Summary
Nos métodos padrão de cultura de células são retiradas do seu ambiente fisiológico e cultivadas na superfície de plástico de um prato. Para estudar o comportamento de células de medula óssea humana primária foi criado um sistema de cultura de 3-D, onde as células são cultivadas sob condições sintetizando o microambiente nativa do tecido.
Abstract
A cultura de tecidos tem sido uma ferramenta valiosa para estudar vários aspectos da função celular, a partir de desenvolvimento normal para a doença. Os métodos de cultura de células convencionais contam com a capacidade das células, quer para fixar a um substrato sólido de um prato de cultura de tecido ou de crescer em suspensão num meio líquido. Várias linhas de células imortais foram criados e cresceram utilizando tais abordagens, no entanto, esses métodos falham freqüentemente quando pilhas precisam ser cultivadas ex vivo. Tal falha é atribuída à ausência de componentes de matriz extracelular apropriados do microambiente do tecido a partir de sistemas de cultura de tecido padrão em plástico é utilizado como uma superfície para o crescimento celular. A matriz extracelular é um componente integral do microambiente do tecido e a sua presença é essencial para a manutenção de funções fisiológicas, tais como a polarização celular, sobrevivência e proliferação. Aqui apresentamos um método de cultura de tecido 3-dimensional, onde cel medula óssea primárials são cultivadas em matriz extracelular formulado para recapitular o microambiente do osso humano (sistema RBM). Incorporado na matriz extracelular, as células são fornecidos com os nutrientes através do meio suplementado com plasma humano, proporcionando, assim, um sistema global em que a sobrevivência e proliferação das células podem ser mantidas durante 30 dias, mantendo a composição celular do tecido primário. Usando o sistema RBM que cresceram com sucesso de células de medula óssea primárias de dadores normais e de pacientes com amiloidose, e várias doenças malignas hematológicas. O sistema RBM permite a visualização directa, na matriz em tempo real do comportamento celular e da avaliação da eficácia pré-clínico de novas terapias. Além disso, as células podem ser isoladas a partir da RBM e subsequentemente utilizada para a transplantação in vivo, separação de células, citometria de fluxo, e de ácidos nucleicos e a análise de proteínas. Tomados em conjunto, o método RBM fornece um sistema confiável para o crescimento de marro ósseo primáriow células sob condições fisiológicas.
Introduction
A cultura de tecidos foi desenvolvido para estudar o comportamento de células num ambiente controlado, para minimizar a variabilidade sistémica quando se comparam diversos processos em organismos intactos. Este método foi estabelecido pela primeira vez no início de 1900 e 1,2 se refere a uma técnica onde explantes de tecido foram cultivadas ex vivo em um prato de vidro. Em meados de 1900 o sistema foi adaptado para cultivar células dispersas em vez de fragmentos de tecidos intactos, e 'cultura de tecidos »e de" cultura de células "tornou-se sinônimo 3. Nestes sistemas de cultura celular convencionais células são cultivadas na superfície de plástico de cultura de tecido revestida com meio de crescimento suplementado com vários factores de crescimento. Dois tipos de culturas surgiram com base na capacidade de adesão de várias células: A cultura de células aderentes, em que as células anexar e espalhada sobre o plástico de cultura de tecidos e as culturas não aderentes, em que as células são propagadas em suspensão. Desde os primeiros dias da célulacultura, várias linhas celulares imortais foram criados, tais como HeLa 4, a primeira linha celular de cancro humano. Estas linhas de células têm a capacidade de proliferar indefinidamente em cultura de células, e a maioria não necessitam de qualquer tratamento especial para manter a viabilidade.
