Summary
표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.
Abstract
조직 문화는 정상적인 발달에서 질병, 세포 기능의 여러 측면을 연구하는 귀중한 도구이다. 종래의 세포 배양 방법은 조직 배양 접시의 고체 기질에 부착하는 액체 매질에 현탁 성장하거나 세포의 능력에 의존한다. 다수의 불멸의 세포 라인은 기본 세포가 생체 성장해야 할 경우에는이 방법이 자주 실패, 생성과 같은 방법을 사용하여 재배하고 있습니다. 이러한 실패는 조직 배양 플라스틱은 세포 성장을위한 표면으로서 사용되는 표준 시스템에서 미세 조직의 적합한 세포 외 기질 성분의 부재에 기인 한 내용. 세포 외 기질은 조직의 미세 환경의 핵심 구성 요소이며 그 존재는 세포 편광, 생존, 증식 등의 생리 기능의 유지 보수를 위해 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 3 차원 조직 배양 방법 차 골수 CEL을 제시LS는 인간의 뼈 (RBM 시스템)의 미세 환경을 요점을 되풀이 공식화 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서 재배된다. 세포 외 기질에 포함 된 세포 따라서 기본 조직의 세포 구성을 유지하면서 세포의 생존과 증식이 최대 30 일 동안 지속 할 수있는 종합적인 시스템을 제공, 인간 혈장 보충 매체를 통해 영양소와 함께 제공됩니다. RBM 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 정상 기증자와 환자 아밀로이드증, 각종 혈액 학적 악성 종양에서 차 골수 세포를 성장. RBM 시스템은 새로운 치료제의 전임상 효능의 세포 행동 및 평가의 직접,있는 매트릭스 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 또한, 세포로부터 단리 RBM이어서 생체 내 이식, 세포 분류, 유동 세포 계측법, 핵산 및 단백질 분석에 사용될 수있다. 종합적 RBM 방법은 일차 뼈 MARRO의 성장을위한 신뢰성있는 시스템을 제공한다생리 학적 조건에서 W 셀.
Introduction
조직 배양은 본래 유기체에 각종 처리를 비교할 때 전신 변동성을 최소화하기 위해 제어 된 환경에서 세포 행동을 연구하기 위해 개발되었다. 이 방법은 먼저 1900 년대 초 1,2 년에 설립 된 조직 절편이 유리 접시에 생체 전 배양 기술을 언급했다. 1900 년대 중반의 시스템은 오히려 손상 조직의 조각보다 분산 된 세포가 성장하기에 적합하고, 용어 '조직 문화'와 '세포 배양'는 3 동의어가되었다. 이러한 종래의 세포 배양 시스템에서 셀은 다양한 성장 인자로 보충 된 성장 배지와 겹쳐 조직 배양 플라스틱의 표면에 성장된다. 자기편 세포 배양, 세포 부착 및 세포 현탁액에 전파되는 조직 배양 플라스틱 및 비 접착 성 문화에 확산 : 문화의 두 가지 유형의 다양한 세포의 접착 능력을 기준으로 등장했습니다. 셀의 초기부터문화, 다 불멸 세포주는 헬라 4, 제 인간의 암 세포주로 생성되었다. 이들 세포주는 세포 배양 물에서 무기한 증식하는 능력이 있고, 대부분의 생존을 유지하기 위해 특별한 처리를 필요로하지 않는다.
원래의 세포 배양 방법의 환원 주의적 접근 방식은 세포 생존과 증식을 유지하기 위해 필요한 경우에만 최소한의 구성 요소를 포함하여 가능한 한 많은 시스템을 단순화하도록 설계되었습니다. 그러나 단순화 된 세포 배양 방식은 유한 한 수명을 가진 생체 가장 기본 인간의 세포 유형을 지원하기 위해 실패합니다. 따라서, 새로운 문화 시스템은 따라서 세포 외식 생리 조건에서 성장할 수 있도록 최대한 조직의 미세 환경에 근접하도록 설계되고있다. 종래 / 환원 세포 배양 방법, 3 차원 (3-D)과는 대조적으로 배양 시스템은 이제 다양한 효율적 문화 바람직한 방법이되고있다인간의 세포 선 및 일차 전지는 이후에 지원 미세 환경의 맥락에서, 건강과 질병에 관련된 메커니즘을 연구합니다. 이러한 3-D 시스템은 일반적으로 관심의 세포 유형을 연구하는 조직의 미세 환경을 요점을 되풀이하기 위해, 성장 인자 보충 복원 행렬 및 / 또는 매체를 사용하여 설정된다. 이러한 3 차원 (3-D) 배양 모델의 첫번째는 유선 개발을 연구하기 위해 개발되었다. 유방 상피 세포가 리겔에 포함 된 기본 조건, 콜라겐 IV와 세포 외 기질 (ECM)의 라미닌이 풍부한 소스와 세포를 제공하고, 성장 매체와 겹쳐합니다. 이러한 조건 하에서, 유선 상피 세포가 유방 꽈리 닮은 클러스터를 형성하고, lactogenic 호르몬 자극시, 선포 세포는 이러한 꽈리 같은 구조의 중공 lumena으로, 감기 및 다른 우유 단백질을 분비. 카제인 분비도 프로락틴 5 첨가 한 후 표준 문화에서 관찰되지 않았다, 상기 세포의 형태 학적 표현형에 미세 환경을 보존하는 역할을 강조. 세포가 자신의 생리 미시의 문맥 촬영 정상적인 세포 기능의 손실의 또 다른 데모지지 미세하지 않고, 각질 세포가 층상 표피 (6)를 형성하는 데 실패하는 데모입니다. 다른 3-D 모델의 수는 기본 세포의 생체 전파 7,8를 할 수 있도록 만들어졌다.
