Summary
Nei metodi standard di coltura le cellule sono presi dal loro ambiente fisiologico e cresciute sulla superficie di plastica di un piatto. Per studiare il comportamento delle cellule primarie midollo osseo umano è stato creato un sistema di coltura 3-D in cui le cellule sono coltivate in condizioni riassumono il microambiente nativo del tessuto.
Abstract
Coltura di tessuti è stato uno strumento prezioso per studiare molti aspetti della funzione delle cellule, dallo sviluppo normale della malattia. Metodi di coltura cellulare convenzionali si basano sulla capacità delle cellule sia per legarsi a un substrato solido di un piatto di coltura di tessuti o di crescere in sospensione in mezzo liquido. Diverse linee cellulari immortali sono stati creati e coltivati con tali approcci, tuttavia, questi metodi spesso falliscono quando le cellule primarie devono essere coltivate ex vivo. Tale guasto è stato attribuito alla mancanza dei componenti della matrice extracellulare appropriate del microambiente tessuto dai sistemi standard dove coltura tissutale di plastica è usato come superficie per la crescita cellulare. Matrice extracellulare è parte integrante del microambiente tissutale e la sua presenza è essenziale per il mantenimento delle funzioni fisiologiche come polarizzazione delle cellule, la sopravvivenza e la proliferazione. Qui vi presentiamo un metodo di coltura di tessuto a 3 dimensioni in cui il midollo osseo primario celLS sono cresciuti in matrice extracellulare formulato ricapitolare il microambiente dell'osso umano (sistema RBM). Incorporato nella matrice extracellulare, cellule ricevono sostanze nutritive attraverso il mezzo supplementato con plasma umano, fornendo così un sistema completo in cui la sopravvivenza e la proliferazione cellulare possono essere mantenuti fino a 30 giorni, mantenendo la composizione cellulare del tessuto primario. Utilizzando il sistema RBM siamo cresciuti con successo le cellule del midollo osseo primarie da donatori sani che in pazienti con amiloidosi, e varie neoplasie ematologiche. Il sistema RBM permette, visualizzazione diretta in matrice tempo reale del comportamento delle cellule e la valutazione di efficacia preclinica di nuove terapie. Inoltre, le cellule possono essere isolate dal MLF e successivamente utilizzati per trapianto in vivo, selezione cellulare, citometria a flusso, e acido nucleico e proteina analisi. Nel loro insieme, il metodo RBM fornisce un sistema affidabile per la crescita di ossa primario Marrow cellule in condizioni fisiologiche.
Introduction
Coltura tissutale è stato sviluppato per studiare il comportamento delle cellule in un ambiente controllato per ridurre al minimo la variabilità sistemica quando si confrontano i vari processi in organismi intatti. Questo metodo è stata fondata nei primi anni del 1900 a 1,2 e si riferisce ad una tecnica in cui espianti di tessuto sono state coltivate ex vivo in un piatto di vetro. A metà del 1900 il sistema è stato adattato per far crescere le cellule disperse piuttosto che frammenti di tessuti intatti, e 'la cultura del tessuto' i termini e 'di coltura cellulare' diventato sinonimo 3. In tali sistemi di colture cellulari convenzionali cellule sono cresciute sulla superficie della plastica coltura di tessuti sovrapposti con terreno di coltura addizionato con diversi fattori di crescita. Due tipi di colture sono emersi sulla base delle capacità di adesione di cellule diverse: coltura di cellule aderenti, in cui le cellule si attaccano e diffondono sulla plastica coltura tissutale e colture non aderenti, in cui le cellule vengono propagate in sospensione. Fin dai primi giorni di cellacultura, più linee cellulari immortali sono state create, come HeLa 4, la prima linea di cellule di cancro umano. Queste linee cellulari hanno la capacità di proliferare indefinitamente in coltura cellulare, e la maggior parte non richiedono alcun trattamento speciale per mantenere la vitalità.