A abordagem redutora dos métodos de cultura de células originais foi concebido para simplificar o sistema, tanto quanto possível, incluindo apenas os componentes mínimo necessário para manter a viabilidade e a proliferação celular. No entanto, as abordagens de cultura de células simplificadas não suporta ex vivo a maioria dos tipos de células primárias humanas, com tempo de vida finito. Portanto, os novos sistemas de cultura estão a ser concebidos para aproximar o microambiente do tecido, tanto quanto possível, permitindo assim que explantes de células de crescer sob condições fisiológicas. Em contraste com as abordagens convencionais redutoras / cultura de células, 3-dimensional (3-D) de sistemas de cultura estão agora a tornar-se um método preferido para a cultura de forma eficiente várioslinhas de células humanas e células primárias para estudar posteriormente mecanismos envolvidos na saúde e na doença, no contexto de um microambiente de suporte. Tais sistemas 3-D são normalmente configurados usando matrizes e / ou médio reconstruídos suplementadas com fatores de crescimento, a fim de recapitular o microambiente do tecido para estudar os tipos de células de interesse. O primeiro destes três-dimensional (3-D) modelos de cultura foi desenvolvida para estudar o desenvolvimento da glândula mamaria. Para fornecer as células com condições nativas células epiteliais mamárias foram embutidos em Matrigel, colágeno IV e fonte rica em laminina de matriz extracelular (ECM), e coberto com meio de crescimento. Sob tais condições, as células epiteliais mamárias formado aglomerados que se assemelham a ácinos mamaria, e após estimulação com hormonas lactogênica, estes ácinos secretada caseína, e outras proteínas do leite, no Lumena oco das estruturas acini semelhante. Secreção de caseína não foi observada em culturas convencionais, mesmo após a adição de 5 prolactina, Enfatizando ainda mais o papel do microambiente em preservar as características morfológicas e fenotípicas das células. Outra demonstração da perda da função celular normal, quando as células são retiradas do contexto do seu microambiente fisiológico é uma demonstração que o microambiente sem suporte, queratinócitos não conseguem formar epiderme estratificada 6. Um número de outros modelos de 3-D, foram criados para permitir ex vivo a propagação de células primárias 7,8.
O papel crucial dos microambiente no comportamento celular foi elegantemente demonstrada num estudo em que as células epiteliais mamárias formado "inside-out" ácinos quando cultivadas em matriz de colagénio I, em comparação com os ácinos correctamente polarizado que foram formados em Matrigel. Esta perda de morfologia adequada foi revertido quando as células mioepiteliais produtoras laminina foram adicionados às culturas de colagénio I 9. Além disso, microambiente correcta é necessário para a exactamanifestação genótipo. Crescido em um prato, as células cancerosas da mama MCF7 transfectadas com uma célula-célula molécula de adesão CEACAM1 comportam-se exatamente o mesmo que as células negativas CEACAM untransfected. No entanto, quando cultivadas em Matrigel, em contato com a ECM, estruturas semelhantes a tumores formulário wildtype MCF7 enquanto as células MCF-7 transfectadas com CEACAM1 reverter para um fenótipo e forma ácinos normais com Lumena oco, como tem sido estabelecida com nonmalignant epitélio mamário 10. Da mesma forma, o bloqueio em células de cancro da mama-integrina β1 não alterar o seu comportamento em condições padrão de cultura, mas a mesma experiência realizada em culturas de 3-D demonstra que o bloqueio da integrina β1 reverte células malignas para um fenótipo normal 11. Portanto, microambiente tecido não é apenas necessário para manter a viabilidade das células, mas também para manter o funcionamento adequado das células.
Para além de proporcionar um sistema em que o comportamento de células pode ser estudado sob condições fisiológicass, culturas 3-D funciona meio como robusto e confiável para testes pré-clínicos de novas terapias 8,12,13. A cultura de células em 3-D permite a triagem de compostos de investigação sob as condições do ambiente mediado por droga-resistência 14, onde a contribuição de célula-célula e célula-ECM adesão poderia ser avaliado. Além disso, a toxicidade não-alvo de novos compostos pode ser determinada pela incorporação de múltiplos compartimentos celulares de vários tecidos. Essas telas podem ser realizadas mais rapidamente e são mais rentáveis do que os estudos comparativos in vivo 8.
Aqui apresentamos uma configuração de um modelo 3-D de medula óssea reconstruída (RBM), onde a medula óssea normal e maligno (BM), as células proliferam ex vivo em um sistema que imita de perto o microambiente da BM humano. Tentativas anteriores de crescimento de células primárias BM humanas em culturas de 2-D, líquido ou co-culturas aderentes com vários componentes do estroma BMOu 3-D, as culturas de ágar semi-sólidos tiveram um sucesso limitado devido à sua incapacidade para suprir as células com os componentes do microambiente tecido 15-18. Nestes sistemas de células de MO primários tinham viabilidade pobre e não conseguiram proliferar ex vivo. Um outro sistema em que as células progenitoras BM humanas são cultivadas em co-culturas de esferóide com células estromais da BM é um sistema de 3-D em que a viabilidade e proliferação de células estaminais hematopoiéticas foi mantida durante pelo menos 96 h 19. No entanto, apesar de altamente benéfico para a compreensão da biologia de células progenitoras hematopoiéticas, este sistema não recapitular fielmente o microambiente da BM, devido à ausência de componentes da matriz extracelular, por conseguinte, limita a sua utilidade. O modelo RBM aqui descrito apresenta um sistema global em que ambos os compartimentos celulares e extracelulares da BM humano são reconstruídos in vitro. Mostramos que as culturas RBM pode suportar ex vivo crescimento de células BM humanos normais, como nósll como células isoladas a partir de doentes com vários distúrbios hematológicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação Prévia
- Mantenha pipetas sorológicas estéreis e pontas de pipeta a 4 ° C.
