Summary
I standardodlingsmetoder celler tas ut ur deras fysiologiska miljö och odlas på plastytan av en maträtt. För att studera beteendet hos primära humana benmärgsceller vi skapat en 3-D-kultursystem, där celler odlas under betingelser rekapitulera den nativa mikromiljö av vävnaden.
Abstract
Vävnadskultur har varit ett ovärderligt verktyg för att studera många aspekter av cellernas funktion, från normal utveckling till sjukdomen. Konventionella cellkulturmetoder är baserade på förmågan hos celler antingen för att fästa till en fast substrat av en vävnadsodlingsskål eller att växa i suspension i flytande medium. Flera odödliga cellinjer har skapats och odlas med hjälp av sådana metoder, men dessa metoder misslyckas ofta när primära celler måste odlas ex vivo. Ett sådant fel har tillskrivits det saknas lämpliga extracellulära matriskomponenter i vävnadsmikromiljö från standardsystemen där vävnadsodlingsplast används som en yta för celltillväxt. Extracellulär matrix är en integrerad del av vävnaden mikromiljön och dess närvaro är avgörande för att upprätthålla fysiologiska funktioner såsom cell polarisering, överlevnad och spridning. Här presenterar vi en 3-dimensionell vävnadskultur metod där primär benmärgs cells odlas i extracellulär matrix formulerad att rekapitulera mikromiljön av mänskliga ben (rbM systemet). Inbäddad i den extracellulära matrisen, celler förses med näringsämnen genom medium kompletterat med humant plasma, vilket ger ett omfattande system där cellöverlevnad och-proliferation kan upprätthållas i upp till 30 dagar under upprätthållande av den cellulära sammansättningen av primärvävnad. Använda rbM-systemet har vi framgångsrikt vuxit primära benmärgsceller från normala donatorer och patienter med amyloidos, och olika hematologiska maligniteter. RBM-systemet möjliggör direkt, i-matris realtid visualisering av cellens beteende och utvärdering av prekliniska effekt av nya behandlingar. Dessutom kan celler isoleras från rbM och därefter användas för in vivo transplantation, cellsortering, flödescytometri, och nukleinsyra-och proteinanalys. Sammantaget ger rbM metoden ett tillförlitligt system för tillväxten av primära ben Marrow celler under fysiologiska förhållanden.
Introduction
Vävnadskultur har utvecklats för att studera cellbeteende i en kontrollerad miljö för att minimera systemiska variabilitet när man jämför olika processer i intakta organismer. Denna metod var först i början av 1900 1,2 och hänvisar till en teknik där vävnadsexplantat odlades ex vivo i en glasskål. I mitten av 1900-talet att systemet anpassades för att växa spridda celler snarare än fragment av intakta vävnader, och termerna "vävnadskultur" och "cellkultur" blev synonymt 3. I sådana konventionella cellodlingssystem celler odlas på ytan av vävnadsodlingsplast belagd med tillväxtmedium kompletterat med olika tillväxtfaktorer. Två typer av kulturer har vuxit fram utifrån vidhäftningsförmåga av olika celler: anhängare cellodling, där celler fäster och sprids på vävnadsodling plast och icke-vidhäftande kulturer, där celler förökas i suspension. Sedan början av cellkultur, flera odödliga cellinjer har skapats, som t.ex. HeLa 4, den första mänskliga cancer cellinje. Dessa cellinjer har kapacitet att föröka sig på obestämd tid i cellkultur, och de flesta inte kräver någon särskild behandling för att bibehålla lönsamheten.