L'approccio riduzionista dei metodi di coltura cellulare originale è stato progettato per semplificare il sistema, per quanto possibile includendo solo i componenti minimo necessario per mantenere la vitalità e la proliferazione cellulare. Tuttavia, gli approcci di coltura cellulare semplificati non riescono a sostenere ex vivo la maggior parte dei tipi principali di cellule umane con limitata durata. Pertanto, i nuovi sistemi di coltura sono stati progettati per approssimare il microambiente tissutale più vicino possibile, permettendo così espianti di cellule di crescere in condizioni fisiologiche. In contrasto con le / approcci convenzionali di coltura cellulare riduzioniste, 3-dimensionale (3-D) sistemi di coltura stanno diventando il metodo preferito per la cultura in modo efficiente varilinee cellulari umane e cellule primarie di studiare successivamente meccanismi coinvolti nella salute e malattia, nel contesto di un microambiente favorevole. Tali sistemi 3-D sono solitamente realizzate utilizzando matrici ricostruite e / o medie, completata con fattori di crescita, per ricapitolare microambiente tissutale per studiare tipi cellulari di interesse. La prima di queste 3 dimensioni (3-D) modelli di coltura è stato sviluppato per studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria. Per fornire le cellule con condizioni native cellule epiteliali mammarie sono stati incorporati in Matrigel, collagene IV e ricca fonte-laminina di matrice extracellulare (ECM), e ricoperto con terreno di crescita. In tali condizioni, le cellule epiteliali mammarie formano cluster somiglianti acini mammaria, e dopo stimolazione con ormoni lattogenica, questi acini secreti caseina e altre proteine del latte, nel Lumena cavità delle strutture acini simili. Secrezione di caseina non è stata osservata in culture normali anche dopo aggiunta di prolattina 5, Sottolineando ulteriormente il ruolo del microambiente nel preservare le caratteristiche morfologiche e fenotipiche delle cellule. Un'altra dimostrazione della perdita della normale funzione cellulare quando le cellule sono prese fuori dal contesto della loro microambiente fisiologico è la dimostrazione che senza microambiente favorevole, cheratinociti non riescono a formare epidermide stratificati 6. Un certo numero di altri modelli 3-D è stato creato per permettere a ex vivo propagazione di pile 7,8.
Il ruolo cruciale del microambiente nel comportamento cellulare era elegantemente dimostrata in uno studio in cui cellule epiteliali mammarie formate "inside-out" acini quando coltivate in collagene I matrice, rispetto al acini polarizzata corretto e che si sono formate in Matrigel. Questa perdita di corretta morfologia è invertita quando le cellule mioepiteliali-laminina produzione sono stati aggiunti alle colture collagene I 9. Inoltre, corretta microambiente è necessario per l'accuratagenotipo manifestazione. Cresciuto in un piatto, cellule tumorali mammarie MCF7 trasfettate con una cellula-cellula molecola di adesione CEACAM1 si comportano esattamente come le cellule negative CEACAM non trasfettate. Tuttavia, quando coltivate in Matrigel, a contatto con la ECM, strutture tumore-come forma di tipo selvatico MCF7 mentre MCF7 cellule trasfettate con CEACAM1 ritornano ad un fenotipo e forma normale acini con Lumena vuoto, come è stato stabilito con nonmalignant epitelio mammario 10. Analogamente, il blocco-β1 integrine in cellule di carcinoma mammario non cambia il loro comportamento in condizioni standard di coltura, ma lo stesso esperimento condotto in colture 3-D dimostra che bloccare β1-integrina ritorna cellule maligne ad un fenotipo normale 11. Pertanto, microambiente tissutale non è necessaria solo per mantenere la vitalità cellulare, ma anche di mantenere corretta funzionalità delle cellule.
Oltre a fornire un sistema in cui il comportamento delle cellule può essere studiato in condizioni fisiologiches, culture 3-D funzionano mezzo robusto e affidabile per la prova preclinica di nuove terapie 8,12,13. Coltura di cellule in 3-D permette lo screening di composti sperimentali nelle condizioni di ambiente mediata farmaco-resistenza 14, in cui potrebbe essere valutato il contributo di cellula-cellula e cellula-ECM adesione. Inoltre, la tossicità fuori bersaglio di nuovi composti può essere accertata incorporando diversi compartimenti cellulari di vari tessuti. Tali schermi possono essere eseguite più rapidamente e sono più conveniente rispetto gli studi comparabili in vivo 8.
Qui vi presentiamo un impostazione di un modello 3-D di midollo osseo ricostruito (RBM), dove normale e maligna del midollo osseo (BM), le cellule proliferano ex vivo in un sistema mimando il microambiente del BM umana. Precedenti tentativi di crescita delle cellule umane primarie BM nelle culture 2-D, liquido o co-colture aderenti con i vari componenti della BM stroma, O 3-D, culture agar semisolido hanno avuto un successo limitato a causa della loro incapacità di fornire le cellule con i componenti del tessuto microambiente 15-18. In questi sistemi cellule midollari primarie hanno avuto scarsa vitalità e non è riuscito a proliferare ex vivo. Un altro sistema in cui le cellule progenitrici midollari umane sono coltivate in co-colture sferoidali con cellule stromali BM è un sistema 3-D in cui è stata sostenuta vitalità e la proliferazione di cellule staminali per almeno 96 ore 19. Tuttavia, anche se di grande beneficio per la comprensione della biologia progenitrici ematopoietiche, questo sistema non fedelmente ricapitolare il microambiente del BM per l'assenza di componenti ECM, pertanto, limitando la sua utilità. Il modello RBM qui descritta presenta un sistema completo in cui entrambi i compartimenti cellulari ed extracellulari della BM umano sono ricostruiti in vitro. Abbiamo dimostrato che le culture meccanismi in grado di supportare la crescita ex vivo di cellule normali BM umane, come abbiamoll come cellule isolate da pazienti con vari disturbi ematologici.