세포 행동의 미세 환경의 중요한 역할은 우아하게 매트릭스 때 콜라겐 배양 유방 상피 세포가 리겔에 형성 올바르게 편광 선포 세포에 비해, "내부 아웃"선포 세포를 형성 연구에서 입증되었다. 라미닌 생산 근 상피 세포가 콜라겐 I 배양 9에 추가 된 경우에 적절한 형태의이 손실은 복귀했다. 또한, 올바른 미시는 정확한 필요합니다유전자형 표현. 접시에 성장, 세포 - 세포 접착 분자 CEACAM1로 형질 MCF7 유방암 세포는 형질 감염되지 않은 CEACAM 음성 세포와 완전히 동일하게 동작. 그러나, 비 악성 유방 상피 세포 (10)에 설립되었습니다로 CEACAM1로 형질 MCF7 세포는, 중공 lumena와 정상 표현형과 양식을 선포 세포로 복귀하면서 ECM, 야생형 MCF7 양식 종양 같은 구조와 접촉, 리겔에 배양 하였다. 마찬가지로, β1-인테그린 유방암 세포를 차단하면 표준 배양 조건에서 동작을 변경할 수 있지만, 3-D 문화에서 수행 된 동일한 실험은 β1-인테그린을 차단하는 것은 정상적인 표현형 (11)에 악성 세포를 되돌 설명하지 않습니다. 따라서, 미시 조직은 세포 생존을 유지하기 위해 요구되지 않고, 또한 적절한 세포 기능을 유지하기 위해.
셀의 동작은 생리적 조건 하에서 연구 될 수있는 시스템을 제공하는 것 외에도의는, 3-D 문화는 새로운 치료제 8,12,13의 전임상 시험을위한 견고하고 신뢰할 수있는 매체를 작동합니다. 3-D에서 세포를 배양하면 세포 - 세포 및 세포 - ECM 부착의 기여가 평가 될 수있는 환경 매개 약제 내성 (14)의 조건에서 조사 화합물의 검사를 할 수 있습니다. 또한, 새로운 화합물의 오프 대상 독성은 다양한 조직의 여러 세포 구획을 통합하여 확인 될 수 있습니다. 이러한 화면은 더 빠르게 수행하고 비용 효율적인 생체 8 비교 연구보다 될 수있다.
여기에서 우리는 정상 및 악성 골수 (BM) 세포가 밀접하게 인간의 BM의 미세 환경을 흉내 낸 시스템에서 체외 증식 복원 골수 (RBM)의 3-D 모델의 설정을 제시한다. BM 기질의 다양한 구성 요소와 함께 2-D의 문화, 액체 또는 부착 공 배양에 인간의 기본 BM 세포를 성장 이전 시도, 3-D, 반 고체 한천 문화로 인해 조직의 미세 15-18의 구성 요소와 세포를 공급하는 그들의 무능력에 제한된 성공을 만났다. 이러한 시스템에서 기본 BM 세포는별로 가능성이 있고 생체을 증식하는 데 실패했습니다. 인간 BM 전구 세포는 BM 간질 세포와 공 배양 타원체에서 재배되는 다른 시스템은 조혈 줄기 세포 생존 및 증식이 적어도 96 시간 지속 된 19 3-D 시스템이다. 조혈 전구 생물학의 이해에 매우 유용하지만, 그러나,이 시스템은 충실히 그 유용성을 제한, 따라서 ECM 구성 요소의 부재로 인해 BM의 미세 환경을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기에 설명 RBM 모델은 인간의 BM 셀룰러 및 세포 외 구획은 시험 관내에서 재구성되는 포괄적 인 시스템을 제공한다. 우리는 RBM의 문화가, 정상적인 인간의 BM 세포의 체외 성장을 지원할 수있는 쇼로 우리각종 혈액 질환을 가진 환자에서 분리 된 세포와 같은거야.
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Protocol
1. 사전 준비
- 4 ° C에서 멸균 혈청 피펫과 피펫 팁을 유지
문제 해결 : 실온 (RT)에서 리겔 젤, 차가운 피펫 및 팁을 사용하여이 문화를 설치하는 동안 겔에서 리겔을 방지 할 수 있습니다. - 4 ° C에서 하룻밤 리겔의 병을 해동.