Den reduktionistiska synsätt av de ursprungliga cellodlingsmetoder har utformats för att förenkla systemet så mycket som möjligt genom att ta med endast ett minimum komponenter som krävs för att upprätthålla cellernas livskraft och spridning. Men förenklade cellodlings metoder misslyckas med att stödja ex vivo mest primära humana celltyper med begränsad livslängd. Därför är nya odlingssystem utformas för att approximera vävnaden mikromiljö så nära som möjligt, så att cell explants att växa under fysiologiska förhållanden. I motsats till de konventionella / reduktionistiska cellodlings tillvägagångssätt, 3-dimensionella (3-D) kultursystem blir nu en föredragen metod för att effektivt kultur olikahumana cellinjer och primära celler att därefter studera mekanismer som är involverade i hälsa och sjukdom, i samband med en stödjande mikromiljö. Sådana 3-D-system är vanligtvis konfigureras med rekonstruerade matriser och / eller medium kompletterat med tillväxtfaktorer, för att rekapitulera vävnaden mikromiljön för att studera celltyperna av intresse. Den första av dessa tre-dimensionella (3-D) odlingsmodeller har utvecklats för att studera bröstkörtelutveckling. För att förse cellerna med inhemska förhållanden bröst epitelceller var inbäddade i Matrigel, kollagen IV och laminin-rik källa av extracellulärt matrix (ECM), och överdrog med tillväxtmedium. Under sådana betingelser de bröstepitelceller bildade kluster liknar bröstkörtelgångar, och vid stimulering med laktogen hormoner, är dessa acini utsöndrade kasein och andra mjölkproteiner, in i den ihåliga Lumena av acini liknande strukturer. Kasein utsöndring observerades inte i standard kulturer även efter tillsats av prolaktin 5, Ytterligare betona betydelsen av mikromiljön för att bevara de morfologiska och fenotypiska egenskaper hos celler. En annan demonstration av förlust av normal cellulär funktion när cellerna tas ut ur det sammanhang de fysiologiska mikromiljö är en demonstration som utan stödjande mikromiljö, keratinocyter misslyckas med att bilda skiktade epidermis 6. Ett antal andra 3-D modeller har skapats för att låta ex vivo förökning av primära celler 7,8.
Den avgörande roll som mikromiljö i cellens beteende var elegant visats i en studie där bröst epitelceller bildade "inifrån och ut" acini vid odling i kollagen I matris, jämfört med den rätt polarise acini som bildades i Matrigel. Denna förlust av korrekt morfologi återgick när laminin producerande myoepitelceller sattes till kollagen I kulturer 9. Dessutom är korrekta mikromiljö krävs för korrektgenotyp manifestation. Odlades i en maträtt, MCF7 bröstcancerceller transfekterade med en cell-celladhesionsmolekyl CEACAM1 uppför sig exakt på samma sätt som de otransfekterade CEACAM negativa celler. Emellertid då de odlas i Matrigel, i kontakt med ECM, vildtyp MCF7 formulärtumörliknande strukturer medan MCF7-celler transfekterade med CEACAM1 återgå till en normal fenotyp och formen acini med ihålig Lumena, såsom har fastställts med nonmalignant mammary epitel 10. På samma sätt blockerar β1-integrin i bröstcancerceller inte ändrar sitt beteende under normala odlingsbetingelser, men samma experiment utförs i 3-D kulturer visar att blockera β1-integrin återgår maligna celler till en normal fenotyp 11. Därför vävnadsmikromiljö inte bara krävs för att upprätthålla cellernas livskraft, men också för att behålla korrekt cellernas funktion.
Förutom att åstadkomma ett system där cellens beteende kan studeras under fysiologiska tillstånds, 3-D kulturer fungera som robust och tillförlitlig medium för preklinisk testning av nya behandlingar 8,12,13. Odling av celler i 3-D möjliggör screening av prövnings föreningar enligt villkoren i miljö-medierade läkemedelsresistens 14, där kunde bedömas bidrag cell-cell och cell-ECM vidhäftning. Vidare kan off-toxicitet av nya föreningar kan fastställas genom att införliva flera cellulära fack i olika vävnader. Sådana skärmar kan utföras snabbare och är mer kostnadseffektiv än de jämförbara studier in vivo 8.
Här presenterar vi en installation av en 3D-modell av rekonstruerad benmärgen (RBM) där normal och malign benmärg (BM) celler föröka ex vivo i ett system noga härma mikromiljö av den mänskliga BM. Tidigare försök att odla primära humana BM celler i 2-D kulturer, flytande eller fastsittande samodlingar med olika komponenter i BM stromaEller 3-D, har halvfasta ägarkulturer haft begränsad framgång på grund av deras oförmåga att förse cellerna med komponenterna i vävnadsmikromiljö 15-18. I dessa system hade primära BM celler dålig lönsamhet och misslyckades med att föröka ex vivo. Ett annat system där mänskliga BM progenitorceller odlas i sfäroida samodlingar med BM stromaceller är en 3-D system där hematopoetisk stamcellstransplantation livskraft och spridning stod i minst 96 h 19. Men även till stor nytta för förståelsen av det hematopoietiska progenitor biologi, detta system inte troget rekapitulera mikromiljön av BM på grund av frånvaro av ECM-komponenter därför begränsa dess användbarhet. RBM modell som beskrivs här utgör ett omfattande system där både mobil-och extracellulära fack i den mänskliga BM rekonstrueras in vitro. Vi visar att RBM kulturer kan stödja ex vivo tillväxten av normala mänskliga BM celler, som vill som celler som isolerats från patienter med olika blodsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Advance Beredning
- Håll sterila serologiska pipetter och pipettspetsar vid 4 ° C.