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Protocol
1. Preparazione preliminare
- Tenere pipette sierologiche sterili e relativi puntali a 4 ° C.
Risoluzione dei problemi: gel Matrigel a temperatura ambiente (RT); utilizzando pipette fredde e suggerimenti impediranno Matrigel di gelificazione durante l'installazione cultura. - Scongelare una bottiglia di Matrigel a 4 ° C per una notte.
2. Preparazione dei reagenti
- Preparazione della fibronectina soluzione stock: Fare un / ml soluzione madre 1 mg di fibronectina sciogliendo 100 mg fibronectina umana in 100 ml di acqua distillata. Una volta che la fibronectina è dissolta, filtro sterile, un'aliquota, e conservare a 4 ° C per un massimo di 6 mesi.
Risoluzione dei problemi: se fibronectina non si scioglie rapidamente incubare la soluzione per pochi minuti in un set da bagno di acqua a 37 ° C. - Preparazione di 10x PBS: sciogliere 80 g di cloruro di sodio NaCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2 g KCl e 2,4 g di KH 2 PO
- Preparazione del tampone di neutralizzazione 20: Fai una soluzione contenente HEPES 100 mM in 2x tampone fosfato salino (PBS) con 1 M HEPES e 10x soluzioni stock PBS. Aggiustare il pH della soluzione a 7,0. Conservare a 4 ° C per 2-3 mesi.
- Preparazione della soluzione di 2 mg / ml di coda di ratto collagene di tipo I: fare una soluzione 2 mg / ml di collagene I nel tampone di neutralizzazione (passo 2.3). Agitare la soluzione a bassa velocità e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Poiché questo collagene è molto viscoso, evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettaggio. Si raccomanda di preparare la soluzione di collagene I fresca ogni volta. Mantenere la soluzione in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Preparazione del rivestimento endosteale (Rend): Mescolare 1 mg / magazzino fibronectina ml con 2 mg / ml di collagene I stock (punti 2.1 e 2.4) per una concentrazione finale di 77 mg / ml e 29 mcg / ml, rispettivamente, in 1x &# 160; PBS sterile. Mescolare e conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese.
- Preparazione della matrice ossea ricostruita (RBM):
- Preraffreddare 1,5 ml microprovette su ghiaccio. Conservare tutte le soluzioni della matrice sul ghiaccio in ogni momento.
- Miscelare 4 parti Matrigel (concentrazione Matrigel varia da lotto a lotto, ma le variazioni sono risultate essere trascurabile), 2,5 parti di 1 mg / ml di fibronectina e 1 parte di 2 mg / ml di collagene I sul ghiaccio prima pipettaggio Matrigel in il tubo con i puntali delle pipette fredde e quindi aggiungere fibronectina e collagene I. Matrigel inizierà solidificare a temperature superiori a 4 ° C, in modo da lavorare in fretta, mentre il pipettaggio Matrigel. Mescolare la matrice molto delicatamente pipettando su e giù, evitare di introdurre bolle. Tenere le provette in ghiaccio durante la miscelazione del RBM.
- Preparazione del mezzo di crescita del midollo osseo (BMGM): Rendere 500 ml di BMGM contenenti 6,2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 -6 M sodio succinato, 10 -6 M idrocortisone, il 20% del plasma umano (normale o maligno raccolti da donatori sani o pazienti), e l'1% di penicillina / streptomicina in RPMI-1640. CaCl 2, sodio succinato, e gli integratori idrocortisone possono essere conservati a -80 ° C per> 6 mesi come 1.000 soluzioni di riserva x. Quando cresce linee cellulari, siero bovino fetale (FBS) può essere sostituito da plasma umano.
- Preparazione del 10% formalina tamponata neutra (NBF): Aggiungi il 37% di soluzione di formaldeide magazzino a 1x PBS al 10% v / v Mescolare bene e conservare a temperatura ambiente per 2-3 settimane al riparo dalla luce.
- Preparazione del 1% di albumina sierica bovina (BSA): Pesare giusta quantità di BSA e scioglierlo in 1x PBS. Conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 1 settimana. Soluzione BSA tende ad ottenere contaminati se conservato in frigorifero per periodi più lunghi. In alternativa, la soluzione BSA può essere aliquotato e congelato a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. Evitare cicli di congelamento-scongelamento.