2. 시약의 준비
- 피브로넥틴 스톡 용액의 제조 : 100 ml의 증류수에 100 mg의 인간 피브로넥틴 용해하여 피브로넥틴의 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 확인. 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 피브로넥틴이 용해되면, 살균 필터, 나누어지는 및 저장.
문제 해결 : 피브로넥틴 빠르게 용해 37 ℃에서 수조 세트에 몇 분을위한 솔루션을 품어하지 않는 경우 - 10X PBS의 준비 : 80 g 나트륨 염화물의 NaCl 14.4 g 나 2 HPO 4, 2g의의 KCl 2.4 g의 KH 2 PO를 녹이고
- 중화 버퍼 (20)의 제조 : 1 M HEPES 및 10X PBS의 주식 솔루션을 사용하여 2 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 100 mM의 HEPES를 포함하는 솔루션을합니다. 7.0 용액의 pH를 조정한다. 2 ~ 3 개월 4 ° C에 보관하십시오.
- 쥐의 꼬리 콜라겐 타입의 2 ㎎ / ㎖ 용액의 조제는 I : 중화 버퍼 (단계 2.3)에 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I 솔루션을합니다. 낮은 속도로 솔루션을 흔든다 아래로 pipetting에 의해 부드럽게 섞는다. 콜라겐이 매우 점성이기 때문에, 피펫 팅하면서 기포의 발생을 피한다. 그것은 신선한마다 콜라겐 I 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 사용할 때까지 얼음에 솔루션을 보관하십시오.
- 내막 코팅 (분쇄)의 제조 : 1X &에, 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I 주식 (2.1 및 2.4 단계) 77 ㎍ / ㎖의 최종 농도 29 ㎍ / ㎖로 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 주식을 각각 혼합# 160; 멸균 PBS. 혼합 최대 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 복원 된 뼈 매트릭스 (RBM)의 제조 :
- 얼음에 Precool 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브. 항상 얼음에 모든 매트릭스 솔루션을 유지합니다.
- 4 부 리겔 (리겔 농도가 로트마다 다르지만, 변화는 무시할 것으로 밝혀졌다), 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 2.5 부 첫 번째 피펫 리겔로 얼음에 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I에 1 부를 혼합 튜브 차가운 피펫 팁을 사용하고 리겔은 4 ° C 이상의 온도에서 응고 시작, 그래서 리겔을 피펫 팅하는 동안 빠르게 작동합니다 피브로넥틴과 콜라겐 I.를 추가합니다. 거품을 도입하지 않도록, 아래로 피펫 팅에 의해 매우 부드럽게 행렬을 섞는다. RBM을 혼합하면서 얼음에 튜브를 유지합니다.
- 골수 증식 배지 (BMGM)의 준비 : 6.2 × 10 -4 M 염화칼슘, 10 -6 M 나트륨 숙시 네이트, 10-6 M의 하이드로 코티손, 20 %의 인간 혈장을 (포함 BMGM 500 mL로RPMI-1640) 정상 또는 건강한 기증자 또는 환자로부터 수집 된 악성, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. 염화칼슘, 나트륨 숙시 네이트, 및 하이드로 코티손 보충제는 1,000 X 주식 솔루션으로> 6 개월 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 세포주를 성장하는 경우, 소 태아 혈청 (FBS)은 인간 혈장에 대해 치환 될 수있다.
- 10 % 중성 포르말린 (NBF)의 제조 : 10 % V / V에서 PBS를 1 배인 37 % 포름 알데히드 원액 추가 잘 혼합하고 빛으로부터 보호 2 ~ 3 주간 상온에서 보관.
- 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 제조 : BSA의 적당량을 달아 1X PBS에 녹여. 4 ° C에서 보관 1 주일 이내에 사용한다. BSA 솔루션은 더 이상 기간 동안 냉장 보관하면 오염 얻을하는 경향이있다. 대안 적으로, BSA 용액은 장기간 저장에 분취하고 -20 ℃에서 냉동 될 수있다. 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
- 세포 복구 솔루션 (CRS)의 제조 : 5 mM의 EDTA, 1 mM의 나트륨 바나 데이트 (나를 <확인1X PBS 서브> 3 VO 4), 1.5 mM의 불화 나트륨 (NaF로) 솔루션을 제공합니다. 최대 6 개월까지 4 ° C에서 살균 필터 및 저장.
3. 비 악성 및 악성 인간 BM 세포의 내장 3-D 문화
- 제조업체의 지시에 따라 플라크 피콜 구배 원심 분리에 의해 차 BM 단핵 세포를 정제 하였다.
선택 단계 : 세포가 배양 기간 동안 세포 증식을 수행하는 제조 업체의 지침에 따라 0.25 μM의 카르복시 디 아세테이트, 숙신 에스테르 (CFSE)으로 표시 할 수 있습니다.