Felsökning: Matrigel geler vid rumstemperatur (RT), som använder kallt pipetter och tips kommer att hindra Matrigel från gelbildande under kultur installationen. - Tina en flaska Matrigel vid 4 ° C över natten.
2. Beredning av reagens
- Preparation av fibronektin-stamlösning: Gör en 1 mg / ml stamlösning av fibronektin genom upplösning av 100 mg humant fibronektin i 100 ml destillerat vatten. När fibronektin har lösts upp, sterilfilter, alikvoteras och förvaras vid 4 ° C i upp till 6 månader.
Felsökning: Om fibronektin inte löses snabbt inkubera lösningen under några minuter i ett vattenbad vid 37 ° C. - Beredning av 10x PBS: Lös upp 80 g natriumklorid NaCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2 g KCl och 2,4 g KH 2 PO
- Framställning av neutraliseringsbuffert 20: Gör en lösning innehållande 100 mM HEPES i 2 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1 M HEPES och 10x PBS stamlösningar. Justera lösningens pH till 7,0. Förvaras vid 4 ° C i 2-3 månader.
- Framställning av 2 mg / ml lösning av råttsvanskollagen typ I: till en 2 mg / ml kollagen I lösningen i neutraliseringsbuffert (steg 2.3). Vortexa lösningen vid låg hastighet och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned. Eftersom detta kollagen är mycket trögflytande, undvika generering av luftbubblor under pipettering. Det rekommenderas att förbereda kollagen I lösning fräsch varje gång. Förvara lösningen på is tills användning.
- Framställning av endosteal beläggning (Rend): Blanda 1 mg / ml fibronektin lager med 2 mg / ml kollagen I lager (steg 2,1 och 2,4) till en slutlig koncentration av 77 | ig / ml och 29 | ig / ml i 1 x &# 160, steril PBS. Blanda och förvara vid 4 ° C i upp till en månad.
- Beredning av rekonstruerade benvävnad (rbM):
- Förkyla 1,5 ml mikrorör på is. Håll alla matrislösningar på is hela tiden.
- Blanda 4 delar Matrigel (Matrigel koncentration varierar från parti till parti, men variationerna befanns vara försumbara), 2,5 delar 1 mg / ml fibronektin och 1 del av 2 mg / ml kollagen jag på is genom att först pipettering Matrigel in röret med hjälp av kall pipettspetsar och sedan lägga till fibronektin och kollagen I. Matrigel börjar stelnar vid temperaturer över 4 ° C, så arbeta snabbt medan pipettering Matrigel. Blanda grundmassan mycket försiktigt genom pipettering upp och ner, undvika att införa bubblor. Håll rören på is samtidigt blanda rbM.
- Beredning av benmärg tillväxtmedium (BMGM): Gör 500 ml BMGM innehållande 6,2 x 10 -4 M CaCl2, 10 -6 M natriumsuccinat, 10 -6 M hydrokortison, 20% humanplasma (normal eller malign samlas in från friska givare eller patienter), och 1% penicillin / streptomycin i RPMI-1640. CaCl2, natriumsuccinat och hydrokortison kosttillskott kan lagras vid -80 ° C under> 6 månader som 1000 x stamlösningar. När växande cellinjer kan fetalt bovint serum (FBS) användas istället för human plasma.
- Framställning av 10% neutral buffrad formalin (NBF): Lägg till 37%-ig formaldehydstamlösning till 1x PBS vid 10% v / v. Blanda väl och förvara i rumstemperatur i 2-3 veckor skyddas från ljus.
- Framställning av 1% bovint serumalbumin (BSA): Väg upp lämplig mängd BSA och lös den i 1x PBS. Förvaras vid 4 ° C och använd inom 1 vecka. BSA-lösning tenderar att bli förorenat om de förvaras i kylskåp för längre perioder. Alternativt kan BSA lösningen alikvoterades och frystes vid -20 ° C för långtidsförvaring. Undvik frysnings-upptiningscykler.