- Preparazione della soluzione di recupero di cellule (CRS): Make 5 EDTA mm, 1 mm vanadate sodio (Na <soluzione sub> 3 VO 4) e 1,5 mM fluoruro di sodio (NaF) in PBS 1x. Filtro sterile e conservare a 4 ° C fino a 6 mesi.
3. Integrato 3-D coltura di cellule BM umano non maligne e maligne
- Purificare cellule mononucleate midollari primarie per Ficoll Plaque centrifugazione in gradiente secondo le istruzioni del produttore.
Passaggio facoltativo: le cellule possono essere etichettati con 0,25 micron carbossifluoresceina diacetato, estere succinimidyl (CFSE) secondo le istruzioni del produttore per seguire la proliferazione cellulare per tutto il periodo di coltura.
Risoluzione dei problemi: Se le cellule muoiono dopo CFSE colorazione, titolare la quantità di CFSE come la concentrazione dipende dal tipo di cellula; 0,25 micron funziona bene per le cellule mononucleari BM primarie. - Aggiungere 65 ml di soluzione di rend in ciascun pozzetto di un tessuto coltura trattata piastra a 48 pozzetti. Distribuire uniformemente la soluzione a coprire l'intera superficie del pozzetto ed incubare per> 30min a RT.
- Preparare la sospensione di cellule ad una densità di 0,5 x 10 6 cellule in 10 ml di PBS 1x per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga mescolare la sospensione cellulare con 100 ml di matrice MLF per pozzetto. Mescolare le cellule e la matrice RBM pipettando gentilmente su e giù; evitare l'introduzione di bolle. Mantenere la miscela cellula / matrice in ghiaccio per evitare gelificazione della matrice.
Nota: il sistema RBM è completamente scalabile, per configurare il sistema in un formato non-48-bene, adegua gli importi di tutti i reagenti (matrici e medie) in base alla superficie della piastra utilizzata. Ridimensionare il numero di cellule per essere placcato conseguenza. - Aspirare il restante Rend e aggiungere la miscela di cellule / matrice nel centro di un pozzo. Rapidamente, diffondere la miscela di cellule / matrice a coprire l'intera superficie del pozzetto in modo uniforme. Posizionare la piastra per 30-60 min a 37 ° C, 5% CO 2 tessuto cultura incubatore per consentire la matrice solidificare. Non agitare o disdisturbare la piastra durante l'incubazione.
Risoluzione dei problemi: per evitare distribuzione irregolare di cellule in RBM, mescolare bene prima di placcatura. Mescolare dopo ogni 5 ° ben placcato per evitare cellule sedimentazione al fondo della provetta. Una volta placcato, cellule non si depositano sul fondo del pozzo a causa della tensione superficiale nella matrice.
Risoluzione dei problemi: per evitare distribuzione irregolare di cellule in RBM, mescolare bene prima di placcatura. Mescolare dopo ogni 5 ° ben placcato per evitare cellule sedimentazione al fondo della provetta. Una volta placcato, cellule non si depositano sul fondo del pozzo a causa della tensione superficiale nella matrice. - Preriscaldare BMGM in un bagno d'acqua impostata a 37 ° C.
- Dopo 30 minuti, verificare che la matrice ha impostato correttamente, si formerà un gel morbido come strato che non si muove quando la piastra è inclinata. Sovrapporre lo strato di cellule / matrice con 1 ml di caldo BMGM. Per evitare lacerazione della pipetta matrice mezzo molto delicatamente (dispensazione goccia a goccia) usandouna pipetta sierologica. Posizionare la cultura meccanismi assemblati in un 37 ° C, 5% CO 2 tessuto cultura incubatore e cultura per il periodo desiderato.
Nota: vitalità cellulare viene mantenuta per almeno 30 giorni senza cambiare mezzo, se è necessaria medio cambiamento cambiare solo il 50% delle medie ogni volta.
Passaggio critico: E 'fondamentale che il mezzo non è freddo come temperatura fredda potrebbe disturbare la matrice già impostato. Fare attenzione a non schizzare il mezzo sulla parte superiore della matrice a potrebbe rompere lo strato di matrice morbida.
Risoluzione dei problemi: Se la vitalità delle cellule del sistema RBM è basso, la densità delle cellule può avere da determinare sperimentalmente quando si lavora con le cellule diverse dalle cellule mononucleate primarie da aspirati midollari. Quando si lavora con linee cellulari, diminuire il numero di cellule 10 volte, come linee cellulari immortalizzate proliferano più velocemente di cellule primarie.
4. Imaging 'In-matrix'
- Immagine cellule coltivate direttamente in RBM con campo chiaro, contrasto di interferenza differenziale (DIC), confocale o altre tecniche di imaging che permettono di imaging a lunga distanza come matrice di uno spessore di circa 1 mm. Utilizzare la funzione disponibile Z-stack su molti dei microscopi per l'immagine intera cultura da cima a fondo.