문제 해결 : 세포가 CFSE 염색 후에 죽는다면, 농도가 세포의 종류에 따라 달라집니다로 CFSE의 양을 적정, 0.25 μM는 기본 BM 단핵 세포에 적합합니다. - 48 잘 조직 문화 처리 플레이트의 각 웰에 분쇄 솔루션 65 μl를 추가합니다. 웰의 전체 표면을 덮도록 균일 용액 깔아> 30 부화RT에서 분.
- 48 - 웰 플레이트의 웰 당 1X PBS 10 μL에서 0.5 × 10 6 세포의 밀도로 세포 현탁액을 준비합니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 잘 당 RBM 행렬의 100 μL와 세포 현탁액을 섞는다. 부드럽게 위아래로 pipetting하여 세포와 RBM 행렬을 혼합, 거품을 도입하지 마십시오. 행렬의 겔화를 방지하기 위해 얼음에 셀 / 매트릭스 혼합물을 유지한다.
주 : RBM 시스템은 완전히 확장이다 사용 플레이트의 표면적에 기초하여 모든 시약 (매트릭스 및 매체)의 양을 조정 비 48 - 웰 포맷으로 시스템을 설정. 이에 따라 도금 될 셀의 수를 확장. - 나머지 렌드를 기음과 우물의 중심에 셀 / 매트릭스 혼합물을 추가합니다. 빠르게 균등 웰의 전체 표면을 덮도록 셀 / 매트릭스 혼합물을 확산. 37 ° C에서 30 ~ 60 분 동안 접시를 놓고, 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터 행렬이 응고 할 수 있습니다. 흔들거나 표시하지 마십시오배양 중에 플레이트를 TURB.
문제 해결 : RBM 세포의 치우침을 방지 도금하기 전에 잘 혼합한다. 매 5 번째 잘 튜브 바닥에 침전 세포를 피하기 위해 도금 후 섞는다. 일단 도금 셀은 매트릭스에 표면 장력에 의한 웰의 바닥에 가라 앉지 않는다.
문제 해결 : RBM 세포의 치우침을 방지 도금하기 전에 잘 혼합한다. 매 5 번째 잘 튜브 바닥에 침전 세포를 피하기 위해 도금 후 섞는다. 일단 도금 셀은 매트릭스에 표면 장력에 의한 웰의 바닥에 가라 앉지 않는다. - 물을 욕조에 Prewarm BMGM는 37 ° C로 설정
- 30 분 후, 매트릭스가 제대로 설정했는지 확인하십시오, 그것은 플레이트가 기울어 때 움직이지 않는 층 같은 부드러운 젤을 형성 할 것이다. 따뜻한 BMGM 1 ㎖의 세포 / 매트릭스 층을 오버레이. 아주 부드럽게 매트릭스 피펫 매체 찢어을 방지하기 위해 사용 (드롭에 의해 드롭 분배)혈청 피펫. 37 ° C, 원하는 기간 동안 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터와 문화에 조립 된 RBM 문화를 놓습니다.
주 : 세포 생존율은 배지를 변경하지 않고 적어도 30 일 동안 유지된다; 매체 변경이 필요한 경우에만마다 배지의 50 %를 변경.
중요한 단계 : 그것은 차가운 온도가 이미 설정 행렬을 방해 하듯이 매체는 추운없는 것이 중요합니다. 그것은 부드러운 매트릭스 층을 깰 수에서 행렬의 맨 위에있는 매체를 분출하지 않도록주의하십시오.
문제 해결 : RBM 시스템에서 세포 생존 능력이 낮 으면, 셀 밀도가 BM 흡인로부터 일차 단핵 세포 이외의 세포를 사용할 때 실험적으로 결정되어야 할 수도있다. 세포 라인으로 작업 할 때 불후의 세포 라인은 기본 세포보다 빠르게 증식로, 세포 수 10 배 감소.
4. '에서 매트릭스'영상
- 이미지 시야를 사용하여 직접 RBM에서 배양 된 세포, 미분 간섭 대비 (DIC), 공 초점 또는 매트릭스 약 1mm 두께로 원거리 촬상을 허용 다른 이미징 기법. 위쪽에서 아래쪽으로 이미지의 전체 문화를 현미경의 많은에서 사용할 수있는 Z-스택 기능을 사용합니다.
팁 : 아래의 면역 염색 프로토콜은 염색 / 세탁 솔루션을 흡입 방지를 위해, 대신 접시를 기울 피펫을 사용하여 솔루션을 제거합니다.
- 피펫을 사용하여 BMGM를 제거하고 RT 1X PBS 100 μL / 세척 / 잘으로 2 배 씻는다. 충분한 PBS는 우물의 전체 표면을 커버하는 데 사용되었는지 확인합니다.
- 실온에서 15 분 동안 10 % NBF의 (48 - 웰 플레이트) 100 μL / 웰을 추가하여 행렬의 세포를 수정. NBF를 제거하고 RT 1X PBS 100 μL / 세척 / 잘로 두 번 세포를 씻으십시오.
