antes de la siembra. Mezclar después de cada 5 ª bien presentado para evitar las células de sedimentación a la parte inferior del tubo. Una vez chapado, las células no se hunden hasta el fondo del pozo debido a la tensión superficial en la matriz.
Solución de problemas: Para evitar la distribución desigual de las células en la RBM, mezclar bien antes de la siembra. Mezclar después de cada 5 ª bien presentado para evitar las células de sedimentación a la parte inferior del tubo. Una vez chapado, las células no se hunden hasta el fondo del pozo debido a la tensión superficial en la matriz. - Precaliente BMGM en un baño de agua ajustado a 37 ° C.
- Después de 30 minutos, compruebe que la matriz se ha establecido correctamente, sino que formará un gel suave como la capa que no se mueve cuando se inclina el plato. Superposición de la capa de células / matriz con 1 ml de agua tibia BMGM. Para evitar el desgarro de la pipeta matriz el medio muy suavemente (dispensación gota a gota) utilizandouna pipeta serológica. Coloque la cultura de gestión por resultados montaje en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora tejido la cultura y de la cultura para el período de tiempo deseado.
Nota: la viabilidad celular se mantiene durante al menos 30 días sin cambio de medio, y si se requiere cambio de medio sólo cambiar 50% de medio de cada vez.
Paso crítico: Es fundamental que el medio no es frío como la temperatura fría puede molestar a la matriz ya establecido. Tenga cuidado de no rociar el medio en la parte superior de la matriz en la que se puede romper la capa de matriz blanda.
Solución de problemas: Si la viabilidad celular en el sistema de gestión por resultados es baja, la densidad celular puede tener que ser determinado experimentalmente cuando se trabaja con células que no sean células mononucleares primarias de BM aspirados. Cuando se trabaja con líneas celulares, disminuir el número de células de 10 veces, como líneas celulares inmortalizadas proliferan más rápido que las células primarias.
4. Imaging 'en-matriz'
- Imagen de las células cultivadas directamente en RBM utilizando campo claro, contraste de interferencia diferencial (DIC), confocal o cualesquiera otras técnicas de imagen que permiten imágenes de larga distancia como la matriz es de aproximadamente 1 mm de espesor. Utilice la función Z-stack disponible en muchos de los microscopios para tomar imágenes de todo la cultura, de arriba abajo.
Consejo: Para el protocolo de inmunotinción abajo evitar aspirar las soluciones de tinción / lavado, en lugar inclinar el plato y quitar las soluciones con una pipeta.
- Retire la BMGM utilizando una pipeta y lavar 2-3x con 100 l / lavado / pocillo de RT 1x PBS. Asegúrese de que suficiente PBS se utiliza para cubrir toda la superficie del pozo.
- Fijar las células en la matriz mediante la adición de 100 l / pocillo (para una placa de 48 pocillos) de NBF al 10% durante 15 min a TA. Retire NBF y lavar las células dos veces con 100 l / lavado / pocillo de RT 1x PBS.
Nota: Evite el uso de frío NBF ya que puede licuar la matriz. - Retirar PBS, añadir 1% de BSA durante 1 hora a TA o a 4 º C durante la noche con el fin de bloquear la unión no específica de anticuerpos.
- Preparar la solución de anticuerpo primario en 1% de BSA a la dilución requerida. La dilución variará para cada anticuerpo, consulte con el fabricante o el titular para determinar la concentración óptima de anticuerpos. Añadir 100 l / pocillo de solución de anticuerpo primario y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante.
Paso crítico: Todas las incubaciones que implican anticuerpos conjugados con fluoróforos o colorantes fluorescentes deben ser realizadas en la oscuridad. - Elimine la solución de anticuerpo primario y lavar 3 veces con 1x PBS durante 5 min.
- Para la tinción de inmunofluorescencia indirecta, incubar con un anticuerpo secundario conjugado con sonda fluorescente durante 1 hora a TA. Diluir los anticuerpos en el 1% de BSA a una concentración sugerido por el fabricante.
- Retire el secundariosolución ntibody y lavar 3 veces con 1x PBS durante 5 min.
