Summary
I standard kultur metoder celler er tatt ut av sin fysiologiske miljø og dyrket på plastoverflaten av en tallerken. For å studere oppførselen av primære humane benmargceller vi opprettet en 3-D-kultursystem, hvor cellene er dyrket under betingelser rekapitulere den opprinnelige mikromiljøet av vevet.
Abstract
Tissue kultur har vært et uvurderlig verktøy for å studere mange aspekter av cellefunksjon, fra normal utvikling av sykdom. Konvensjonell cellekulturmetoder er avhengig av evnen til cellene, enten for å feste til et fast underlag i en vevskultur rett, eller for å vokse i suspensjon i flytende medium. Flere udødelige cellelinjer har blitt skapt og dyrket ved hjelp av slike metoder, men disse metodene ofte mislykkes når primære celler trenger å bli dyrket ex vivo. En slik svikt har vært forbundet med fraværet av passende ekstracellulære matriks-komponentene av vevet mikromiljø fra de vanlige systemer hvor vevskultur plast er benyttet som et underlag for cellevekst. Ekstracellulær matriks er en integrert del av vevet mikromiljøet, og dens tilstedeværelse er avgjørende for å opprettholde fysiologiske funksjoner slik som cellepolarisering, overlevelse og proliferasjon. Her presenterer vi en 3-dimensjonal vev kultur metode der primære benmargs cells dyrkes i ekstracellulær matriks sammensatt for å rekapitulere mikromiljøet av den menneskelige ben (rbM system). Innebygd i den ekstracellulære matriks, er cellene forsynt med næringsstoffer gjennom mediet supplert med human plasma, og dermed gi et omfattende system hvor celle overlevelse og proliferasjon kan opprettholdes i opp til 30 dager og samtidig opprettholde den cellulære sammensetning av den primære vev. Bruke rbM system har vi lykkes vokst primære benmargceller fra normale donorer og pasienter med amyloidose, og ulike hematologiske kreftformer. RBM systemet gir mulighet for direkte, i-matrise sanntid visualisering av cellen atferd og evaluering av prekliniske effekt av nye behandlingsformer. Videre kan cellene isoleres fra rbM og senere brukt for in vivo transplantasjon, cellesortering, flowcytometri, og nukleinsyre-og proteinanalyse. Til sammen gir RBM metoden et pålitelig system for vekst av primær bein Marrow cellene under fysiologiske forhold.
Introduction
Vevskultur ble utviklet for å studere oppførselen celle i et kontrollert miljø for å minimalisere den systemiske variabilitet ved sammenligning av ulike prosesser i intakte organismer. Denne metoden ble først etablert i begynnelsen av 1900 1,2 og refererer til en teknikk der vev explants ble dyrket ex vivo i et glassfat. På midten av 1900-tallet ble systemet tilpasset å vokse spredte celler snarere enn fragmenter av intakt vev, og begrepene 'vev kultur' og 'cellekultur "ble synonymt tre. I slike konvensjonelle cellekultur-systemer celler dyrkes på overflaten av vevskultur plast belagt med vekstmedium supplert med forskjellige vekstfaktorer. To typer av kulturer har dukket opp basert på adhesjon antall ulike celler: vedheftende cellekultur, hvor cellene feste og spres på vevskultur plast og ikke-festede kulturer hvor cellene er dyrket i suspensjon. Siden de tidlige dagene av cellekultur, flere udødelige cellelinjer har blitt opprettet, slik som HeLa 4, den første menneskelige kreftcellelinje. Disse cellelinjer har kapasitet til å spre seg på ubestemt tid i cellekultur, og de fleste krever ikke noen spesiell behandling for å opprettholde levedyktigheten.