Solução de problemas: géis Matrigel à temperatura ambiente (RT); usando pipetas frios e dicas impedirá Matrigel de gelificação durante a configuração da cultura. - Descongelar uma garrafa de Matrigel a 4 ° C durante a noite.
2. Preparação dos Reagentes
- Preparação da solução de fibronectina: Preparar uma solução de 1 mg / ml de caldo de fibronectina por dissolução de 100 mg de fibronectina humana em 100 ml de água destilada. Uma vez que a fibronectina se dissolva, o filtro esterilizado, alíquota, e armazenar a 4 ° C durante até 6 meses.
Solução de problemas: se a fibronectina não se dissolve rapidamente incubar a solução durante alguns minutos, em um conjunto de banho de água a 37 ° C. - Preparação de 10x PBS: Dissolve-se 80 g de cloreto de sódio NaCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2 g de KCl e 2,4 g de KH 2 PO
- Preparação do tampão de neutralização 20: Preparar uma solução contendo 100 mM de HEPES em 2x tampão fosfato salino (PBS) utilizando HEPES 1 M e as soluções de reserva 10x de PBS. Ajustar o pH da solução para 7,0. Armazenar a 4 ° C por 2-3 meses.
- Preparação de solução de 2 mg / ml de colagénio tipo I da cauda de rato: Preparar uma solução de 2 mg / ml de colagénio I no tampão de neutralização (passo 2.3). Vortex a solução em baixa velocidade e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. Como este colágeno é muito viscoso, evitar a geração de bolhas de ar, enquanto a pipetagem. Recomenda-se a preparar solução de colágeno I fresco o tempo todo. Manter a solução em gelo até à utilização.
- Preparação de revestimento endosteal (Rend): Mistura de 1 mg / ml de estoque de fibronectina com 2 mg / ml de colagénio I estoque (passos 2.1 e 2.4) para uma concentração final de 77 ug / ml e 29 ug / ml, respectivamente, em 1x &# 160; PBS estéril. Misturar e armazenar a 4 ° C durante até 1 mês.
- Preparação da matriz óssea reconstruída (RBM):
- Precool 1,5 ml microtubos em gelo. Mantenha todas as soluções de matriz sobre gelo em todos os momentos.
- Misture 4 partes Matrigel (concentração Matrigel varia de lote para lote, mas as variações foram encontrados para ser insignificante), 2,5 partes de 1 mg / ml fibronectina e 1 parte de 2 mg / ml de colágeno I no gelo pela primeira pipetagem em Matrigel do tubo por meio de pontas de pipeta frio e, em seguida, adicionar a fibronectina e o colagénio I. Matrigel começará solidificar a temperaturas acima de 4 ° C, de modo que funcione rapidamente enquanto pipetando Matrigel. Misture a matriz muito suavemente pipetando cima e para baixo, evitar a introdução de bolhas. Manter os tubos em gelo, enquanto a mistura do RBM.
- Preparação do meio de crescimento da medula óssea (BMGM): Adicione 500 ml de BMGM contendo 6,2 x 10 -4 M de CaCl2, 10 succinato de sódio 6 M, de 10 -6 M de hidrocortisona, 20% de plasma humano (, e 1% de penicilina / estreptomicina normal ou maligno recolhido de dadores saudáveis ou de doentes), em meio RPMI-1640. CaCl2, succinato de sódio, e suplementos de hidrocortisona pode ser armazenada a -80 ° C durante> 6 meses como soluções stock x 1000. Ao crescer linhas de células, soro fetal de bovino (FBS) pode ser substituído por plasma humano.
- Preparação de 10% formalina neutra tamponada (NBF): Adicionar solução de estoque de formaldeído 37% de 1x PBS a 10% v / v Misture bem e guarde em temperatura ambiente por 2-3 semanas protegido da luz.
- Preparação de 1% de albumina sérica bovina (BSA): Pesar quantidade adequada de BSA e dissolvê-lo em PBS 1x. Armazenar a 4 ° C e utilizar no prazo de 1 semana. BSA solução tende a se contaminar se mantido refrigerado por períodos mais longos. Alternativamente, a solução de BSA pode ser divididos em alíquotas e congeladas a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Evite ciclos de congelamento e descongelamento.