주의: 그것은 행렬을 녹일 수 있으므로 감기 NBF를 사용하지 마십시오. - , PBS를 제거 밤새 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 실온에서 4 ° C에서 1 시간 동안 1 % BSA를 추가합니다.
- 필요한 희석에 1 % BSA의 기본 항체 솔루션을 준비합니다. 희석은 제조업체에 문의하거나 최적의 항체 농도를 결정하는 적정, 각 항체에 따라 다를 것입니다. 차 항체 용액 100 μL / 잘을 추가하고 제조업체의 지침에 따라 배양한다.
중요한 단계 : 형광 또는 형광 염료에 접합 된 항체를 포함한 모든 배양은 어둠 속에서 수행해야합니다. - 차 항체 솔루션을 제거하고 5 분 1X PBS로 3 회 세척한다.
- 간접 면역 형광 염색의 경우, 실온에서 1 시간 동안 형광 프로브에 복합 이차 항체와 함께 배양한다. 제조업체에서 권장하는 농도의 1 % BSA의 항체를 희석.
- 차를 제거ntibody 솔루션 및 5 분 1X PBS로 3 회 세척한다.
문제 해결 : 높은 배경을 방지하기 위해 촬영하는 동안, 형광 결합 된 이차 항체를 적정하고 적절한 신호를 제공하는 낮은 농도를 사용합니다. 하이 백은 여전히 문제가있는 경우, 세척 단계의 수 및 지속 기간을 증가 시키거나 직접 접합 된 일차 항체를 사용하고, 단계 4.2.6 이동. - 핵은 제조업체에서 권장하는 희석에, '-1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI) 핵 염색 액을 4를 추가 얼룩, 그리고 실온에서 7-10 분 동안 부화.
- 핵 염색 액을 제거하고 5 분 1X PBS로 2 배 씻는다.
- 마지막 세척에서 PBS를 제거하고 형광을 유지하기 위해 샘플에 장착 매체의 드롭 (레귤러 세트)를 추가합니다. 형광 공 초점 현미경에 적합한 여기 / 방출 설정을 사용하여 이미지.
참고 : 이미지는 염색의 2 일 범위 내에서 실시 할 필요가매트릭스 및 RBM 무결성 및 형광 신호의 손실의 손실의 저하를 방지 할 수 있습니다. 바로 이미지를 만들지 않는 경우, 스테인드 샘플 영상까지, 빛으로부터 보호, 4 ° C에 보관해야합니다.
5. RBM에서 세포의 분리
- 매트릭스 층을 방해하지 않고 부드럽게 매체를 제거합니다. 대기음하지 마십시오.
- 세척 세포는 멸균 1X PBS로 2 배. 대기음하지 마십시오.
- 또한 각 얼음처럼 차가운 CRS의 0.5 ML을 추가하고 적극적으로 아래로 피펫 팅에 의해, 세포와 함께 전체 매트릭스 층을 제거. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포, 매트릭스, 그리고 CRS를 수집합니다. 얼음에 놓습니다.
- 같은도에 추가로 0.5 ㎖ CRS를 추가하고 나머지 모든 자료를 수집합니다. 같은 microcentrifuge 관에 전송합니다.
- 소용돌이 세포, 매트릭스, 그리고 CRS의 혼합물은 1 시간 동안 얼음에 품어. 소용돌이 세포는 매 15 분 행렬에서 방출을 촉진한다.
- 1 시간, 눈에 보이는 덩어리 후 혼합물을 확인매트릭스의 존재해야한다.
문제 해결 : 행렬의 대단히 짧은 시간은 1 시간 후 계속 표시하는 경우, 더 큰 튜브에 세포를 전송 / 매트릭스 / CRS 혼합물, CRS의 추가 2-5 ML을 추가하고, 추가로 30 ~ 60 분 동안 품어. - 4 ℃에서 5 ~ 10 분 동안 1,000 rpm에서 CRS에 원심 분리기 세포 뜨는을 제거하고 차가운 1X PBS 1 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- 5 ~ 10 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. PBS 세척을 한 번 더 반복합니다.
- 두 번째 PBS 세척 매트릭스 고립 된 세포에서 세포의 회복, 세포 계측법 생체 이식 등 흐름, 이러한 DNA / RNA / 단백질 분리와 같은 다운 스트림 애플리케이션에 사용할 수 있습니다 완료됩니다.