Suggerimento: Per il protocollo immunostaining sotto evitare aspirazione soluzioni colorazione / lavaggio, invece inclinare il piatto e rimuovere soluzioni con una pipetta.
- Rimuovere il BMGM utilizzando una pipetta e lavare 2-3x con 100 microlitri / lavaggio / pozzetto di RT 1x PBS. Assicurarsi che sufficiente PBS viene utilizzato per coprire l'intera superficie del pozzetto.
- Fix celle della matrice aggiungendo 100 pl / pozzetto (per una piastra a 48 pozzetti) del 10% NBF per 15 minuti a RT. Rimuovere NBF e lavare le cellule due volte con 100 microlitri / lavaggio / pozzetto di RT 1x PBS.
Appunto: Evitare di utilizzare a freddo NBF come può liquefare la matrice. - Rimuovere PBS, aggiungere BSA 1% per 1 ora a RT o a 4 ° C per una notte per bloccare il legame non specifico degli anticorpi.
- Preparare la soluzione di anticorpo primario in 1% BSA alla diluizione necessaria. Diluizione varierà per ogni anticorpo, verificare con il produttore o il titolare di determinare la concentrazione ottimale di anticorpi. Aggiungere 100 pl / pozzetto di soluzione di anticorpo primario e incubare secondo le istruzioni del produttore.
Passaggio fondamentale: Tutte le incubazioni che coinvolgono gli anticorpi coniugati a fluorofori o coloranti fluorescenti devono essere eseguite al buio. - Rimuovere soluzione di anticorpo primario e lavare 3x con 1x PBS per 5 min.
- Per la colorazione immunofluorescenza indiretta, incubare con un anticorpo secondario coniugato con sonda fluorescente per 1 ora a RT. Diluire gli anticorpi in 1% BSA a concentrazione suggerito dal produttore.
- Rimuovere il secondariosoluzione ntibody e lavare 3x con 1x PBS per 5 min.
Risoluzione dei problemi: Per evitare elevato background durante l'imaging, titolare anticorpi secondari coniugati modo fluorescente e utilizzare la più bassa concentrazione che fornisce il segnale adeguato. Se elevato background è ancora un problema, aumentare il numero e la durata delle fasi di lavaggio, oppure utilizzare anticorpi primari direttamente coniugati, e saltare il punto 4.2.6. - Per macchiare i nuclei aggiungono 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) soluzione colorante nucleare, alla diluizione suggerito dal costruttore, e incubare per 7-10 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione colorazione nucleare e lavare 2x 1x PBS per 5 min.
- Rimuovere la PBS dall'ultima pulizia e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio (serie regolare), sul campione per conservare fluorescenza. Immagine utilizzando apposite impostazioni di eccitazione / emissione su un microscopio a fluorescenza o confocale.
Nota: Imaging dovrebbe essere fatto entro 2 giorni di colorazioneper evitare il degrado della matrice e perdita di integrità meccanismi e perdita di segnale fluorescente. Se non è ripreso immediatamente, i campioni colorati devono essere conservati a 4 ° C, al riparo dalla luce, fino imaging.
5. Isolamento di cellule dal RBM
- Rimuovere delicatamente mezzo senza disturbare lo strato di matrice. Non aspirare.
- Lavare le cellule 2x con sterile 1x PBS. Non aspirare.
- Aggiungere 0,5 ml di CRS ghiaccio freddo a ciascun pozzetto e rimuovere l'intero strato di matrice insieme con le cellule, vigorosamente pipettando su e giù. Raccogliere le cellule, matrice, e CRS in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mettere sul ghiaccio.
- Aggiungere un ulteriore 0,5 ml CRS allo stesso bene e raccogliere tutto il materiale residuo. Trasferimento alla stessa provetta.
- Vortex la miscela di cellule, matrice, e CRS e incubare in ghiaccio per 1 ora. Cellule Vortex ogni 15 min per facilitare il rilascio dalla matrice.
- Controllare la miscela dopo 1 ora, senza grumi visibilidi matrice dovrebbe essere presente.
Risoluzione dei problemi: se ciuffi di matrice sono ancora visibili dopo 1 ora, le cellule di trasferimento / matrix / CRS miscela in un tubo più grande, aggiungere ulteriori 2-5 ml di CRS, e incubare per altri 30-60 min. - Centrifugare le cellule in CRS a 1.000 rpm per 5-10 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di freddo 1x PBS.
- Centrifugare a 1000 rpm per 5-10 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio PBS ancora una volta.
- Il secondo lavaggio PBS completa il recupero delle cellule dalla matrice e cellule isolate può essere utilizzato per applicazioni a valle come l'isolamento di DNA / RNA / proteine, citometria a flusso, trapianto in vivo, ecc.