- Beredning av cellåterställningslösning (CRS): Gör 5 mM EDTA, 1 mM natriumvanadat (Na <sub> 3 VO 4) och 1,5 mM natriumfluorid (NaF) lösning i 1x PBS. Sterila filter och förvara vid 4 ° C upp till 6 månader.
3. Embedded 3D-kultur av icke-maligna och maligna Human BM celler
- Rena primära BM mononukleära celler genom Ficoll-Plaque gradient centrifugering enligt tillverkarens instruktioner.
Valfritt steg: celler kan märkas med 0,25 pM karboxifluorescein-diacetat, succinimidylester (CFSE) enligt tillverkarens instruktioner för att följa celltillväxt under hela odlingsperioden.
Felsökning: Om cellerna dör efter CFSE färgning, titrera mängden CFSE eftersom koncentrationen beror på celltyp, 0,25 ^ M fungerar bra för primära BM mononukleära celler. - Addera 65 pl av Rend lösning i varje brunn i en 48-brunnars vävnadsodlingsbehandlade plattan. Fördela lösningen jämnt för att täcka hela ytan av brunnen och inkubera i> 30min vid rumstemperatur.
- Förbered cellsuspensionen vid en densitet av 0,5 x 10 6 celler i 10 ^ il 1 x PBS per brunn av en 48-brunnsplatta. I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör blanda cellsuspensionen med 100 | il av rbM matris per brunn. Blanda cellerna och rbM matrisen genom att försiktigt pipettera upp och ned; undvika att införa bubblor. Håll cell / matris blandningen på is för att undvika gelning av matrisen.
Obs: det rbM systemet är fullt skalbart, att ställa in systemet i en icke-48-bra format, justera beloppen för alla reagenser (matriser och medel) baserat på ytan av plattan används. Scale antalet celler som skall pläteras i enlighet därmed. - Aspirera återstående Rend och lägga till cell / matris blandningen in i centrum av en brunn. Snabbt sprida cell / matris blandningen för att täcka hela ytan av brunnen jämnt. Placera plattan i 30-60 min i 37 ° C, 5% CO 2 vävnadsodlingsinkubator tillåta matrisen att stelna. Undvik att skaka eller disTURB plattan under inkubation.
Felsökning: För att förhindra ojämn fördelning av celler i rbM, blanda väl före plätering. Blanda efter varje 5: e väl klädd för att undvika celler lösa till botten av röret. När klädd, har cellerna inte sjunker till botten av brunnen på grund av ytspänningen i matrisen.
Felsökning: För att förhindra ojämn fördelning av celler i rbM, blanda väl före plätering. Blanda efter varje 5: e väl klädd för att undvika celler lösa till botten av röret. När klädd, har cellerna inte sjunker till botten av brunnen på grund av ytspänningen i matrisen. - Förvärm BMGM i ett vattenbad inställt på 37 ° C.
- Efter 30 minuter, kontrollera att matrisen har rätt inställd, det bildar en mjuk gel som lager som inte rör sig när plattan lutas. Overlay cellen / matrisskikt med 1 ml varmt BMGM. För att undvika rivning av matrisen pipetten mediet väldigt försiktigt (dispense drop-by-drop) med hjälp aven serologisk pipett. Placera den monterade rbM kulturen till en 37 ° C, 5% CO 2 vävnadsodlingsinkubator och kultur för den önskade tidsperioden.
OBS: cellviabiliteten bibehålls i minst 30 dagar utan att ändra medium; om medel ändring krävs bara ändra 50% av medel varje gång.
Kritiska steg: Det är viktigt att mediet inte är kallt som kyla kan störa den redan inställd matrisen. Se till att inte spruta det medium på toppen av matrisen vid det kan bryta mjukt matrisskiktet.
Felsökning: Om cellviabiliteten i rbM systemet är låg, kan celltäthet måste bestämmas experimentellt när man arbetar med andra än primära mononukleära celler från BM aspirat celler. Vid arbete med cellinjer, minska antalet celler 10-faldigt, vilket odödliggjorda cellinjer proliferera snabbare än primärceller.
4. "I-matris" Imaging
- Bild de odlade cellerna direkt i rbM använder ljusa fält, differential interferens kontrast (DIC), konfokala eller andra bildteknik som gör att långväga avbildning som matrisen är ca 1 mm tjock. Använd Z-stack funktion som är tillgänglig på många av mikroskop för att avbilda hela kulturen från toppen till botten.