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Representative Results
일차 골수 세포는 표준 조직 배양 조건 하에서 증식하는 데 실패하기 때문에, RBM 시스템 밀접 문화 제공 시스템, 골 미세 환경을 모방하고 생체 BM 세포를 확장하기 위해 만들어졌다. BM 세포 외 기질, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 (21)의 주요 구성 요소는 3-D 문화에 구조 발판을 제공하기 위해 RBM의 행렬로 통합되었다. Endosteum, 콜라겐 I과 fibronectin의 풍부한 뼈와 BM 사이의 인터페이스는,이 단백질을 가진 조직 배양 접시의 표면을 코팅하여 재구성 하였다. BM 내에 여러 셀룰러 구획 간의 누화는 조직의 전체적인 항상성 유지에 기여한다. 세포 구성 요소의 어느 것도 생략하지 않습니다 보장하기 위해, RBM 문화는 인간의 BM 바늘 대기음 생검에서 미분 획 단핵 세포를 사용하여 설정 하였다. 시스템이 호르몬, 성장 인자, 함께 제공되어 있는지 확인하려면순환 환경에서 본 D 사이토 카인은, 배양액 인간 혈장은 비 악성 BM 세포 RBM에 배치 될 때 환자에서 플라즈마가 악성의 배양에 첨가하면서 (즉, 통상의 기증자로부터 플라즈마가 첨가 된 시편은 배양중인 대응로 보충 하였다 세포) (그림 1).
BM 및 각종 혈액 학적 악성 종양이 퍼듀 대학과 앨버타 기관 연구 보드의 대학에서 승인 후 헬싱키 선언 (표 1)에 따라 서면 동의서 후 수집 된 건강한 기증자와 환자의 혈액 샘플. BM 생검에서 분리 된 단핵 세포 증식 및 최대 30 일 RBM 시스템의 생존 능력 (그림 2)를 유지한다. RBM 매트릭스의 0.5 × 106 cells/100μl의 세포 농도는 일차 BM 세포를위한 최적의 농도로 결정되었다. 생을 넘어의 밀도는 시간이 지남에 따라 세포 생존과 확산 속도를 감소 시스템을 overcrowds. 세포 - 세포 접촉이 강력한 세포 성장을 위해 필수적 입증으로 낮은 밀도는 시스템의 전반적인 히스에 해로운 것으로 밝혀졌다. RBM 내 성장 카르복시 디 아세테이트, 숙신 에스테르 (CFSE)과 세포를 라벨링 한 후 올 수 있습니다. CFSE의 형광 강도는 각각의 세포 분열, 따라서 세포 증식은 현미경으로 추적 할 수 있습니다 또는 시간이 지남에 따라 유동 세포 계측법과 반쪽. 조직 검사 샘플 8 존재 더욱이, RBM 문화 내의 세포 구획은 같은 비율로 유지됩니다. 조혈 계통의 세포 외에 기질 구획 RBM 고성장 나타낸다. 알칼리성 인산 광물 화 칼슘, 주석산 내성 산성 포스 파타 아제 염색 파골 세포, 빨강 석유 긍정적 인 지방 세포 및 피브로넥틴 기질 세포를 생성 할 수있는 조골 세포를 발현은 endosteum에서 찾을 수 있습니다/ RBM 시스템의 BM 인터페이스 (그림 3).
이와 함께, 우리의 데이터는 RBM 모델은 건강한 기증자와 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종 등의 다양한 혈액 학적 악성 종양을 가진 환자에서 인간의 기본 BM 세포는 30 일까지 지속 및 확장 할 수있는 최초의 생체 시스템을 제공한다는 것을 보여줍니다. RBM은 기본 BM의 미세 환경의 맥락에서 생리 학적 조건에서 세포의 행동을 연구하는 포괄적 인 모델을 제공합니다. 이 시스템은 다발성 골수종 암 줄기 세포의 표현형을 확인하고 악성 세포 및 BM 세포 외 매트릭스 사이의 상호 작용뿐만 아니라 악성 세포 및 BM 기질 간의 크로스 토크를 연구하기 위하여 실험에 사용되었다.
| 진단 | 세포 유형 | 살아 남기 | |
| 악성이 아닌 | BM | 보통 | 보통 |
| 아밀로이드증 | BM | 높은 | 높은 |
| 예측할 수없는 의미의 단일 클론 감마 병증 | BM | 높은 | 높은 |
| PBMC | 아니 | 아니 | |
| 형질 세포종 | BM | 높은 | 높은 |
| 다발성 골수종을 연기 | BM | 높은 | 높은 |
| 다발성 골수종 | BM | 높은 | 높은 |
| PBMC | 아니 | 아니 | |
| MB | 높은 | 높은 | |
| 형질 세포 백혈병 | BM | 높은 | 높은 |
| Waldenstroms의 macroglobulenemia | BM | HIG시간 | 높은 |
| 급성 골수성 백혈병 | BM | 높은 | 높은 |
| 급성 골수성 백혈병 | BM | 높은 | 높은 |
| PBMC | 아니 | 아니 | |
| 급성 림프 구성 백혈병 | BM | 보통 | 보통 |
| 만성 골수성 백혈병 | BM | 보통 | 높은 |
| 만성 림프 구성 백혈병 | BM | 낮은 | 천천히 |
| PBMC | 아니 | 아니 | |
| 비호 지킨 림프종 | BM | 보통 | 천천히 |
| PBMC | 아니 | 아니 |
표 1. 생존과 RBM에서 배양 다양한 표본의 확산. 골수 M세포 (BM) ononuclear 각종 악성 종양으로 진단 된 건강한 기증자와 환자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 동원 혈액 샘플 (MB)은 RBM에서 배양 하였다. 표는 셀 타입 (즉, BM, PBMC, 또는 MB)와 함께 RBM에서 배양 한 모든 시료 유형을 나열합니다. 세포의 생존 및 RBM의 확산의 정도가 설명되어 있습니다. BM과 MB가 RBM의 강력한 성장을 전시하는 동안, 다양한 악성 종양을 가진 환자에서 분리 된 PBMC는 RBM에 가능한 아니었다.