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Representative Results
Poiché le cellule del midollo osseo primario non riescono a proliferare in condizioni di coltura tissutale standard, il sistema di meccanismo è stato creato per imitare strettamente microambiente dell'osso, fornendo un sistema di coltura ed espandere cellule BM ex vivo. I principali componenti della matrice extracellulare BM, fibronectina, collagene I, collagene IV, laminina e 21, sono state incorporate nella matrice meccanismi per fornire l'impalcatura strutturale di questa cultura 3-D. Endosteum, l'interfaccia tra l'osso e la BM, ricche di collagene I e fibronectina, fu ricostruita rivestendo la superficie di una piastra di coltura tissutale con queste proteine. Diafonia tra più compartimenti cellulari all'interno della BM contribuisce alla omeostasi complessiva del tessuto. Per garantire che nessuno dei componenti cellulari sono lasciati fuori, la cultura RBM è stata istituita utilizzando cellule mononucleate non frazionata dai BM biopsie ago aspirato umani. Per garantire che il sistema è fornito con ormoni, fattori di crescita e delled citochine presenti nell'ambiente circolatorio, il terreno di coltura è stato integrato con plasma umano corrispondente al modello in coltura (ossia il plasma di donatori sani è stato aggiunto quando le cellule midollari non maligne sono stati collocati in RBM, mentre il plasma di pazienti è stato aggiunto alle culture dei maligna cellule) (Figura 1).
BM e campioni di sangue da donatori sani e pazienti con varie patologie maligne ematologiche sono stati raccolti dopo l'approvazione da Purdue University e University of Alberta Istituzionali Enti di ricerca e dopo consenso informato scritto in accordo con la Dichiarazione di Helsinki (Tabella 1). Le cellule mononucleate isolate da biopsie BM proliferano e mantengono la loro vitalità nel sistema di RBM per un massimo di 30 giorni (Figura 2). La concentrazione cellulare di 0,5 x 10 6 cells/100μl di matrice MLF è stato determinato per essere la densità ottimale per le cellule BM primarie. Andando oltre thidensità s overcrowds il sistema diminuendo la vitalità delle cellule e tassi di proliferazione nel tempo. Una densità inferiore è stato anche dimostrato di essere dannoso per la brughiera complessiva del sistema come contatti cellula-cellula hanno dimostrato essenziale per una crescita cellulare robusto. Crescita all'interno della RBM può essere seguita dopo etichettatura cellule con carbossifluoresceina diacetato, estere succinimidyl (CFSE). Intensità di fluorescenza di CFSE dimezza ad ogni divisione cellulare, quindi la proliferazione cellulare può essere seguito mediante microscopia o citofluorimetria nel tempo. Inoltre, i compartimenti cellulari all'interno della cultura meccanismi vengono mantenuti nelle stesse proporzioni erano presenti nei campioni bioptici 8. In aggiunta alle cellule delle linee ematopoietiche, scomparti stromali mostrano una crescita robusta in RBM. Fosfatasi alcalina esprimendo osteoblasti capaci di mineralizzante calcio, gli osteoclasti la fosfatasi acida tartrato resistente colorazione, adipociti positivi rosse petrolio, e fibronectina produzione di cellule stromali si trovano al endosteum/ Interfaccia BM del sistema RBM (Figura 3).
Nel loro insieme, i nostri dati dimostrano che il modello RBM fornisce un primo sistema ex vivo in cui le cellule midollari primarie umane da donatori sani e pazienti con varie patologie maligne ematologiche quali leucemia, linfoma e mieloma multiplo possono essere sostenuti e ampliati fino a 30 giorni. RBM fornisce un modello globale per studiare il comportamento delle cellule in condizioni fisiologiche nel contesto del BM microambiente nativo. Questo sistema è stato utilizzato dal nostro laboratorio per identificare il fenotipo delle cellule staminali del cancro multipli mieloma e per studiare le interazioni tra le cellule maligne e la matrice extracellulare BM nonché la diafonia tra le cellule maligne e lo stroma BM.