- Preparação de solução de recuperação de células (CRS): Fazer EDTA 5 mM, vanadato de sódio 1 mM (Na <solução sub> 3 VO 4) e 1,5 mM de fluoreto de sódio (NaF) em PBS 1x. Filtro estéril e armazenar a 4 ° C até 6 meses.
3. Incorporado Cultura 3-D de Células BM Humano não malignas e malignas
- Purificar pilhas mononucleares BM por Ficoll-Plaque centrifugação em gradiente de acordo com as instruções do fabricante.
Passo opcional: as células podem ser marcadas com 0,25 uM de diacetato de carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (CFSE) segundo as instruções do fabricante para seguir a proliferação de células ao longo do período de cultura.
Solução de problemas: Se as células morrem após coloração CFSE, titular a quantidade de CFSE como a concentração depende do tipo de célula; 0,25 mM funciona bem para pilhas mononucleares BM. - Adicionar 65 ml de solução de rend em cada poço de uma cultura tratada placa tecido 48 poços. Espalhar a solução uniformemente para cobrir toda a superfície do poço e incubar durante> 30min à temperatura ambiente.
- Prepare a suspensão de células a uma densidade de 0,5 x 10 6 células em 10 ul de 1x PBS por poço de uma placa de 48 poços. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml misturar a suspensão de células com 100 ul de matriz RBM por poço. Misture as células e matriz RBM cuidado pipetando para cima e para baixo; evitar a introdução de bolhas. Manter a mistura de células / matriz em gelo para evitar a gelificação da matriz.
Nota: o sistema RBM é totalmente escalável, para configurar o sistema em um formato não-48-bem, ajustar as quantidades de todos os reagentes (matrizes e médio) com base na área da superfície da placa utilizada. Dimensionar o número de células a ser revestida em conformidade. - Aspirar o restante Rend e adicionar a mistura de células / matriz para o centro de um poço. Rapidamente, espalhou-se a mistura de células / matriz para cobrir toda a superfície do poço de forma uniforme. Colocar a placa durante 30-60 minutos em 37 ° C, 5% de CO 2 de tecido de cultura incubadora para permitir que a matriz para solidificar. Não agite ou disTurb a placa durante a incubação.
Solução de problemas: Para evitar a distribuição desigual de células em RBM, misture bem antes de plaqueamento. Misturar após cada 5 th bem preparada para evitar células de decantação para o fundo do tubo. Uma vez banhado, as células não se afundam para o fundo do poço, devido à tensão superficial na matriz.
Solução de problemas: Para evitar a distribuição desigual de células em RBM, misture bem antes de plaqueamento. Misturar após cada 5 th bem preparada para evitar células de decantação para o fundo do tubo. Uma vez banhado, as células não se afundam para o fundo do poço, devido à tensão superficial na matriz. - Pré-aquecer BMGM em um banho de água regulado para 37 ° C.
- Após 30 minutos, verifique se a matriz não definiu corretamente, que irá formar um gel macio como camada que não se move quando a placa é inclinada. Sobreponha a camada de células / matriz com 1 ml de quente BMGM. Para evitar o rasgar da pipeta matriz do meio muito suavemente (distribuição gota-a-gota) usandouma pipeta serológica. Coloque a cultura RBM montado em um de 37 ° C, 5% de CO 2 de tecido de cultura de incubação e cultura para o período de tempo desejado.
Nota: a viabilidade celular seja mantida durante pelo menos 30 dias, sem alterar médio, se for necessária uma mudança de meio apenas alterar 50% de meio de cada vez.
Passo crítico: É fundamental que o meio não é frio como a temperatura fria possa perturbar a matriz já definida. Tome cuidado para não fazer jorrar o meio em cima da matriz em que poderia quebrar a camada de matriz macia.
Solução de problemas: Se a viabilidade das células no sistema RBM é baixa, densidade celular pode ter que ser determinada experimentalmente quando se trabalha com diferentes células mononucleares primários de aspirados BM células. Quando trabalhar com as linhas de células, diminuir o número de células de 10 vezes, como as linhas de células imortalizadas proliferam mais rapidamente do que as células primárias.
4. Imagem 'In-matriz'
- Imagem células cultivadas diretamente em RBM usando campo claro, contraste de interferência diferencial (DIC), confocal ou quaisquer outras técnicas de imagem que permitem imagens de longa distância como a matriz é de cerca de um milímetro de espessura. Use o recurso Z-stack disponível em muitos dos microscópios para a imagem de toda a cultura de cima para baixo.