Solución de problemas: Para evitar el alto fondo durante la exploración, se valorarán los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia y utilizar la menor concentración que proporciona la señal sea adecuada. Si alto fondo sigue siendo un problema, aumentar el número y la duración de las etapas de lavado, o utilizar anticuerpos primarios conjugados directamente, y omita el paso 4.2.6. - Para la tinción de los núcleos añaden 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) solución de tinción nuclear, a la dilución sugerido por el fabricante, y se incuba durante 7-10 min a TA.
- Elimine la solución de tinción nuclear y lavar 2 veces con 1x PBS durante 5 min.
- Retire la PBS desde el último lavado y añadir una gota de medio de montaje (juego regular), en la muestra de preservar la fluorescencia. Imagen con la configuración de excitación / emisión apropiados en un microscopio de fluorescencia o confocal.
Nota: Imaging debe hacerse dentro de los 2 días de tinciónpara evitar la degradación de la matriz y la pérdida de la integridad de la GBR y la pérdida de la señal fluorescente. Si no reflejado de inmediato, las muestras teñidas deben mantenerse a 4 ° C, protegido de la luz, hasta imágenes.
5. Aislamiento de células de RBM
- Retire medio suavemente sin alterar la capa de matriz. No aspirar.
- Lavar las células 2 veces con PBS 1x estéril. No aspirar.
- Añadir 0,5 ml de CRS frío de hielo a cada pocillo y quitar la capa de la matriz entera junto con las células, pipeteando enérgicamente arriba y hacia abajo. Recoger las células, matriz y el SRC en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque sobre hielo.
- Añadir un adicional de 0,5 ml de CRS para el mismo pozo y recoger todo el material restante. Traslado al mismo tubo de microcentrífuga.
- Vortex la mezcla de células, matriz y el SRC e incubar en hielo durante 1 hora. Células Vortex cada 15 min para facilitar la liberación de la matriz.
- Echa la mezcla después de 1 hora, sin grumos visiblesde la matriz debe estar presente.
Solución de problemas: si matas de matriz son todavía visibles después de 1 hora, las células de transferencia / matriz / mezcla de CRS a un tubo más grande, añadir 2-5 ml adicional de CRS, y se incuba durante un adicional de 30 a 60 min. - Centrifugar las células en CRS a 1.000 rpm durante 5 a 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 1 ml de PBS 1x frío.
- Centrifugar a 1000 rpm durante 5-10 min y separar el sobrenadante. Repita el lavado con PBS una vez más.
- El segundo lavado con PBS completa la recuperación de las células de la matriz y las células aisladas se puede utilizar para todas las aplicaciones aguas abajo, tales como el aislamiento de ADN / ARN / proteína, citometría de flujo, el trasplante in vivo, etc.
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Representative Results
Dado que las células de médula ósea primaria fallan a proliferar en condiciones de cultivo de tejidos estándar, el sistema de GBR se ha creado para imitar el microambiente de la médula, proporcionando un sistema para la cultura y expandir las células BM ex vivo. Los principales componentes de la matriz extracelular BM, fibronectina, colágeno I, colágeno IV, laminina y 21, se incorporaron a la matriz RBM para proporcionar el andamiaje estructural de esta cultura 3-D. Endostio, la interfaz entre el hueso y el BM, rico en colágeno I y fibronectina, se reconstruyó mediante el recubrimiento de la superficie de una placa de cultivo tisular con estas proteínas. La diafonía entre múltiples compartimentos celulares dentro de la BM contribuye a la homeostasis de la general del tejido. Para asegurarse de que ninguno de los componentes celulares se quedan fuera, la cultura de gestión por resultados se estableció utilizando células mononucleares no fraccionadas de las biopsias BM aspirados de aguja humanos. Para asegurar que el sistema se suministra con hormonas, factores de crecimiento, unad citoquinas presentes en el entorno circulatorio, el medio de cultivo se complementó con plasma humano, según el modelo que se cultivaron (es decir, se añadió plasma de donantes normales cuando las células no malignas BM fueron colocados en la RBM, mientras que el plasma de los pacientes se añadió a las culturas del maligno las células) (Figura 1).