Den reductionist tilnærming av de opprinnelige cellekulturmetoder ble utviklet for å forenkle systemet så mye som mulig ved å inkludere bare de bare minimal komponentene som kreves for å opprettholde cellenes levedyktighet og proliferasjon. Men forenklede cellekultur tilnærminger unnlater å støtte ex vivo fleste primære humane celletyper med begrenset levetid. Derfor er nye kultursystemer være innrettet for å approksimere vevet mikromiljøet så tett som mulig, noe som tillater celle-eksplantater til å vokse under fysiologiske betingelser. I motsetning til de konvensjonelle / reductionist cellekultur tilnærminger, tre-dimensjonal (3-D) kultur-systemer er nå blitt en foretrukket metode for å effektivt kultur forskjelligehumane cellelinjer og primære celler til senere å studere mekanismene som er involvert i helse og sykdom, i sammenheng med en støttende mikromiljøet. Slike 3-D-systemer er vanligvis satt opp ved hjelp av rekonstruerte matrisene og / eller medium supplert med vekstfaktorer for å rekapitulere vevet mikromiljøet for å studere celletyper av interesse. Den første av disse tre-dimensjonal (3-D) kulturmodeller ble utviklet for å studere melkekjertlene utvikling. Å gi cellene med innfødte forhold mammary epitelceller ble innebygd i Matrigel, kollagen IV og laminin-rik kilde til ekstracellulære matrix (ECM), og kledde med vekstmedium. Under slike forhold, melke epitelceller dannes klynger likner melke acini, og ved stimulering med lactogenic hormoner, disse acini utskilt kasein og andre melkeproteiner, inn i det hule Lumena av acini-lignende strukturer. Kasein sekresjon ble ikke observert i standard kulturer selv etter tillegg av prolaktin 5, Som også markerer rollen mikromiljøet i å bevare de morfologiske og fenotypiske egenskapene til cellene. En annen demonstrasjon av tap av normal cellefunksjon når cellene blir tatt ut av sammenheng med deres fysiologiske mikromiljøet er en demonstrasjon på at uten støttende mikromiljøet, keratinocytter ikke klarer å danne lagdelte epidermis seks. Være laget av en rekke andre 3-D modeller for å tillate ex vivo-formering av primære celler 7,8.
Det avgjørende rolle mikromiljøet i celle atferd elegant ble vist i en studie der melke epitelceller dannet "inside-out" acini når dyrket i kollagen jeg matrise, i forhold til riktig polarisert acini som ble dannet i Matrigel. Dette tapet av passende morfologi ble tilbakestilt når laminin-produserende korg celler ble tilsatt til-kollagen kulturer 9. Videre er riktig mikromiljøet som kreves for korrektgenotype manifestasjon. Dyrket i en skål, MCF7 brystcancerceller transfektert med en celle-celle adhesjonsmolekyl CEACAM1 oppfører seg akkurat på samme måte som de untransfected CEACAM negative celler. Men når dyrket i Matrigel, i kontakt med ECM, villtype MCF7 skjema tumor-lignende strukturer mens MCF7 celler transfektert med CEACAM1 gå tilbake til en normal fenotype og form acini med hul Lumena, som er etablert med nonmalignant melkekjertelepitelet 10. Tilsvarende blokkering β1-integrin i brystkreftceller, endres ikke deres oppførsel under standard dyrkningsbetingelser, men det samme eksperimentet utført i 3-D-kulturer viser at blokkering β1-integrin tilbakestilles ondartede celler i en normal fenotype 11.. Derfor er vevet mikromiljøet ikke bare nødvendig for å opprettholde cellenes levedyktighet, men også å opprettholde riktig cellefunksjon.
I tillegg til å gi et system hvor celle oppførsel kan studeres under fysiologiske betingelses, 3-D kulturer fungere som robust og pålitelig medium for preklinisk testing av nye behandlingsformer 8,12,13. Dyrking av celler i 3-D tillater screening av investigational forbindelser under betingelsene for miljø-mediert resistens 14, hvor bidraget av celle-celle og celle-ECM adhesjon kunne bli vurdert. Videre kan av-target toksisitet av nye forbindelser som kan påvises ved å innlemme flere cellene i forskjellige vev. Slike skjermer kan utføres raskere og er mer kostnadseffektive enn de sammenlignbare studier in vivo åtte.
Her presenterer vi et oppsett av en 3-D modell av rekonstruerte benmarg (rbM) hvor normal og ondartet benmarg (BM) celler sprer ex vivo i et system tett etterligne mikromiljøet av den menneskelige BM. Tidligere forsøk på å vokse primære humane BM-celler i 2-D-kulturer, flytende eller heft cocultures med forskjellige komponenter av BM stroma, Eller 3-D, halvfaste agar-kulturer har hatt begrenset suksess på grunn av deres manglende evne til å forsyne cellene med komponentene av vevet mikromiljøet 15-18. I disse systemene primære BM celler hadde dårlig levedyktighet og klarte ikke å spre ex vivo. Et annet system der menneskelige BM stamceller dyrkes i sfæroide cocultures med BM stromale celler er en 3-D-system hvor stamcelle levedyktighet og spredning ble opprettholdt i minst 96 hr 19. Imidlertid, selv om svært gunstig for forståelsen av hematopoetiske stamcelle biologi, dette systemet ikke trofast rekapitulere mikromiljøet av BM som følge av fravær av ECM-komponenter, og derfor begrense dens nytte. RBM modellen beskrevet her presenterer et helhetlig system hvor både mobil og ekstracellulære avdelinger av den menneskelige BM er rekonstruert in vitro. Vi viser at RBM kulturer kan støtte ex vivo vekst av normale menneskelige BM celler, som vill som celler isolert fra pasienter med forskjellige hematologiske forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Advance Utarbeidelse
- Hold sterile serologiske pipetter og pipettespisser ved 4 ° C.