그림 1. 1.) 내막 코팅 (피브로넥틴, 콜라겐 I (CI)), 2) RBM 매트릭스 (피브로넥틴, 콜라겐 I (CI), 콜라겐 IV (CIV)과 라미닌) 주 :. RBM 설정의 도식 표현 RBM은 두 단계로 구성 : 콜라겐 IV와 라미닌은 M입니다리겔의 ajor 구성 요소, 따라서이 단백질의 별도의 추가가 필요하지 않습니다. 이 단계는 내막 행렬의 얇은 코팅 위에 RBM 매트릭스 / 세포 혼합물을 중첩하여 두 단계로 설정되어 있습니다. 시간이 지남에 따라 세포 증식을 수행하기 위해, 세포가 이전에 RBM 매트릭스와 혼합에 CFSE으로 표시 할 수 있습니다. 문화의 기간 동안, 세포는 현미경으로 시각화 할 수 있으며, 세포의 이동은 온도 / CO 2 제어 챔버가 장착 된 현미경을 사용하여 실시간으로 따라 할 수 있습니다. 배양 세포에서 14~30일 행렬에서 분리하고 체외에서 생체 절차를 모두 포함하는 다운 스트림 분석, 다양한 대상이 될 수있다 후에. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. RBM에있는 세포 구획의 자기 분리의 시간 코스. BM 세포는 일의 지정된 번호를 RBM에서 성장했다. 기질 요소는 하루 (14)에 의해 분명하게,하지만 이미 RBM 하루 5로 검출 할 수있다. 배양 기간 동안 세포의 과정 동안 RBM 매트릭스를 통해 이주 된 별개 클러스터로 집계 알 수있다. 악성 세포의 질량은 시간 (하루에 9-30 사이의 클러스터 크기를 비교)을 통해 확장합니다. 각 시점에서의 문화의 대표적인보기가 거꾸로 현미경 (배율 : 200X)에 밝은 필드 현미경을 사용하여 촬영되었다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 기질 구획이 RBM에서 '공급'입니다. RBM에서 자라다 기질 구성 요소의 구성을 평가하기 위해, RBM 매트릭스와 내막 코팅 사이의 전이에서 세포는 섬유 아세포, 조골 세포, 지방 세포, 파골 세포 고유의 형태와 마커의 발현을 평가 하였다 . () 섬유 아 세포를 감지하기 위해, 세포가 피브로넥틴 (녹색)에 염색, 액틴 (적색), 및 핵 (파란색) 및 공 초점 현미경에 몇 군데 (배율 : 200X). (B) 간질의 형태와 세포는 것으로 나타났다 지질 방울의 눈에 보이는 존재와 높은 알칼리성 포스 파타 아제 활성 (B.1)의 수준과 알리자린 레드 염색 (B.2)에 의해 결정되는 칼슘 광물 화 할 수있는 preosteoblasts가. (C) 세포는 긍정적 인 염색과에 따라 지방 세포로 확인되었다 가끔 여러 개의 핵을 가진 오일 레드 (C.1). (D) 세포는 홍보로 인정했다eosteoclasts 및 주석산 내성 산성 포스 파타 아제 (TRAP) (D.1)에 대한 긍정적이었다. 밝은 필드와 색 (비 형광) 이미지가 컬러 카메라 (배율 : 200X)가 장착 된 거꾸로 현미경에 취득한 것은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
RBM 모델은 BM의 세포 조성물을 30 일까지 생체를 유지하는 포괄적 인 시스템을 제공합니다. 자신의 기능이 밀접하게 생체 내에서 발견 된 BM 구조를 흉내에 따라 RBM 자기 충 성장 BM 세포. 더욱이,이 다발성 골수종 클론 (8)의 팽창을 허용 우선 시스템이다. BM 세포의 강력한 성장과 문화의 전반적인 성공을 보장하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1)> 70 %의 생존 능력과 적혈구의 대부분은 무료로 BM 세포의 건강한 인구를 얻기 위해, 2) 보장하기 위해 그 매트릭스 성분은 잘 혼합하고 세포를 매트릭스 전체에 균일하게 분포하며, 3) 성장 매체가 시스템에 추가 될 때 행렬을 손상하지 알아서 해당된다. 악성 세포의 증식을 강력 보장하기 위해, 성장 배지는 세포 배양중인 환자의 진단 매칭 사람 혈장이 보충되어야한다. O발견 하였다 RBM 시스템의 NE 한정 BM의 기질 구획없이 CD34 + 조혈 줄기 세포, CD20 + B 세포 및 CD138 + 형질 세포의 정제 된 인구를 지원할 수 없다는 것이다.