Tips: För immunfärgning protokoll nedan undvika aspire färgning / tvättlösningar, istället luta plattan och ta bort lösningar med hjälp av en pipett.
- Avlägsna BMGM genom användning av en pipett och tvätta 2-3x med 100 pl / tvätt / brunn av RT 1x PBS. Se till att tillräckligt med PBS används för att täcka hela ytan av brunnen.
- Fix celler i matrisen genom att tillsätta 100 | il / brunn (för en 48-brunnars platta) på 10% NBF för 15 min vid rumstemperatur. Ta NBF och tvätta cellerna två gånger med 100 l / tvätt / brunn av RT 1x PBS.
Obs: Undvik att använda kall NBF eftersom det kan smälta matrisen. - Avlägsna PBS, tillsätt 1% BSA under 1 h vid RT eller vid 4 ° C över natten för att blockera ospecifik bindning av antikroppar.
- Förbered primär antikropplösning i 1% BSA vid den erforderliga utspädningen. Utspädning kommer att variera för varje antikropp, kontakta tillverkaren eller titreras för att bestämma den optimala antikroppskoncentrationen. Tillsätt 100 | il / brunn av primär antikroppslösning och inkubera i enlighet med tillverkarens instruktioner.
Kritiska steg: Alla inkubationer som innefattar antikroppar konjugerade med fluoroforer eller fluorescerande färgämnen bör utföras i mörker. - Avlägsna primär antikroppslösning och tvätta 3x med 1x PBS under 5 min.
- För indirekt immunofluorescens-färgning, inkubera med en sekundär antikropp konjugerad till fluorescerande prob under 1 h vid RT. Späd antikropparna i 1% BSA vid en koncentration som föreslås av tillverkaren.
- Ta bort den sekundära enntibody lösningen och tvätta 3x med 1x PBS under 5 min.
Felsökning: Undvik hög bakgrund under avbildning, titrera de fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar och använda den lägsta koncentration som ger tillräcklig signal. Om hög bakgrund är fortfarande ett problem, öka antalet och varaktigheten av tvättsteg, eller använd direkt konjugerade primära antikroppar, och hoppa över steg 4.2.6. - Att färga kärnorna till 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) nukleär färgning lösning, vid späd föreslås av tillverkaren, och inkubera i 7-10 min vid RT.
- Avlägsna nukleär färgning lösningen och tvätta 2x med 1x PBS under 5 min.
- Ta bort PBS från den sista tvätten och lägga en droppe monteringsmedium (vanlig set), på prov för att bevara fluorescens. Bilden med lämpliga inställningar excitation / emissions på en fluorescerande eller konfokalmikroskop.
Obs: Imaging bör ske inom 2 dagar efter färgningatt undvika nedbrytning av matrix och förlust av rbM integritet och förlust av fluorescenssignalen. Om inte avbildas direkt, bör färgade prover förvaras vid 4 ° C, skyddat från ljus, fram till bildbehandling.
5. Isolering av celler från rbM
- Ta bort mellan försiktigt utan att störa matrisskiktet. Inte aspirera.
- Tvätta cellerna 2x med sterilt 1x PBS. Inte aspirera.
- Lägg till 0,5 ml iskall CRS till varje brunn och avlägsna hela matrisskiktet tillsammans med cellerna, genom kraftig pipettering upp och ned. Samla cellerna, matris och CRS i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Placera på is.
- Lägg till ytterligare 0,5 ml CRS till samma väl och samla alla kvarvarande material. Överföring till samma mikrocentrifugrör.
- Vortex blandningen av celler, matris och datoriserade bokningssystem och inkubera på is i 1 timme. Vortex-celler var 15 min för att underlätta frisättning från matrisen.
- Kontrollera blandningen efter 1 timme, inga synliga klumparav matrisen bör vara närvarande.
Felsökning: om klumpar matris är fortfarande synliga efter 1 timme, överföra celler / matris / CRS blandningen till en större tub, lägga till ytterligare 2-5 ml CRS, och inkubera under ytterligare 30-60 min. - Centrifugera cellerna i CRS vid 1000 rpm under 5 till 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten i 1 ml kall 1x PBS.
- Centrifugera vid 1000 rpm under 5 till 10 min och avlägsna supernatanten. Upprepa PBS tvätta en gång till.