Feilsøking: matrigel gels ved romtemperatur (RT), ved hjelp av kalde pipetter og tips vil hindre Matrigel fra geling under installasjons kultur. - Tin en flaske med Matrigel ved 4 ° C over natten.
2. Forberedelse av reagenser
- Fremstilling av fibronektin stamløsning: Lag en 1 mg / ml stamløsning av fibronektin ved å oppløse 100 mg human fibronektin i 100 ml destillert vann. Når fibronektin er blitt oppløst, steril-filter, alikvot, og oppbevares ved 4 ° C i opptil 6 måneder.
Problemløsning: Ved fibronektin ikke oppløses hurtig inkubere løsningen i noen få minutter i et vannbad innstilt på 37 ° C. - Utarbeidelse av 10x PBS: Løs opp 80 g natriumklorid NaCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2 g KCl og 2,4 g KH 2 PO
- Fremstilling av nøytralisering buffer 20: Lag en oppløsning inneholdende 100 mM HEPES i 2x fosfatbufret saltvann (PBS) ved anvendelse av 1 M HEPES og 10x PBS stamløsninger. Juster pH-verdien til løsningen til 7,0. Oppbevar ved 4 ° C i 2-3 måneder.
- Fremstilling av 2 mg / ml løsning av rottehale kollagen type I: Lag en 2 mg / ml kollagen I løsningen i nøytralisering buffer (trinn 2.3). Vortex løsning på lav hastighet og bland forsiktig med pipettering opp og ned. Som denne collagen er veldig tyktflytende, unngå generering av luftbobler mens pipettering. Det anbefales å forberede kollagen jeg løsningen frisk hver gang. Hold oppløsningen på is inntil bruk.
- Fremstilling av endosteal belegg (rStopp): Bland 1 mg / ml fibronectin lager med 2 mg / ml kollagen I lager (trinn 2.1 og 2.4) til en sluttkonsentrasjon på 77 pg / ml og 29 pg / ml, i 1x &# 160; sterile PBS. Bland og oppbevar ved 4 ° C i opp til 1 måned.
- Utarbeidelse av rekonstruerte benmatrise (rbM):
- Precool 1,5 ml mikrosentrifugerør på is. Hold alle matrise løsninger på is til alle tider.
- Bland 4 deler Matrigel (Matrigel konsentrasjonen varierer fra parti til parti, men variasjonene ble funnet å være ubetydelig), 2,5 deler av 1 mg / ml fibronektin, og 1 del av 2 mg / ml kollagen I på is ved først å pipettere Matrigel i røret ved hjelp av kalde pipetter og deretter legge fibronektin og kollagen I. Matrigel vil starte stivner ved temperaturer over 4 ° C, så jobbe raskt mens pipettering Matrigel. Bland matrisen veldig forsiktig med pipettering opp og ned, unngå å introdusere bobler. Hold rørene på is mens du mikser RBM.
- Utarbeidelse av benmarg vekstmedium (BMGM): Lag 500 ml BMGM inneholder 6,2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 -6 M natrium suksinat, 10 -6 M hydrokortison, 20% humant plasma (normale eller ondartede oppsamlet fra friske donorer eller pasienter), og 1% penicillin / streptomycin i RPMI-1640. CaCl 2, natrium-suksinat, og hydrokortison kosttilskudd kan bli lagret ved -80 ° C i> 6 måneder som 1000 x stamløsninger. Når voksende cellelinjer, kan føtalt bovint serum (FBS) anvendes i stedet for humant plasma.
- Fremstilling av 10% nøytral buffret formalin (NBF) til 37% formaldehyd-stamoppløsning til 1 x PBS ved 10% v / v. Bland godt og lagres ved romtemperatur i 2 til 3 uker, beskyttet mot lys.
- Fremstilling av 1% bovint serum albumin (BSA): veie passende mengde BSA og oppløse den i 1 x PBS. Oppbevar ved 4 ° C og bruk innen en uke. BSA løsning tendens til å bli forurenset hvis de oppbevares i kjøleskap for lengre perioder. Alternativt kan BSA-løsning alikvoteres og fryses ved -20 ° C for lagring over lang tid. Unngå fryse-tine sykluser.