| Diagnosi | Tipo di cella | Sopravvivenza | |
| Nonmalignant | BM | Moderato | Moderato |
| Amiloidosi | BM | Alto | Alto |
| Gammopatia monoclonale di significato indeterminato | BM | Alto | Alto |
| PBMC | No | No | |
| Plasmocitoma | BM | Alto | Alto |
| Fumanti mieloma multiplo | BM | Alto | Alto |
| Il mieloma multiplo | BM | Alto | Alto |
| PBMC | No | No | |
| MB | Alto | Alto | |
| Leucemia a cellule del plasma | BM | Alto | Alto |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | High | Alto |
| Leucemia mieloide acuta | BM | Alto | Alto |
| Leucemia promielocitica acuta | BM | Alto | Alto |
| PBMC | No | No | |
| Leucemia linfocitica acuta | BM | Moderato | Moderato |
| Leucemia mieloide cronica | BM | Moderato | Alto |
| Leucemia linfocitica cronica | BM | Basso | Rallentare |
| PBMC | No | No | |
| Linfoma non-Hodgkin | BM | Moderato | Rallentare |
| PBMC | No | No |
Tabella 1. La sopravvivenza e la proliferazione di vari esemplari coltivati in RBM. Midollo osseo mononuclear cellule (BM), le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), o campioni di sangue mobilitate (MB) da donatori sani e pazienti con diagnosi di varie patologie maligne sono state coltivate in RBM. La tabella elenca tutti i tipi di campioni che erano coltivate in RBM con il tipo di cella (cioè BM, PBMC, o MB). L'estensione della sopravvivenza e la proliferazione delle cellule in RBM sono noti. Mentre BM e MB mostrano una crescita robusta della RBM, PBMC isolati da pazienti con varie patologie maligne non erano vitali in RBM.
Figura 1. . Rappresentazione schematica di installazione RBM RBM si compone di due fasi: 1) il rivestimento endosteale (fibronectina, collagene I (CI)) e 2) della matrice RBM (fibronectina, collagene I (CI), collagene IV (CIV) e laminina) Nota. : collagene IV e laminina sono il mcomponenti RINCIPALI di Matrigel, pertanto non è necessaria alcuna aggiunta separata di queste proteine. Queste fasi sono impostati in due fasi sovrapponendo la miscela matrice / cellula meccanismi sopra il sottile strato di matrice endosseo. Per seguire la proliferazione cellulare nel corso del tempo, le cellule possono essere etichettati con CFSE prima della miscelazione con la matrice RBM. Per tutta la durata della coltura, le cellule possono essere visualizzati mediante microscopia e la migrazione delle cellule possono essere seguite in tempo reale utilizzando un microscopio dotato di una temperatura / CO 2 camera controllata. Dopo 14-30 giorni in cellule di coltura possono essere isolate dalla matrice e sottoposti a una serie di analisi a valle, comprese sia in vitro che in vivo le procedure. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Naturalmente il tempo di auto-segregazione dei compartimenti cellulari in RBM. Cellule midollari sono state coltivate in RBM per il numero di giorni indicato. Elementi stromali diventano evidenti di giorno 14, ma possono essere rilevate fin dal giorno 5 in RBM. Nel corso delle cellule di coltura periodo può essere visto attraverso la migrazione di matrice RBM e aggregazione in gruppi distinti. Masse di cellule maligne si espandono nel tempo (confrontare le dimensioni dei cluster tra il giorno 9-30). Vista rappresentative della cultura in ogni tempo è stato catturato usando la microscopia in campo chiaro su un microscopio invertito (ingrandimento: 200X). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Compartimenti stromali sono 'forniti' all'interno della RBM. Per valutare la composizione dei componenti stromali che troppo grande per in RBM, le cellule nella zona di transizione tra matrice RBM e rivestimento endosteale sono stati valutati per la morfologia dei fibroblasti, osteoblasti, adipociti, e-specifica degli osteoclasti e di espressione marcatore . (a) Per rilevare i fibroblasti, le cellule sono state colorate per fibronectina (verde), actina (rosso), e nuclei (blu) e impressi su un microscopio confocale (ingrandimento: 200X). (b) Le cellule con morfologia stromale hanno dimostrato di essere preosteoblasts con alti livelli di attività di fosfatasi alcalina (b.1) ed in grado di mineralizzare calcio come determinato mediante colorazione Rosso alizarina (b.2). (c) Cellule con una presenza visibile di goccioline lipidiche sono stati identificati come adipociti basato su colorazione positiva con olio rosso (c.1). (d) Celle con occasionali più nuclei sono stati riconosciuti come preosteoclasts e sono risultati positivi per tartrato resistente fosfatasi acida (TRAP) (D.1). Campo chiaro e colore (non fluorescente) immagini sono state acquisite su un microscopio invertito dotato di una telecamera a colori (ingrandimento: 200X). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Il modello RBM fornisce un sistema completo in cui la composizione cellulare della BM è mantenuta ex vivo per un massimo di 30 giorni. Cellule BM coltivate in RBM self-stratificare in base alla loro funzione mimando l'architettura BM trovato in vivo. Inoltre, questo è il primo sistema che permette l'espansione del mieloma multiplo clone 8. I passi più critici per assicurare la robusta crescita delle cellule BM e il successo complessivo della coltura sono: 1) per ottenere una popolazione sana delle cellule BM con> 70% vitalità e soprattutto libera di globuli rossi, 2) per garantire che i componenti della matrice Mescolare bene e che le cellule sono distribuiti uniformemente in tutta la matrice, e 3) fare attenzione a non danneggiare la matrice quando il terreno di coltura viene aggiunto al sistema. Per garantire la robustezza proliferazione di cellule maligne, terreno di coltura deve essere integrato da plasma umano corrispondente alla diagnosi del paziente cui cellule vengono coltivate. Olimitazione ne del sistema di RBM che è stato notato è la sua incapacità di sostenere le popolazioni purificate di cellule CD34 + staminali ematopoietiche, cellule CD20 + B, e le cellule CD138 + plasma senza il compartimento stromale della BM.