- Den andra PBS-tvättbordar återvinning av celler från matrisen och isolerade cellerna kan användas för eventuella efterföljande tillämpningar såsom DNA / RNA / proteinisolering, flödescytometri, in vivo transplantation etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eftersom primära benmärgsceller inte föröka sig under normala vävnadsodlingsbetingelser var rbM system som skapats för att efterlikna benet mikromiljö, vilket ger ett system för att kultur och expandera BM celler ex vivo. De viktigaste komponenterna i den BM extracellulär matris, fibronektin, kollagen I, kollagen IV och laminin 21, införlivades rbM matrisen för att tillhandahålla den strukturella skelett för denna 3-D kultur. Endosteum, gränssnittet mellan benet och BM, rik på kollagen I och fibronektin, rekonstruerades genom att belägga ytan av en vävnadsodlingsskål med dessa proteiner. Överhörning mellan flera cellulära utrymmen inom BM bidrar till den övergripande homeostas av vävnaden. För att säkerställa att ingen av de cellulära komponenter lämnas ut, var rbM kulturen konfigureras med ofraktionerade mononukleära celler från humana BM nål aspirera biopsier. För att säkerställa att systemet är försedd med hormoner, tillväxtfaktorer, ettd cytokiner som finns i cirkulations miljö, var odlingsmediet kompletterat med human plasma enligt förlagan som odlas (dvs. plasma från normala donatorer lades vid icke-maligna BM celler placerades i rbM, medan plasma från patienter till odlingarna av malignt celler) (Figur 1).
BM och blodprover från friska donatorer och patienter med olika hematologiska maligniteter samlades efter godkännande från Purdue University och University of Alberta Institutionella Research Boards och efter skriftligt informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationen (tabell 1). Mononukleära celler som isolerats från BM biopsier föröka sig och bibehålla sin livskraft i rbM systemet i upp till 30 dagar (Figur 2). Cell koncentration av 0,5 x 10 6 cells/100μl av rbM matris har bestämts att vara den optimala tätheten för primära BM celler. Att gå bortom this densitet overcrowds systemet minskar cellernas livskraft och spridning priser över tiden. En lägre densitet har också visat sig vara skadligt för den totala heath av systemet i cell-cell-kontakter har visat avgörande för en robust celltillväxt. Tillväxten inom rbM kan följas efter att märka celler med carboxyfluorescein diacetat, succinimidylester (CFSE). Fluorescens intensitet CFSE halvor med varje celldelning, således cellproliferation kan spåras genom mikroskopi eller flödescytometri med tiden. Dessutom är mobilfack inom rbM kultur upprätthålls i samma proportioner som var närvarande i biopsiprover 8. Förutom cellerna i hematopoetiska härstamningar, stromal fack uppvisar stark tillväxt i rbM. Alkaliskt fosfatas som uttrycker osteoblaster kan mineraliserings kalcium-, tartrat-resistent surt fosfatas färgnings osteoklaster, Oil Red positiva adipocyter, och fibronektin producerande stromaceller finns vid endosteum/ BM gränssnittet för rbM system (figur 3).
Sammantaget visar våra data visar att rbM modell tillhandahåller en första ex vivo-system, där primära humana BM-celler från friska givare och patienter med olika hematologiska maligniteter såsom leukemi, lymfom och multipelt myelom kan bibehållas och expanderas i upp till 30 dagar. rbM ger en övergripande modell för att studera cellbeteende under fysiologiska betingelser i samband med det nativa BM mikromiljö. Detta system har använts av vårt laboratorium för att identifiera fenotypen av de multipla myelom cancer stamceller och att undersöka samspelet mellan maligna celler och BM cellulära matrix samt överhörning mellan de maligna celler och BM stroma.