- Utarbeidelse av celle utvinning løsning (CRS): Gjør 5 mM EDTA, 1 mM natrium vanadate (Na <sub> 3-VO 4) og 1,5 mM natrium-fluorid (NaF) oppløsning i 1 x PBS. Steril filter og oppbevar ved 4 ° C inntil seks måneder.
Tre. Innebygd 3-D Culture of nonmalignant og ondartet menneskelig BM Cells
- Rens primære BM mononukleære celler ved Ficoll-Plakk gradientsentrifugering henhold til produsentens anvisninger.
Valgfritt trinn: celler kan merkes med 0,25 mikrometer karboksyfluorescens diacetat, succinimidyl ester (CFSE) i henhold til produsentens instruksjoner for å følge celleproliferasjon hele kulturen periode.
Feilsøking: Hvis cellene dør etter CFSE farging, titrere mengden CFSE som konsentrasjonen er avhengig av celletype, 0,25 mikrometer fungerer godt for primær BM mononukleære celler. - Legg 65 mL av rStopp løsning i hver brønn av en 48-brønn vevskultur behandlede plate. Spre løsningen jevnt fordelt for å dekke hele overflaten av brønnen og inkuber i> 30min ved RT.
- Forbered cellesuspensjonen med en tetthet på 0,5 x 10 6-celler i 10 pl 1 x PBS per brønn av en 48-brønns plate. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør blandes med cellesuspensjonen 100 pl av rbM matriks per brønn. Bland cellene og RBM matrise med forsiktig pipettering opp og ned, unngå å introdusere bobler. Hold celle / matriks blandingen på is for å unngå gelering av matrisen.
Bemerk: den rbM systemet er skalerbar, for å sette opp systemet i en ikke-48-brønnformat ved å justere mengder av alle reagenser (matriser og mellom) basert på overflatearealet av platen som brukes. Scale antallet celler som skal bli belagt i henhold til. - Aspirer rester rStopp og tilsett celle / matriks blandingen inn i sentrum av en brønn. Raskt, spre celle / matriks blanding for å dekke hele overflaten av brønnen jevnt. Sett platen i 30-60 min i 37 ° C, 5% CO2 vevskultur-inkubator tillate matrisen til å størkne. Ikke rist eller disTURB platen under inkubasjon.
Feilsøking: For å unngå ujevn fordeling av celler i rbM, bland godt før plating. Bland etter hver 5. godt belagt for å unngå settling celler til bunnen av røret. Når belagt, ikke celler synke til bunnen av brønnen på grunn av overflatespenningen i matrisen.
Feilsøking: For å unngå ujevn fordeling av celler i rbM, bland godt før plating. Bland etter hver 5. godt belagt for å unngå settling celler til bunnen av røret. Når belagt, ikke celler synke til bunnen av brønnen på grunn av overflatespenningen i matrisen. - Prewarm BMGM i et vannbad innstilt på 37 ° C.
- Etter 30 min, sjekk for å se at matrisen er satt riktig, det vil danne en myk gel lignende lag som ikke beveger seg når platen er skråstilt. Overlegg cellen / matrise lag med en ml varm BMGM. For å unngå at det revner av matrisen pipette mediet svært forsiktig (dispense drop-by-slipp) ved hjelpen serologisk pipette. Sett samlet rbM kultur i en 37 ° C, 5% CO2 vevskultur-inkubator og kultur for den ønskede tidsperioden.
Merk: celleviabilitet opprettholdes i minst 30 dager uten å endre medium, hvis medium endring er bare nødvendig å endre 50% av medium hver gang.
Kritisk punkt: Det er viktig at mediet er ikke kaldt som kald temperatur kan forstyrre det som allerede er satt matrise. Pass på å ikke sprute mediet på toppen av matrisen på det kan bryte den myke massesjikt.
Feilsøking: Hvis celle levedyktighet i RBM systemet er lav, kan celletettheten må bestemmes eksperimentelt når du arbeider med andre enn primær mononukleære celler fra BM aspirates celler. Når du arbeider med cellelinjer, redusere celle nummer 10-fold, som udødeligcellelinjer sprer raskere enn primære celler.
4. 'I-matrix "Imaging
- Bilde dyrkede celler direkte i rbM bruker lyse felt, differensial interferens kontrast (DIC), confocal eller andre imaging teknikker som tillater lang avstand bildebehandling som matrisen er ca 1 mm tykk. Bruk Z-stack funksjon som finnes i mange av de mikroskop for å avbilde hele kulturen fra topp til bunn.