Dica: Para o protocolo immunostaining abaixo evitar aspiração de soluções de coloração / lavar, em vez inclinar o prato e retire soluções usando uma pipeta.
- Remover o BMGM usando uma pipeta e lava-se 2 a 3 vezes com 100 ul / lavagem / poço de RT de 1x PBS. Certifique-se de que um número suficiente de PBS é utilizado para cobrir toda a superfície do poço.
- Fix células na matriz através da adição de 100 uL / poço (para uma placa de 48 poços) de NBF a 10% durante 15 min à temperatura ambiente. Retirar NBF e lavar as células duas vezes com 100 ul / lavagem / poço de RT de 1x PBS.
Nota: Evite o uso de frio NBF como pode liquefazer a matriz. - Remover PBS, adicionar 1% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite, a fim de bloquear a ligação não específica de anticorpos.
- Preparar a solução de anticorpo primário em 1% de BSA a uma diluição necessária. Diluição irá variar para cada anticorpo, verifique com o fabricante ou o titular para determinar a concentração de anticorpos ideal. Adicionam-se 100 ul / poço de solução de anticorpo primário e incubar de acordo com as instruções do fabricante.
Passo crítico: Todas as incubações envolvendo anticorpos conjugados com fluoróforos ou corantes fluorescentes deve ser realizada no escuro. - Retirar solução de anticorpo primário e lava-se 3x com 1x PBS durante 5 min.
- Para coloração por imunofluorescência indirecta, incubar com um anticorpo secundário conjugado com marcador fluorescente durante 1 hora a RT. Dilui-se os anticorpos em BSA a 1% em concentração sugerido pelo fabricante.
- Retirar a um derivadontibody solução e lavar 3x com 1x PBS durante 5 min.
Solução de problemas: Para evitar a alta fundo durante o exame, titular anticorpos secundários conjugados fluorescentes e utilizar a menor concentração que fornece sinal é adequada. Se a alta fundo ainda é um problema, aumentar o número ea duração das etapas de lavagem, ou utilizar anticorpos primários diretamente conjugados, e ignore o passo 4.2.6. - Para corar os núcleos adicionar 4 ',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) de solução de coloração nuclear, na diluição recomendada pelo fabricante, e incubar durante 7-10 min à temperatura ambiente.
- Retirar solução de coloração nuclear e lavar 2x com PBS 1x, durante 5 min.
- Remover o PBS a partir da última lavagem e adicionar uma gota de meio de montagem (conjunto regular), por exemplo para preservar a fluorescência. Imagem usando as configurações de excitação / emissão adequadas em um microscópio fluorescente ou confocal.
Nota: Imagem deve ser feito no prazo de 2 dias de coloraçãopara evitar a degradação da matriz e a perda da integridade e da perda de sinal fluorescente RBM. Se não fotografada imediatamente, as amostras coradas devia ser mantida a 4 ° C, protegida da luz, até imagiologia.
5. Isolamento de Células de RBM
- Remova o meio suavemente, sem perturbar a camada de matriz. Não aspirar.
- Lave as células 2x com PBS 1x estéril. Não aspirar.
- Adicionar 0,5 ml de CRS gelada a cada poço e remover toda a camada da matriz, juntamente com as células, por vigorosamente pipetando para cima e para baixo. Coletar as células, matriz e CRS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque no gelo.
- Adicionar um adicional de 0,5 ml CRS para o mesmo bem e recolher todo o material restante. Transferência para o mesmo tubo de microcentrífuga.
- Vortex da mistura de células, matriz e CRS e incubar no gelo por 1 hora. Células de vórtice cada 15 min para facilitar a libertação a partir da matriz.
- Verifique a mistura depois de 1 hora, sem aglomerados visíveisde matriz deve estar presente.
Solução de problemas: se contiver pedaços de matriz ainda são visíveis depois de 1 hora, as células de transferência / matriz / CRS mistura para um tubo maior, adicionar adicional 2-5 ml de CRS, e incubar por um 30-60 min. - Centrifugar células em CRS a 1.000 rpm para 5-10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS 1x frio.
- Centrifugar a 1000 rpm durante 5-10 min e remover o sobrenadante. Repetir a lavagem de PBS mais uma vez.