| Diagnos | Celltyp | Överlevnad | |
| GODARTAD | BM | Måttlig | Måttlig |
| Amyloidos | BM | Hög | Hög |
| Monoklonal gammopati av okänd betydelse | BM | Hög | Hög |
| PBMC | Ingen | Ingen | |
| Plasmacytom | BM | Hög | Hög |
| Pyrande multipelt myelom | BM | Hög | Hög |
| Multipelt myelom | BM | Hög | Hög |
| PBMC | Ingen | Ingen | |
| MB | Hög | Hög | |
| Plasma-celleukemi | BM | Hög | Hög |
| Waldens macroglobulenemia | BM | High | Hög |
| Akut myeloisk leukemi | BM | Hög | Hög |
| APL | BM | Hög | Hög |
| PBMC | Ingen | Ingen | |
| Akut lymfocytisk leukemi | BM | Måttlig | Måttlig |
| Kronisk myelogen leukemi | BM | Måttlig | Hög |
| Kronisk lymfatisk leukemi | BM | Låg | Sakta |
| PBMC | Ingen | Ingen | |
| Non-Hodgkins lymfom | BM | Måttlig | Sakta |
| PBMC | Ingen | Ingen |
Tabell 1. Överlevnad och spridning av olika prover odlas i rbM. Benmärgs mononuclear celler (BM), perifera mononukleära blodceller (PBMC), eller mobiliserade blodprov (MB) från friska givare och patienter som diagnostiserats med olika maligniteter odlades i rbM. Tabellen visar alla provtyper som odlades i rbM tillsammans med celltypen (dvs. BM, PBMC eller MB). Graden av cellöverlevnad och-proliferation i rbM noteras. Medan BM och MB uppvisar stark tillväxt i rbM, inte PBMC som isolerats från patienter med olika maligniteter var lönsamt i rbM.
Figur 1. . Schematisk bild av rbM inställning rbM består av två faser: 1) endostala beläggning (fibronektin, kollagen I (KI)) och 2) rbM matris (fibronektin, kollagen I (CI), kollagen IV (CIV) och laminin) Anm. : kollagen IV och laminin är major komponenter i Matrigel, alltså ingen separat summering av dessa proteiner krävs. Dessa faser är inrättade i två steg genom att anbringa rbM matris / cellblandningen ovanpå den tunna beläggningen av endosteal matris. För att följa celltillväxt över tiden, kan celler märkas med CFSE innan den blandas med rbM matrisen. Under varaktigheten av den kultur, kan celler visualiseras genom mikroskopi och cellmigration kan följas i realtid med hjälp av ett mikroskop utrustat med en temperatur / CO 2 reglerad kammare. Efter 14-30 dagar i kultur celler kan isoleras från matrisen och utsätts för en mängd efterföljande analyser, både in vitro och in vivo-förfaranden. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Tidsförlopp för själv segregering av cellulära avdelningar i rbM. BM-celler odlades i rbM för det angivna antalet dagar. Stromal element blivit uppenbart efter dag 14, men kan upptäckas så tidigt som dag 5 i rbM. Under loppet av odlingsperioden celler kan ses migrera genom rbM matris och aggregera i distinkta kluster. Massor av maligna celler växa över tid (jämför klusterstorlekar mellan dag 9-30). Representativ bild av kulturen vid varje tidpunkt har tagits med ljusa fält mikroskopi på ett inverterat mikroskop (förstoring: 200X). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Stromal fack är "levereras" i den rbM. För att utvärdera sammansättningen av stromal komponenter som växer ifrån i rbM ades celler vid övergången mellan rbM matris och endosteal beläggning utvärderas för fibroblaster, osteoblaster, fettceller, och osteoklaster specifik morfologi och markör uttryck . (a) För att upptäcka fibroblaster färgades cellerna för fibronektin (grön), aktin (rött), och kärnor (blå) och avbildas på en konfokalmikroskop (förstoring: 200X). (b) Celler med stromal morfologi visades vara preosteoblaster med höga nivåer av alkalisk fosfatas aktivitet (b.1) och som kan mineralisering kalcium bestämd med Alizarin färgning (b.2). (c) Celler med en synlig närvaro av lipiddropparna identifierades som adipocyter bygger på positiv färgning med Olja Röd (C.1). (d) Celler med enstaka multipla kärnor erkändes som preosteoclasts och var positiva för tartrat syrafosfatas (TRAP) (d.1). Ljusa fält och färg (icke-fluorescerande) bilder förvärvades på ett inverterat mikroskop utrustad med en färgkamera (förstoring: 200X). Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RBM-modellen ger ett heltäckande system där cellulära sammansättning BM bibehålls ex vivo i upp till 30 dagar. BM-celler som odlas i rbM själv stratify efter deras funktion noga härma BM arkitektur som finns in vivo. Dessutom är detta det första systemet som möjliggör utbyggnaden av multipelt myelom klon 8. De mest kritiska stegen för att säkerställa den kraftiga tillväxten av BM celler och den totala framgången för kulturen är: 1) för att få en frisk population av BM celler med> 70% viabilitet och mestadels fri från röda blodkroppar, 2) för att se till att matriskomponenterna blandas väl och att cellerna är fördelade likformigt genom hela matrisen, och 3) för att se till att inte skada matrisen när tillväxtmedium tillsätts till systemet. För att säkerställa en robust proliferationen av maligna celler, bör odlingsmedium kompletteras med human plasma matchning diagnosen av den patient vars celler som odlas. One begränsning av rbM system som var märkt är dess oförmåga att stödja renade populationer av CD34 + hematopoietiska stamceller, CD20 + B-celler och CD138 + plasmaceller utan den stromala utrymmet hos BM.