RBM 시스템은 매우 다목적이고 유용한 구체적인 연구의 목적에 맞게 다양한 방법으로 변형 될 수있다. 내피 구획 BM 및 매트릭스 농도의 생체 메이크업에 최대한 가깝게 매트릭스 조성물을 가지고 제공 될 수 BM 추가적인 세포 외 기질 성분의 혈관을 모방하기 위해 시스템에 추가 할 수에 맞출 수있다 개별 매트릭스 성분의 농도가 21 변경 될 수있다 질병 상태를 반영한다. 일차 세포를 배양하는 것 외에도, RBM 시스템은 특정 세포 집단 간의 세포 - 세포 상호 작용을 연구하기 위해 다양한 세포주를 공동 배양에 적합하다. 예를 들어, 시스템은 공 배양 기질로 설정 될 수있다L 세포 내막 코팅 위에 도금되어, 조혈 세포는 기질 세포의 상부에 첨가하고, 전체 기질 / 조혈 공 배양은 성장 배지로 제 RBM 매트릭스와 중첩하고있다. 유용, 수용성 요인이 세포 행동 (12)에 미치는 영향을 연구하는 기질에 의해 조절 다양한 소스 또는 중간에서 플라즈마를 포함하는 배지 조성의 변경이 될 수 있습니다. 사이토 카인, 성장 인자, 호르몬도 있지만, 케어 번 RBM에서 세포에 의해 분비 된 성장 서스테인 요인 등으로 배양 모두 성장 배지를 대체하지 않도록, 따라서 손실 될 수되어야 성장 배지에 첨가 될 수있다 , 시스템의 전체 생존 능력에 영향을 미치는. 우리는 한 번에 매체의 50 %까지 대체하는 것이 좋습니다.
RBM 시스템은 모두 세포 행동 (즉, 증식, 생존, 마이그레이션 등) 공부 및 효능을 평가하고, 새로운 치료의 표적 이탈 효과에 사용될 수있다8,12 해제. 시스템이 이와 같이, 조직 미세 요점을 되풀이하도록 설정되어, 조사 가능한 약물의 효능은 환경 중재 약제 내성 (14)의 조건으로 평가 될 수있다. 살아있는 세포 실시간으로 현미경을 사용하여, 치료의 과정을 통해 세포 생존 라이브 / 죽은 염색에 의해 평가 될 수 있고, 다양한 세포 소기관에 대한 처리의 영향을 좀처럼 RBM 행렬 침투 체류 시판 소기관 특정 염료를 사용하여 평가 될 수 있고 촬영까지하는 세포에 의해 이미지에 영향을 미칠 수있는 중요한 배경을 생성하지 않고.
RBM 시스템은 BM 장애를 연구 할 수있는 매우 다양하고 융통성있는 모델을 제공합니다. 표준 2-D 배양에 비해 같은 3-D 배양 방법의 이점은 셀들이 physi에 분리 될 때 다수의 상호 작용의 효과가 누락되지 않는 것을 보장 조직 미세 환경의 컨텍스트에서 세포 행동을 연구 할 수있는 능력에있다생리 학적 환경과 플라스틱 접시에 배치. 생체 내 모델 위에 RBM 시스템 호소 인해 영상 기술의 한계로 생체 내에서 볼 수없는 상호 작용이 쉽게 해부 될 수있는 시스템의 투명성에있다. 연구원이 조사중인 분자 메커니즘을 해부 있도록 따라서 전체적인 조직 조성물을 유지하면서 RBM 시스템은 부품이 쉽게 조작을위한 매체를 제공한다. 또한, RBM 시스템은 신규 한 치료제 8,12의 전임상 연구를 수행하는, 생체 내 시험에 비해, 비용 효율적인 방법으로 검증되었다. 이와 함께, RBM 모델은 조직 생물학의 여러 측면 차 표본을 사용하여 생체를 조사 할 수있는 시스템을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강, 국립 암 연구소 (1R21CA141039), BD Biosciences는 연구 그랜트 수상, 암 퍼듀 대학 센터 미국 암 학회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (IRG # 58-006-53)의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 연구 및 건강 연구 및 앨버타 암위원회 연구 이니셔티브 프로그램의 캐나다 연구소. MP는 건강의 국립 연구소, 국립 암 연구소, 암 예방 인턴쉽 프로그램에 의해 지원되었다 (R25CA128770, PI : D. Teegarden) 종양학의 과학 센터와 퍼듀 대학에서 발견 학습 연구 센터에 의해 관리.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