- A segunda lavagem PBS completa a recuperação das células a partir da matriz e as células isoladas podem ser usadas para todas as aplicações a jusante, tais como o isolamento de DNA / RNA / proteína, a citometria de fluxo in vivo de transplante, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma vez que as células de medula óssea primária não proliferam em condições de cultura de tecidos padrão, o sistema RBM foi criado para imitar de perto o microambiente do osso, proporcionando um sistema de cultura e expandir células BM ex vivo. Os principais componentes da matriz extracelular BM, fibronectina, colagénio I, colagénio IV e laminina 21, foram incorporados em matriz RBM para fornecer o andaime estrutural para esta cultura em 3-D. Endósteo, o interface entre o osso e a BM, rico em colagénio I e fibronectina, foi reconstruída por revestimento da superfície de um prato de cultura de tecido com estas proteínas. Diafonia entre vários compartimentos celulares dentro da BM contribui para a homeostase global do tecido. Para garantir que nenhum dos componentes celulares são deixados de fora, a cultura RBM foi criada usando células mononucleares não fraccionados de BM biópsias agulha aspirado humanos. Para assegurar que o sistema é fornecido com hormonas, factores de crescimento, umad citoquinas presentes no meio circulatório, o meio de cultura foi suplementado com plasma humano correspondente ao modelo a ser cultivadas (ou seja, do plasma de dadores normais foi adicionado quando as células não malignas BM foram colocados em RBM, enquanto que o plasma do paciente foi adicionado às culturas de maligna células) (Figura 1).
BM e amostras de sangue de doadores saudáveis e de pacientes com diversas doenças hematológicas foram coletados após aprovação pela Purdue University e University of Alberta Institucionais de Pesquisa Conselhos e após consentimento livre e esclarecido, de acordo com a Declaração de Helsinque (Tabela 1). As células mononucleares isoladas a partir de biópsias BM proliferar e manter a sua viabilidade no sistema RBM para até 30 dias (Figura 2). A concentração de células de 0,5 x 10 6 cells/100μl de matriz RBM foi determinada como sendo a densidade óptima de células de MO primárias. Indo além this densidade superlota o sistema diminuindo a viabilidade das células e as taxas de proliferação ao longo do tempo. Uma densidade mais baixa tem sido também mostrado ser prejudicial para a saúde em geral do sistema de contactos célula-célula demonstraram ser vitais para o crescimento celular robusto. Crescimento dentro da RBM pode ser seguido após marcação das células com diacetato de carboxifluoresceína, éster succinimidyl (CFSE). A intensidade da fluorescência de CFSE metades a cada divisão celular, assim, a proliferação celular pode ser rastreado por microscopia ou citometria de fluxo ao longo do tempo. Além disso, os compartimentos celulares dentro da cultura RBM são mantidos nas mesmas proporções que estavam presentes nas amostras de biópsia 8. Além das células de linhagens hematopoiéticas, compartimentos estromais exibem um crescimento robusto nas RBM. Fosfatase alcalina expressa osteoblastos capazes de cálcio mineralizante, tartarato osteoclastos fosfatase de coloração ácido resistentes, óleo adipócitos positivos vermelhos, e produzindo células estromais fibronectina são encontrados no endósteo/ Interface de BM do sistema RBM (Figura 3).
Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram que o modelo RBM fornece um primeiro sistema ex vivo onde as células BM humanas primárias de dadores saudáveis e de doentes com várias doenças malignas hematológicas, tais como leucemia, linfoma e mieloma múltiplo pode ser sustentada e expandida por até 30 dias. RBM fornece um modelo para estudar o comportamento global da célula sob condições fisiológicas, no contexto do microambiente nativo BM. Este sistema tem sido utilizado pelo nosso laboratório para identificar o fenótipo das várias células estaminais de cancro mieloma e para estudar as interacções entre as células malignas e a matriz extracelular BM, bem como a conversa cruzada entre as células malignas e o estroma BM.