Tips: For farging protokollen under unngå aspirere flekker / vaskeløsninger, i stedet vippe platen og fjern løsninger ved hjelp av en pipette.
- Fjern BMGM ved hjelp av en pipette og vaske 2-3x med 100 mL / vask / godt av RT 1x PBS. Kontroller at nok PBS brukes til å dekke hele overflaten av brønnen.
- Fiks celler i matrisen ved å tilsette 100 ul / brønn (for en 48-brønns plate) på 10% NBF i 15 min ved RT. Fjern NBF og vaske cellene to ganger med 100 mL / vask / godt av RT 1x PBS.
Note: Unngå å bruke kaldt NBF som det kan kondensere matrisen. - Fjern PBS, tilsett 1% BSA i 1 time ved romtemperatur eller ved 4 ° C over natten for å blokkere ikke-spesifikk binding av antistoffer.
- Forbered primære antistoff-løsning i 1% BSA i ønsket fortynning. Fortynning vil variere for hvert antistoff, sjekk med produsenten eller titrere å bestemme optimal antistoffkonsentrasjon. Tilsett 100 ul / brønn av primær antistoffløsning og inkuber i henhold til produsentens instruksjoner.
Kritisk trinn: Alle inkubasjoner som omfatter antistoffer konjugert til fluoroforer eller fluorescerende fargestoffer bør utføres i mørket. - Fjern primær antistoffløsning og vask 3 ganger med 1 x PBS i 5 min.
- For indirekte immunofluorescens farging, inkuberes med et sekundært antistoff konjugert til fluorescerende probe i 1 time ved RT. Fortynn antistoffer i 1% BSA ved konsentrasjon foreslått av produsenten.
- Ta ut den sekundære enntibody løsningen og vask 3 ganger med 1 x PBS i 5 min.
Feilsøking: For å unngå høy bakgrunnen under bildebehandling, titrere de fluorescently konjugerte sekundære antistoffer og bruke den laveste konsentrasjon som gir tilstrekkelig signal. Hvis høy bakgrunn er fortsatt et problem, øke antallet og varigheten av vasketrinn, eller bruke direkte konjugert primære antistoffer, og hoppe over trinn 4.2.6. - For å sette flekker på kjernene tilsett 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nukleær farging løsning, ved fortynning foreslått av produsenten, og inkuberes i 7-10 minutter ved RT.
- Fjern nukleær farging løsningen og vask med 2 x 1 x PBS i 5 min.
- Fjern PBS fra siste vask og tilsett en dråpe av monteringsmedium (vanlig set), på prøven for å bevare fluorescens. Bilde ved hjelp av egnede eksitasjon / utslipps innstillinger på en fluorescerende eller konfokalmikroskop.
Merk: Imaging bør gjøres innen to dager etter fargingfor å unngå nedbrytning av matrise og tap av rbM integritet og tap av fluoriserende signal. Hvis ikke avbildes umiddelbart, bør farget prøvene holdes ved 4 ° C, beskyttet mot lys, inntil avbildning.
5. Isolering av celler fra rbM
- Fjern medium forsiktig uten å forstyrre massesjikt. Ikke aspirer.
- Vask cellene 2x med steril 1x PBS. Ikke aspirer.
- Tilsett 0,5 ml av iskald CRS til hver brønn og fjerne hele massesjikt sammen med cellene, ved kraftig pipettering opp og ned. Samle cellene, matrix, og CRS i en 1,5 ml mikro tube. Plasser på is.
- Til ytterligere 0,5 ml CRS til samme brønn og samle all gjenværende materiale. Overføring til den samme mikrosentrifugerør.
- Vortex blandingen av celler, matriks og CRS og inkuberes på is i 1 time. Vortex-celler hvert 15. min for å lette frigjøring fra matrisen.
- Kontroller blandingen etter 1 time, ingen synlige klumperav matrisen bør være tilstede.
Feilsøking: hvis klumper av matrisen er fortsatt synlige etter en time, overføre celler / matrix / CRS blandingen til en større rør, legge ytterligere 2-5 ml av CRS, og inkuberes i ytterligere 30-60 min. - Sentrifuger cellene i CRS ved 1000 opm i 5 til 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i 1 ml kald 1 x PBS.
- Sentrifuger ved 1000 rpm i 5 til 10 minutter og fjerne supernatanten. Gjenta PBS vask en gang til.