Il sistema RBM è molto versatile e può essere modificato in molti modi per soddisfare al meglio gli obiettivi di studi specifici. Compartimento endoteliale può essere aggiunto al sistema per simulare la vascolarizzazione della BM e componenti della matrice extracellulare aggiuntivi possono essere forniti per portare la composizione della matrice il più vicino possibile al in vivo make-up del BM e le concentrazioni matrice può essere regolata per riflettono gli stati di malattia in cui le concentrazioni di componenti della matrice singoli possono essere modificati 21. Oltre alla coltura di cellule primarie, sistema MLF è adatto per coculturing varie linee cellulari per studiare le interazioni cellula-cellula tra specifiche popolazioni cellulari. Ad esempio, il sistema può essere impostato come un co-coltura dove stromacellule vengono piastrate su l rivestimento endostale, cellule ematopoietiche vengono aggiunti alla delle cellule stromali, e l'intero stromale / ematopoietiche coculture viene sovrapposto primo luogo con la matrice RBM e poi con il mezzo di crescita. Utile anche, potrebbero essere le modifiche della composizione media di includere il plasma da varie fonti o medie condizionate da stroma per studiare come fattori solubili influenzano il comportamento delle cellule 12. Citochine, fattori di crescita e ormoni possono anche essere aggiunti al mezzo di crescita, tuttavia, occorre prestare attenzione a non sostituire tutto terreno di crescita in coltura in una volta come fattori di crescita sostenendo che sono stati secreti dalle cellule in RBM può essere perso, così , che colpisce la redditività complessiva del sistema. Si consiglia sostituendo fino al 50% del mezzo alla volta.
Il sistema RBM può essere utilizzata per studiare sia il comportamento delle cellule (cioè la proliferazione, la vitalità, la migrazione, ecc) e per valutare la potenza e gli effetti off-target del romanzo terapeuticos 8,12. Il sistema è configurato per ricapitolare microambiente tessuto, così, l'efficacia dei farmaci sperimentali può essere valutata nelle condizioni di ambiente mediata farmaco-resistenza 14. Utilizzando live-cell tempo reale la microscopia, la vitalità cellulare nel corso del trattamento può essere valutata mediante colorazione vivo / morto e l'effetto del trattamento con vari organelli può essere valutata utilizzando più coloranti specifici organelli disponibili in commercio che facilmente penetrano la matrice RBM e sono presi-up da parte delle cellule senza generare sfondo significativo che influisca imaging.
Il sistema RBM fornisce un modello molto versatile e adattabile a studiare i disturbi BM. Il vantaggio di tale metodo di coltura 3-D rispetto alle colture standard di 2-D è la capacità di studiare il comportamento delle cellule nel contesto del microambiente tessuto garantire che gli effetti delle molteplici interazioni non sono mancati quando le cellule sono isolate dal loro fisiambiente ological e collocato in un piatto di plastica. Il ricorso del sistema RBM su modelli in vivo sta nella trasparenza del sistema in cui le interazioni che non possono essere visti in vivo a causa dei limiti di tecniche di imaging potrebbe essere facilmente sezionati. Il sistema RBM fornisce un supporto per una facile manipolazione dei componenti, pur mantenendo la composizione complessiva del tessuto, permettendo così al ricercatore di sezionare i meccanismi molecolari sotto inchiesta. Inoltre, il sistema RBM è stato convalidato come un modo economicamente efficace, rispetto al test in vivo, per condurre studi preclinici su nuove terapie 8,12. Nel loro insieme, il modello RBM fornisce un sistema in cui molti aspetti della biologia dei tessuti possono essere indagati ex vivo utilizzando campioni primari.
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Disclosures
Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award, l'American Cancer Society Research istituzionale Grant (IRG # 58-006-53), al Centro Purdue University for Cancer La ricerca e la Canadian Institutes of Health Research e Alberta Cancer Consiglio Initiative di ricerca del programma. MP è stato sostenuto dal National Institutes of Health, National Cancer Institute, la prevenzione del cancro Programma di Tirocinio (R25CA128770; PI: D. Teegarden) amministrato dal Oncologico Sciences Center e il Discovery Learning Research Center presso la Purdue University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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