| Diagnóstico | Tipo de célula | Sobrevivência | |
| Não oncológica | BM | Moderado | Moderado |
| Amiloidose | BM | Alto | Alto |
| Gamopatia monoclonal de significado indeterminado | BM | Alto | Alto |
| PBMC | Não | Não | |
| Plasmocitoma | BM | Alto | Alto |
| Mieloma múltiplo latente | BM | Alto | Alto |
| O mieloma múltiplo | BM | Alto | Alto |
| PBMC | Não | Não | |
| MB | Alto | Alto | |
| Leucemia de células plasmáticas | BM | Alto | Alto |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | High | Alto |
| Leucemia mielóide aguda | BM | Alto | Alto |
| Leucemia promielocítica aguda | BM | Alto | Alto |
| PBMC | Não | Não | |
| Leucemia linfocítica aguda | BM | Moderado | Moderado |
| Leucemia mielóide crônica | BM | Moderado | Alto |
| A leucemia linfocítica crônica | BM | Baixo | Lento |
| PBMC | Não | Não | |
| O linfoma não-Hodgkin | BM | Moderado | Lento |
| PBMC | Não | Não |
Tabela 1. Sobrevivência e proliferação de vários espécimes cultivados em RBM. Medula óssea mononuclear células (BM), as células mononucleares do sangue periférico (PBMC), ou amostras de sangue mobilizado (MB) a partir de dadores saudáveis e de doentes com o diagnóstico de várias doenças malignas foram cultivadas em RBM. A tabela lista todos os tipos de amostras que foram cultivadas em RBM, juntamente com o tipo de célula (isto é, a BM, as PBMC, ou MB). O grau de sobrevivência e proliferação das células na RBM são anotados. Enquanto BM e MB apresentam um crescimento robusto em RBM, PBMCs isoladas de pacientes com diversas doenças malignas não eram viáveis em RBM.
Figura 1. . Representação esquemática da configuração RBM RBM consiste em duas fases: 1) o revestimento endostal (fibronectina, colágeno I (CI)) e 2) da matriz RBM (fibronectina, colágeno I (CI), colágeno IV (CIV) e laminina) Nota. : colagénio IV e laminina são o mcomponentes RINCIPAIS de Matrigel, portanto não é necessária nenhuma adição separada destas proteínas. Essas fases são configurados em duas etapas através da sobreposição da matriz mistura RBM / celular em cima da fina camada de matriz intra-ósseo. Para seguir a proliferação de células ao longo do tempo, as células podem ser marcadas com CFSE, antes da mistura com a matriz RBM. Ao longo da duração da cultura, as células podem ser visualizados por microscopia e a migração de células pode ser seguida em tempo real usando um microscópio equipado com um / CO 2 câmara de temperatura controlada. Após 14-30 dias em cultura de células pode ser isolado a partir da matriz e submetido a uma variedade de análises a jusante, incluindo tanto in vitro e em procedimentos in vivo. clique aqui para ampliar.
Figura 2. Curso Tempo de auto-segregação de compartimentos celulares em RBM. Células BM foram cultivadas em RBM para o número indicado de dias. Elementos do estroma se tornam evidentes no dia 14, mas pode ser detectado mais cedo dia 5 em RBM. Durante o curso das células período de cultura pode ser visto a migração através da matriz RBM e agregação em grupos distintos. Massas de células malignas expandir ao longo do tempo (compare o tamanho do cluster entre os dias 9-30). Vista Representante da cultura em cada momento foi capturado usando microscopia de campo claro em um microscópio invertido (aumento de 200X). Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Compartimentos estromais são "oferecidos" dentro da RBM. Avaliar a composição dos componentes do estroma que superam em RBM, células na transição entre a matriz RBM e revestimento endostal foram avaliadas quanto a morfologia de fibroblastos, osteoblastos, adipócitos e específicas dos osteoclastos e expressão do marcador . (a) Para detectar os fibroblastos, as células foram coradas para a fibronectina (verde), actina (vermelho), e os núcleos (azul) e fotografadas num microscópio confocal (ampliação: 200x). (b) As células com a morfologia de estroma foram mostrados para ser preosteoblasts com níveis elevados de actividade de fosfatase alcalina (b.1) e capaz de mineralização de cálcio, conforme determinado por coloração com vermelho de alizarina (b.2). (c) As células com uma presença visível de gotículas lipídicas foram identificados como adipócitos com base na coloração positiva com Red Oil (c.1). (d) As células com ocasionais vários núcleos foram reconhecidos como preosteoclasts e foram positivos para fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) (d.1). Campo brilhante e cor (não fluorescentes) imagens foram obtidas em um microscópio invertido equipado com uma câmera de cor (aumento de 200X). Clique aqui para ver imagem ampliada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O modelo RBM fornece um sistema completo onde a composição celular da BM é mantida ex vivo por até 30 dias. BM células cultivadas em RBM auto-estratificar de acordo com a sua função mimetizando a arquitetura BM encontrado in vivo. Além disso, este é o primeiro sistema que permite a expansão do clone de mieloma múltiplo de 8. Os passos mais críticos para assegurar o crescimento robusto de células de MO e o sucesso global da cultura são: 1) para obter uma população saudável das células de MO com> 70% de viabilidade e principalmente livre de células vermelhas do sangue, 2) para assegurar que os componentes de matriz são bem misturados e que as células são distribuídos uniformemente por toda a matriz, e 3) para tomar cuidado para não danificar a matriz, quando o meio de crescimento é adicionado ao sistema. Para assegurar a proliferação de células malignas robusto, o meio de crescimento deve ser suplementado com plasma humano correspondente ao diagnóstico do paciente cujas células estão a ser cultivadas. One limitação do sistema RBM que foi notado é a sua incapacidade de suportar populações puras de células CD34 + hematopoiéticas estaminais, células B CD20 + e células CD138 + de plasma sem o compartimento estromal da BM.