- Den andre PBS vaskefull utvinning av celler fra matrisen og isolerte celler kan bli brukt til nedstrøms applikasjoner som DNA / RNA / protein isolert, strømningscytometri, in vivo transplantasjon, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siden primær benmargceller mislykkes i å spre seg under standard vevskulturbetingelser, ble rbM system utviklet for å etterligne ben tett mikromiljøet, noe som gir et system for å kultur og ekspandere BM-celler ex vivo. De viktigste komponentene i BM ekstracellulær matriks, fibronectin, kollagen I, collagen IV og laminin 21, ble innlemmet i rbM matrisen for å gi den strukturelle stillaset til dette 3-D-kultur. Endosteum, grenseflaten mellom ben og BM, rik på kollagen I og fibronektin, ble rekonstruert ved å belegge overflaten av et vev dyrkningsskål med disse proteiner. Krysstale mellom flere cellene innenfor BM bidrar til den generelle homeostase av vevet. For å sikre at ingen av de cellulære komponenter er utelatt, ble RBM kultur satt opp ved hjelp ufraksjonerte mononukleære celler fra menneskelige BM nål aspirer biopsier. For å sikre at systemet er forsynt med hormoner, vekstfaktorer, end cytokiner som er tilstede i sirkulasjons-miljø, ble kulturmediet supplert med human plasma som tilsvarer prøven som kultiveres (dvs plasma fra normale donorer ble tilsatt når nonmalignant BM-celler ble plassert i rbM, mens plasma fra pasienter som ble tilsatt til kulturer av ondartet celler) (figur 1).
BM og blodprøver fra friske donorer og pasienter med ulike hematologiske maligniteter ble samlet etter godkjenning fra Purdue University og University of Alberta Institusjonelle faglige styrene og etter skriftlig informert samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonen (Tabell 1). Mononukleære celler isolert fra BM biopsier spre og opprettholde sin levedyktighet i rbM system for opp til 30 dager (figur 2). Den cellekonsentrasjon på 0,5 x 10 6 cells/100μl av rbM matrise er blitt bestemt til å være den optimale tetthet for primær-BM-celler. Går utover this tetthet overcrowds systemet redusere celle levedyktighet og spredning priser over tid. En lavere densitet har også vist seg å være ugunstig for den generelle heia av systemet som celle-celle-kontakter har vist seg viktig for en sterk cellevekst. Veksten innenfor RBM kan følges etter merking celler med karboksyfluorescens diacetat, succinimidyl ester (CFSE). Fluorescensintensiteten av CFSE halvdeler med hver celledeling, og dermed celle-proliferasjon, kan spores ved mikroskopi eller strømningscytometri over tid. Videre er cellene innenfor rbM kulturen holdes i de samme mengdeforhold som var tilstede i biopsiprøver 8. I tillegg til de cellene i blodkreft linjene, stromal avdelinger vise robust vekst i rbM. Alkalisk fosfatase uttrykke osteoblasts stand til mineralizing kalsium, tartrate resistente syre fosfatase flekker osteoklaster, olje røde positive adipocytter, og fibronektin produsere stromale celler er funnet på endosteum/ BM grensesnittet til RBM systemet (figur 3).
Tatt sammen, våre data viser at rbM modellen gir en første ex vivo-system, hvor primære humane BM-celler fra friske blodgivere og pasienter med forskjellige ondartede hematologiske tilstander slik som leukemi, lymfom, multippelt myelom og kan opprettholdes, og utvides i opp til 30 dager. rbM gir en helhetlig modell for å studere celle atferd under fysiologiske forhold i sammenheng med de innfødte BM mikromiljøet. Dette systemet har vært brukt av vårt laboratorium for å identifisere fenotypen av de multiple myeloma kreft stamceller og for å studere interaksjoner mellom ondartede celler og BM ekstracellulære matriks, så vel som den krysstale mellom ondartede celler og BM stroma.