BM y muestras de sangre de donantes sanos y pacientes con diversas neoplasias hematológicas fueron recolectados después de la aprobación de la Universidad de Purdue y la Universidad de Alberta Foros de Investigación Institucionales y tras el consentimiento informado por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki (Tabla 1). Las células mononucleares aisladas de biopsias BM proliferan y mantienen su viabilidad en el sistema de gestión por resultados para un máximo de 30 días (Figura 2). La concentración de células de 0,5 x 10 6 cells/100μl de matriz de RBM se ha determinado que la densidad óptima para las células primarias BM. Yendo más allá de thidensidad s overcrowds el sistema disminuye la viabilidad celular y las tasas de proliferación en el tiempo. Una densidad inferior también ha demostrado ser perjudicial para la salud general del sistema como contactos célula-célula han demostrado ser vital para un crecimiento celular robusto. Crecimiento dentro de la RBM se puede seguir después de etiquetar células con diacetato de carboxifluoresceína, succinimidiléster (CFSE). La intensidad de fluorescencia de CFSE reduce a la mitad con cada división celular, por lo tanto la proliferación celular se puede seguir mediante microscopía o citometría de flujo con el tiempo. Por otra parte, los compartimentos celulares dentro de la cultura de GBR se mantienen en las mismas proporciones que estaban presentes en las muestras de biopsia de 8. Además de las células de los linajes hematopoyéticos, compartimentos del estroma exhiben un crecimiento robusto en la GBR. Fosfatasa alcalina expresar osteoblastos capaces de calcio de mineralización, los osteoclastos tinción fosfatasa ácida resistente a tartrato, petróleo adipocitos positivo rojo, y la producción de las células del estroma fibronectina se encuentran en el endosteum/ BM interfaz del sistema de gestión por resultados (Figura 3).
Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que el modelo de gestión por resultados proporciona un primer sistema ex vivo donde BM células humanas primarias de donantes sanos y pacientes con diversas neoplasias hematológicas, como la leucemia, el linfoma y el mieloma múltiple pueden sostenerse y ampliarse hasta por 30 días. RBM ofrece un modelo integral para estudiar el comportamiento celular en condiciones fisiológicas en el contexto del microambiente nativa BM. Este sistema ha sido utilizado por nuestro laboratorio para identificar el fenotipo de las células madre de cáncer de mieloma múltiple y para estudiar las interacciones entre las células malignas y la matriz extracelular BM, así como la diafonía entre las células malignas y el estroma BM.
| Diagnóstico | Tipo de la célula | Supervivencia | |
| No maligno | BM | Moderado | Moderado |
| Amilosis | BM | Alto | Alto |
| Gammapatía monoclonal de significado incierto | BM | Alto | Alto |
| PBMC | No | No | |
| Plasmacitoma | BM | Alto | Alto |
| Mieloma múltiple quiescente | BM | Alto | Alto |
| El mieloma múltiple | BM | Alto | Alto |
| PBMC | No | No | |
| MB | Alto | Alto | |
| Leucemia de células plasmáticas | BM | Alto | Alto |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | High | Alto |
| La leucemia mielógena aguda | BM | Alto | Alto |
| La leucemia promielocítica aguda | BM | Alto | Alto |
| PBMC | No | No | |
| La leucemia linfocítica aguda | BM | Moderado | Moderado |
| La leucemia mielógena crónica | BM | Moderado | Alto |
| La leucemia linfocítica crónica | BM | Bajo | Despacio |
| PBMC | No | No | |
| El linfoma no-Hodgkin | BM | Moderado | Despacio |
| PBMC | No | No |
Tabla 1. La supervivencia y la proliferación de diversos ejemplares cultivados en la RBM. Médula ósea mononuclear células (BM), las células mononucleares de sangre periférica (CMSP), o muestras de sangre movilizados (MB) de donantes sanos y pacientes diagnosticados con diversos tumores malignos fueron cultivadas en la RBM. La tabla enumera todos los tipos de muestras que se cultivaron en la RBM, junto con el tipo de célula (es decir, BM, CMSP, o MB). La medida de la supervivencia celular y la proliferación en la GBR se observó. Mientras BM y MB exhiben un crecimiento robusto en la RBM, PBMCs aisladas de pacientes con diversos tumores malignos no eran viables en materia de RBM.