RBM-systemet är mycket mångsidig och kan modifieras på många sätt för att bäst passa målen för särskilda studier. Endothelial facket kan tillsättas till systemet för att efterlikna vaskularisering av BM och extracellulära matriskomponenter kan tillföras för att bringa matriskompositionen så nära som möjligt till den vivo smink av BM och matris koncentrationer kan justeras för att avspeglar de sjukdomstillstånd där koncentrationerna av individuella matrixkomponenter kan förändras 21. Förutom odling av primära celler, är rbM system lämpligt för samodling olika cellinjer för att studera interaktioner cell-cell mellan specifika cellpopulationer. Till exempel kan systemet ställas in som en samodling där stromaL-celler stryks ut över den endostala beläggning är hematopoetiska celler sattes på toppen av stromaceller och hela stromal / hematopoetiska samodling överlagras först med rbM matrisen och därefter med tillväxtmediet. Också bra, skulle kunna vara de modifieringar av mediet sammansättningen att omfatta plasma från olika källor eller medelrade av stroma för att studera hur lösliga faktorer påverkar cellens beteende 12. Cytokiner, tillväxtfaktorer och hormoner kan också tillsättas till tillväxtmediet emellertid bör försiktighet iakttas för att inte ersätta alla tillväxtmedium i kulturen samtidigt som tillväxt Sustaining faktorer som utsöndras av cellerna i rbM kan gå förlorad, vilket , vilket påverkar den totala livskraften hos systemet. Vi föreslår att ersätta upp till 50% av mediet i taget.
RBM-systemet kan användas för att studera både cellens beteende (dvs. proliferation, viabilitet, migration, etc.) och för att bedöma potens och ej åsyftade effekter av nya terapeutiskas 8,12. Systemet är inställd för att rekapitulera vävnaden mikromiljö, alltså, kan effekten av läkemedelssubstanser utvärderas enligt villkoren i miljö-medierade läkemedelsresistens 14. Med hjälp av levande celler i realtid mikroskopi, kan cellviabiliteten under loppet av behandlingen utvärderas av levande / döda färgning och effekten av behandlingen på olika organeller kan utvärderas med hjälp av flera kommersiellt tillgängliga organell-specifika färgämnen som lätt penetrerar rbM matrisen och tas upp av cellerna utan att generera betydande bakgrund som kan påverka avbildning.
RBM-systemet ger en mycket mångsidig och anpassningsbar modell för att studera BM sjukdomar. Fördelen med en sådan 3-D kultur metod jämfört med de vanliga 2-D kulturer är i förmågan att studera cellens beteende i samband med vävnadsmikro se till att effekterna av flera interaktioner inte missas när cellerna är isolerade från sin fysiskalogiska miljö och placerades i en plastskål. Överklagandet av rbM system över in vivo-modeller ligger på insyn i systemet där det samspel som inte kan ses in vivo på grund av begränsningar av avbildningstekniker kan lätt dissekeras. RBM Systemet tillhandahåller ett medium för enkel hantering av komponenterna under upprätthållande av den totala vävnadssammansättning, vilket tillåter forskaren att dissekera de molekylära mekanismer som är föremål för undersökningen. Dessutom har det rbM systemet validerats som ett kostnadseffektivt sätt, jämfört med in vivo-testning, för att genomföra prekliniska studier av nya behandlingar 8,12. Sammantaget ger det rbM modellen ett system där många aspekter av vävnadsbiologi kan undersökas ex vivo med hjälp av primärprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats genom anslag från National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award, American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53), till Purdue University Center for Cancer Forskning, och den kanadensiska Institutes of Health Research och Alberta Cancer Board Research Initiatives Program. MP stöddes av National Institutes of Health, National Cancer Institute, förebyggande av cancer Praktikprogram (R25CA128770, PI: D. Teegarden) som administreras av Onkologiskt Sciences Center och Discovery Learning Research Center vid Purdue University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