| Diagnose | Celletype | Survival | |
| Nonmalignant | BM | Liten | Liten |
| Amyloidose | BM | Høy | Høy |
| Monoklonal gammopati av usikker betydning | BM | Høy | Høy |
| PBMC | Nei | Nei | |
| Plasmacytom | BM | Høy | Høy |
| Ulmende myelomatose | BM | Høy | Høy |
| Myelomatose | BM | Høy | Høy |
| PBMC | Nei | Nei | |
| MB | Høy | Høy | |
| Plasma celle leukemi | BM | Høy | Høy |
| Waldenstøms macroglobulenemia | BM | High | Høy |
| Akutt myelogen leukemi | BM | Høy | Høy |
| Akutt promyelocytic leukemi | BM | Høy | Høy |
| PBMC | Nei | Nei | |
| Akutt lymfatisk leukemi | BM | Liten | Liten |
| Kronisk myelogen leukemi | BM | Liten | Høy |
| Kronisk lymfatisk leukemi | BM | Lav | Slow |
| PBMC | Nei | Nei | |
| Non-Hodgkins lymfom | BM | Liten | Slow |
| PBMC | Nei | Nei |
Tabell 1. Overlevelse og spredning av ulike prøvene dyrkes i rbM. Benmargs mmononukleære celler (BM), perifere mononukleære blodceller (PBMC), eller mobilisert blodprøver (MB) fra friske donorer og pasienter diagnostisert med ulike maligniteter ble dyrket i rbM. Tabellen viser alle prøvetyper som var dyrket i rbM sammen med celletype (dvs. BM, PBMC, eller MB). Omfanget av celle overlevelse og proliferasjon i rbM blir notert. Mens BM og MB vise robust vekst i rbM, PBMC isolert fra pasienter med forskjellige maligniteter var ikke levedyktig i rbM.
Figur 1. . Skjematisk fremstilling av rbM oppsett rbM består av to faser: 1) endosteal belegg (fibronektin, kollagen I (CI)) og 2) rbM matrise (fibronektin, kollagen I (CI), kollagen IV (CIV) og laminin) Bemerk. : kollagen IV og laminin er major komponenter av Matrigel, altså ingen separat tilsetning av disse proteinene er nødvendig. Disse fasene er satt opp i to trinn ved overliggende rbM matrise / celleblanding på toppen av det tynne lag av endosteal matrise. For å følge celleproliferasjon over tid, kan cellene være merket med CFSE før blanding med rbM matrise. I løpet av varigheten av kulturen, kan cellene bli visualisert ved mikroskopi, og cellemigrasjon kan følges i sanntid ved hjelp av et mikroskop utstyrt med et temperatur / CO 2-styrt kammer. Etter 14 til 30 dager i kultur celler kan bli isolert fra matrisen og underkastes en rekke nedstrøms analyser, inkludert både in vitro og in vivo-fremgangsmåter. for å vise større bilde.
Figur 2. Tid løpet av selv segregering av cellene i rbM. BM celler ble dyrket i rbM til angitt antall dager. Stromal elementer blir tydelig ved dag 14, men kan oppdages så tidlig som dag 5 i rbM. I løpet av kulturperioden cellene kan ses å migrere gjennom rbM matriks og samle inn i forskjellige grupper. Masser av ondartede celler utvide over tid (sammenlign blokkstørrelser mellom dag 9-30). Representativt bilde av kulturen på hvert tidspunkt ble tatt med lyse felt mikroskopi på en invertert mikroskop (forstørrelse: 200x). Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Stromale avdelinger er "merket" innenfor rbM. For å evaluere sammensetningen av stromale komponenter som vokser fra i rbM, ble cellene ved overgangen mellom rbM matrise og endosteal belegg evaluert for fibroblast, osteoblast, adipocyttdifferensiering og osteoclast-spesifikke morfologi og markør uttrykk . (a) For å oppdage fibroblaster, celler ble farget for fibronectin (grønn), aktin (rød), og kjerner (blå) og avbildes på en konfokalmikroskop (forstørrelse: 200x). (b) Celler med stromal morfologi ble vist å være preosteoblasts med høye nivåer av alkalisk fosfatase-aktivitet (b.1) og i stand til å mineralizing kalsium som bestemt ved Alizarin Red farging (b.2). (c) Celler med en synlig tilstedeværelse av lipid-dråper ble identifisert som adipocytter basert på positiv farging med Olje Red (C.1). (d) Celler med sporadiske flere kjerner ble anerkjent som preosteoclasts og var positiv for tartrat motstandsdyktig syre fosfatase (TRAP) (D.1). Bright-feltet og farge (nonfluorescent) bilder ble kjøpt på en invertert mikroskop utstyrt med et fargekamera (forstørrelse: 200x). Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RBM Modellen gir et omfattende system der cellulære sammensetningen av BM opprettholdes ex vivo for opp til 30 dager. BM-celler dyrket i rbM selv stratify i henhold til deres funksjon tett ligne BM arkitekturen funnet in vivo. Dessuten er dette det første system som gir mulighet for ekspansjon av multippel myeloma klon 8. De mest kritiske trinn for å sikre god vekst av BM-celler, og den generelle suksess av kulturen er: 1) for å oppnå en frisk populasjon av BM-celler med> 70% levedyktighet og for det meste fritt for røde blodceller, 2) for å sikre at matrise komponentene blandes godt, og at cellene er fordelt jevnt gjennom hele grunnmassen, og 3) for å ta seg ikke å skade matrisen når vekstmedium blir tilsatt til systemet. For å sikre en robust proliferasjon av maligne celler, bør vekstmedium supplert med human plasma som samsvarer med diagnosen av pasienten som celler blir dyrket. One begrensning av RBM system som ble lagt merke til er dens manglende evne til å støtte rene bestander av CD34 + hematopoetiske stamceller, CD20 + B-celler, og CD138 + plasmaceller uten stromal rommet på BM.