Figura 1. . Representación esquemática de la configuración RBM RBM se compone de dos fases: 1) el revestimiento endosteal (fibronectina, el colágeno I (CI)) y 2) de la matriz de gestión por resultados (fibronectina, el colágeno I (CI), el colágeno IV (CIV) y laminina) Nota. : colágeno IV y laminina son el mcomponentes RINCIPALES de Matrigel, por lo tanto no se requiere ninguna adición por separado de estas proteínas. Estas fases se configuran en dos pasos mediante la superposición de la matriz de mezcla de la GBR / célula en la parte superior de la capa fina de matriz de endóstica. Para seguir la proliferación celular con el tiempo, las células pueden marcarse con CFSE antes de la mezcla con la matriz de la GBR. Durante la duración del cultivo, las células pueden ser visualizadas por microscopía y la migración celular pueden ser seguidos en tiempo real usando un microscopio equipado con una cámara de temperatura de CO 2 / controlada. Después de 14-30 días en células de cultivo se pueden aislar de la matriz y se sometieron a una serie de análisis aguas abajo, incluyendo tanto in vitro como in vivo en los procedimientos. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Evolución temporal de la auto-segregación de los compartimentos celulares en la RBM. BM células fueron cultivadas en la RBM para el número indicado de días. Elementos estromales se hacen evidentes en el día 14, pero se pueden detectar ya en el día 5 en la RBM. A lo largo de las células del período de cultivo se puede observar la migración a través de la matriz de gestión por resultados y la agregación en grupos distintos. Las masas de células malignas se expanden a través del tiempo (comparar tamaños de clúster entre 9-30 días). Vista representativa de la cultura en cada momento fue capturado utilizando microscopía de campo claro en un microscopio invertido (ampliación: 200X). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Compartimentos estromales se 'entregan' dentro de la RBM. Evaluar la composición de los componentes del estroma que ya no caben en la RBM, se evaluaron las células en la transición entre la matriz de gestión por resultados y revestimiento endosteal para la morfología de fibroblastos, osteoblastos, adipocitos y osteoclastos específico y la expresión del marcador . (a) Para detectar los fibroblastos, las células se tiñeron para fibronectina (verde), actina (rojo), y los núcleos (azul) y reproducidos en un microscopio confocal (magnificación: 200X). (b) Las células con morfología del estroma mostraron ser preosteoblastos con altos niveles de actividad de la fosfatasa alcalina (B.1) y capaz de mineralizar de calcio tal como se determina por tinción con rojo de alizarina (b.2). (c) Las células con una presencia visible de gotitas de lípidos fueron identificados como adipocitos basándose en la tinción positiva con aceite rojo (c.1). (d) Las células con núcleos múltiples ocasionales fueron reconocidos como preosteoclasts y fueron positivos para la fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) (d.1). Campo claro y color las imágenes (no fluorescentes) fueron adquiridas en un microscopio invertido equipado con una cámara de color (ampliación: 200X). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
El modelo de gestión por resultados proporciona un sistema integral donde la composición celular del BM se mantiene ex vivo por hasta 30 días. BM células cultivadas en la auto-estratificar RBM según su función imitando de cerca la arquitectura BM encontrado in vivo. Por otra parte, este es el primer sistema que permite la expansión del clon mieloma múltiple 8. Los pasos más importantes para garantizar el sólido crecimiento de las células de BM y el éxito general de la cultura son: 1) para obtener una población saludable de las células de la MO con> 70% de viabilidad y sobre todo libre de las células rojas de la sangre, 2) para asegurar que los componentes de la matriz se mezclan bien y que las células se distribuyen uniformemente por toda la matriz, y 3) para tener cuidado de no dañar la matriz cuando se añade al medio de crecimiento del sistema. Para asegurar la proliferación robusta de las células malignas, medio de crecimiento debe ser complementado con plasma humano que coincida con el diagnóstico de la paciente cuyas células están siendo cultivadas. Olimitación NE del sistema de GBR que se notó es su incapacidad para soportar poblaciones purificadas de células madre hematopoyéticas CD34 +, células B CD20 +, CD138 + y células de plasma sin el compartimiento del estroma de la BM.