O sistema RBM é altamente versátil e pode ser modificado de várias maneiras para melhor atender os objetivos de estudos específicos. Compartimento endotelial pode ser adicionado ao sistema para imitar a vascularização da BM e de componentes adicionais da matriz extracelular podem ser fornecidos para levar a composição da matriz tão próximo quanto possível para a eficácia in vivo faz-se da BM e as concentrações de matriz pode ser ajustado para reflectir os estados de doença onde as concentrações dos componentes de matriz individuais podem ser alterados 21. Além disso a cultura de células primárias, RBM sistema é adequado para coculturing várias linhas de células para o estudo das interacções célula-célula entre as populações de células específicas. Por exemplo, o sistema pode ser configurado como um co-cultura, onde estromal células são semeadas sobre o revestimento do endósteo, as células hematopoiéticas são adicionados por cima das células do estroma, e toda a co-cultura de estroma / hematopoiético é sobreposta pela primeira vez com a matriz RBM e, em seguida, com o meio de crescimento. Também é útil, poderia ser as modificações da composição do meio para incluir plasma a partir de várias fontes ou meio condicionado por estroma para estudar como fatores solúveis afetam o comportamento da célula 12. As citocinas, factores de crescimento e hormonas também podem ser adicionados ao meio de crescimento, no entanto, deve ser tomado cuidado para não substituir todo o meio de crescimento na cultura de uma só vez, como factores de crescimento de sustentação que foram secretados pelas células em RBM pode ser perdido, assim , que afecta a viabilidade global do sistema. Sugerimos substituindo até 50% do meio de cada vez.
O sistema RBM pode ser usado para estudar tanto o comportamento da pilha (isto é, a proliferação e viabilidade, a migração, etc) e para avaliar a potência e os efeitos fora do alvo da nova terapêuticaé 8,12. O sistema está configurado para recapitular o microambiente do tecido, assim, a eficácia de medicamentos de investigação podem ser avaliadas sob as condições do ambiente mediado por droga-resistência 14. Usando a microscopia em tempo real em células vivas, a viabilidade celular durante o curso do tratamento pode ser avaliada por coloração vivo / morto e o efeito do tratamento em vários organelos pode ser avaliada usando vários corantes específicos de organelos disponíveis comercialmente que penetram facilmente na matriz e RBM são absorvido pelas células sem gerar fundo significativo que poderia afectar de imagem.
O sistema RBM fornece um modelo muito versátil e adaptável para o estudo das doenças da BM. A vantagem de tal método de cultura de 3-D, em comparação com as culturas de 2-D-padrão está na capacidade de estudar o comportamento das células, no contexto do microambiente tecido assegurar que os efeitos das várias interacções não são perdidas quando as células são isoladas a partir de sua físiological ambiente e colocada num prato de plástico. O apelo do sistema RBM sobre modelos in vivo encontra-se na transparência do sistema, onde as interações que não podem ser vistas in vivo, devido às limitações de técnicas de imagem poderia ser facilmente dissecados. O sistema RBM fornece um meio para facilitar a manipulação dos componentes, mantendo a composição global do tecido, permitindo assim que o pesquisador para dissecar os mecanismos moleculares sob investigação. Além disso, o sistema RBM foi validado como uma maneira de baixo custo, em comparação com os ensaios in vivo, a realização de estudos pré-clínicos de novas terapias 8,12. Tomados em conjunto, o modelo RBM proporciona um sistema em que diversos aspectos da biologia do tecido pode ser investigado ex vivo, utilizando amostras primárias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer (1R21CA141039), BD Biosciences Research Award Grant, a Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional (IRG # 58-006-53), para o Centro de Purdue University para o cancro Pesquisa, e do Canadian Institutes of a iniciativas de pesquisa Programa de Alberta Cancer Research Board e Saúde. MP foi apoiado pelo National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Programa de Estágio (R25CA128770; PI: D. Teegarden), administrado pelo Centro de Ciências Oncológicas e do Centro de Pesquisa de Aprendizagem Descoberta da Universidade de Purdue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