RBM-systemet er svært allsidig og kan endres på mange måter til beste passer målene for spesifikke studier. Endotelial rommet kan tilsettes til systemet for å etterligne vaskularisering av BM og ytterligere ekstracellulære matriks-komponentene kan tilføres for å bringe matrisesammensetningen så nær som mulig til den in vivo make-up av BM og matrisekonsentrasjonene kan bli justert for å reflektere sykdomstilstander hvor konsentrasjonene av de enkelte matrisekomponenter kan endres 21.. I tillegg til dyrkning av galvaniske elementer, er rbM system egnet for coculturing forskjellige cellelinjer for å studere celle-celle interaksjoner mellom spesifikke cellepopulasjoner. For eksempel, kan systemet settes opp som en coculture der stromal cellene er belagt over endosteal belegg, er hematopoetiske celler lagt på toppen av stromale celler, og hele stromal / hematopoetiske coculture er belagt først med rbM matrisen, og deretter med vekstmediet. Også nyttig, kan være modifikasjoner av medium sammensetningen å inkludere plasma fra ulike kilder eller medium betinget av stroma å studere hvordan løselige faktorer påvirker celle atferd 12. Cytokiner, vekstfaktorer og hormoner kan også tilsettes til vekstmediet, men bør man være forsiktig for ikke å erstatte alle vekstmedium i kultur samtidig som vekst nærende faktorer som ble utskilt av cellene i rbM kan gå tapt, og dermed , påvirker den totale levedyktigheten til systemet. Vi foreslår å erstatte opptil 50% av mediet samtidig.
RBM systemet kan brukes til å studere både celle atferd (dvs. spredning, levedyktighet, migrasjon, etc.) og å vurdere styrken og off-target effekter av romanen terapeutisker 8,12. Systemet er konfigurert til å rekapitulere vevet mikromiljøet, og dermed kan effekten av investigational stoffer evalueres under betingelsene for miljø-mediert resistens 14.. Ved hjelp av levende celler i sanntid mikroskopi, kan celle-levedyktighet i løpet av behandlingen vurderes etter levende / døde flekker, og virkningen av behandlingen på forskjellige organeller kan evalueres ved hjelp av flere kommersielt tilgjengelige organellespesifikk fargestoffer som lett penetrerer matriksen og rbM blir tatt opp av cellene uten å generere betydelig bakgrunns som kan påvirke avbildning.
RBM system gir en svært allsidig og tilpasningsdyktig modell for å studere BM lidelser. Fordelen med en slik 3-D kultur-metoden sammenlignet med standard 2-D kulturer er evnen til å undersøke celle oppførsel i forbindelse med vevet mikromiljøet slik at virkningene av de mange vekselvirkninger ikke er savnet når cellene blir isolert fra deres fysiskeological miljø og anbragt i en plast fatet. Anken av RBM systemet over i vivo modeller ligger i gjennomsiktigheten i systemet der de interaksjoner som ikke kan sees in vivo på grunn av begrensninger i bildeteknikker kan lett bli dissekert. RBM system gir et medium for enkel manipulering av komponenter og samtidig opprettholde den generelle vevssammensetning, og dermed gir forskeren å dissekere de molekylære mekanismene under etterforskning. Videre har rbM systemet blitt validert som en kostnadseffektiv måte, i forhold til in vivo testing, for å gjennomføre prekliniske studier av nye behandlingsformer 8,12. Til sammen gir RBM modellen et system der mange aspekter av vev biologi kan undersøkes ex vivo med primær prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Forskning Grant Award, American Cancer Society Institutional Forskning Grant (IRG # 58-006-53), til Purdue University Center for Cancer Forskning, og den kanadiske Institutes of Health Research og Alberta Cancer Board satsinger Program. MP ble støttet av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Internship Program (R25CA128770; PI: D. Teegarden) administreres av Onkologisk Sciences Center og Discovery Learning Research Center ved Purdue University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