El sistema de gestión por resultados es muy versátil y se puede modificar de muchas maneras para adaptarse mejor a los objetivos de los estudios específicos. Compartimento endotelial se puede añadir al sistema para imitar la vascularización de la BM y componentes de matriz extracelular adicionales pueden ser suministrados para llevar la composición de la matriz lo más cerca posible a la in vivo maquillaje de la matriz de las concentraciones de BM y se puede ajustar a reflejar los estados de enfermedad donde las concentraciones de componentes de la matriz individuales pueden ser alterados 21. Además de cultivo de células primarias, sistema de GBR es adecuado para el cocultivo diversas líneas celulares para estudiar las interacciones célula-célula entre las poblaciones de células específicas. Por ejemplo, el sistema puede ser configurado como un co-cultivo, donde estromal células se colocan sobre el revestimiento endóstica, se añaden las células hematopoyéticas en la parte superior de las células del estroma, y todo el cocultivo estromal / hematopoyético se superpone primero con la matriz de la GBR y luego con el medio de crecimiento. También son útiles, podrían ser las modificaciones de la composición del medio para incluir el plasma de diversas fuentes o medio acondicionado por estroma para estudiar cómo los factores solubles afectan el comportamiento de células 12. Las citoquinas, factores de crecimiento, hormonas y también se pueden añadir al medio de crecimiento, sin embargo, se debe tener cuidado de no sustituir todo medio de crecimiento en el cultivo a la vez como factores de sostener el crecimiento que se secretan por las células en la GBR se pueden perder, por lo tanto , que afecta a la viabilidad global del sistema. Sugerimos la sustitución de hasta el 50% del medio a la vez.
El sistema de GBR se puede usar para estudiar tanto el comportamiento celular (es decir, la proliferación, la viabilidad, la migración, etc) y para evaluar la potencia y fuera de objetivo efectos de la novela terapéuticos 8,12. El sistema está configurado para recapitular el microambiente del tejido, por lo tanto, la eficacia de los fármacos en investigación puede ser evaluada en las condiciones de medio ambiente mediada por resistencia a las drogas 14. Uso de células vivas en tiempo real la microscopía, la viabilidad celular durante el curso del tratamiento puede ser evaluada por tinción vivo / muerto y el efecto del tratamiento sobre diferentes orgánulos se puede evaluar usando múltiples colorantes de orgánulos específicos disponibles comercialmente que penetran fácilmente la matriz de la GBR y se tienen en marcha por las células sin generar fondo significativo que pudiera afectar a la imagen.
El sistema de gestión por resultados es un modelo muy versátil y adaptable para estudiar trastornos BM. El beneficio de tal método de cultivo de 3-D en comparación con los cultivos estándar 2-D es en la capacidad de estudiar el comportamiento de células en el contexto de la microambiente del tejido garantizar que los efectos de las múltiples interacciones no se pierden cuando las células se aíslan de su físicoambiente gico y se coloca en un plato de plástico. El atractivo de la sistema de vigilancia basada sobre modelos in vivo se encuentra en la transparencia del sistema en el que las interacciones que no se pueden ver in vivo debido a las limitaciones de las técnicas de formación de imágenes podrían ser diseccionados fácilmente. El sistema de GBR proporciona un medio para la manipulación fácil de los componentes, mientras que el mantenimiento de la composición general del tejido, permitiendo así que el investigador para diseccionar los mecanismos moleculares bajo investigación. Por otra parte, el sistema de gestión por resultados ha sido validado como una forma costo-efectiva, en comparación con las pruebas in vivo, para llevar a cabo estudios preclínicos de nuevas terapias 8,12. Tomados en conjunto, el modelo de GBR proporciona un sistema en el que muchos aspectos de la biología del tejido pueden ser investigados ex vivo usando muestras primarias.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer (1R21CA141039), BD Premio Beca de Investigación de Biociencias, la Sociedad Americana del Cáncer Investigación Institucional Grant (IRG # 58-006-53), al Centro de la Universidad de Purdue para el cáncer Investigación y los Institutos Canadienses de la Programa de Iniciativas de Investigación del Cáncer de Alberta Junta de Investigación y Salud. MP fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, Programa de Prácticas de Prevención del Cáncer (R25CA128770; PI: D. Teegarden), administrado por el Centro de Ciencias Oncológicas y el Centro de Investigación de aprendizaje por descubrimiento en la Universidad Purdue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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