Summary
В стандартных методов культивирования клетки берут из их физиологической среде и выращивают на пластиковой поверхности блюдо. Для изучения поведения первичных клеток костного мозга человека, мы создали систему культуры 3-D, где клетки выращиваются в условиях Резюмируя родной микросреду ткани.
Abstract
Культура ткани был бесценным инструментом для изучения многих аспектов функционирования клеток, от нормального развития болезни. Обычные способы культивирования клеток основаны на способности клеток либо присоединить к твердой субстрата тканевой культуральной чашке или расти в суспензии в жидкой среде. Несколько бессмертные линии клеток были созданы и выращенных с использованием таких подходов, однако, эти методы часто не когда первичные клетки должны быть выращены экс виво. Такой отказ был приписан отсутствии соответствующих внеклеточных матричных компонентов ткани микросреды от стандартных систем, в которых тканевой культуры пластик используется как поверхность для роста клеток. Внеклеточной матрицы является неотъемлемой составной частью тканей микросреды и его присутствие имеет решающее значение для поддержания физиологических функций, таких как поляризации клеток, выживание, и пролиферации. Здесь мы представляем тканей метод 3-мерное культуры, где чел первичного костного мозгаLs выращивают в внеклеточного матрикса сформулированной резюмировать на микроокружение человеческой кости (система УОР). Встроенный во внеклеточном матриксе, клетки снабжены питательных веществ через среде с добавлением человеческой плазмы, тем самым обеспечивая комплексную систему, где выживаемость клеток и пролиферацию можно поддерживать в течение до 30 дней при сохранении клеточного состава первичного ткани. Использование системы RBM мы успешно выращивают первичные клетки костного мозга от здоровых доноров и пациентов с амилоидозом, а также различные гемобластозами. Система RBM позволяет прямое, в-матрицы в реальном времени визуализации поведения клеток и оценки доклинических эффективность новой терапии. Кроме того, клетки могут быть выделены из RBM и впоследствии используется для трансплантации в живом организме, сортировки клеток, проточной цитометрии и нуклеиновой кислоты и анализа белка. Взятые вместе, метод УКР предоставляет надежную систему для роста первичного Marro костиW клетки в физиологических условиях.
Introduction
Культура ткани была разработана, чтобы изучить поведение клеток в контролируемой среде, чтобы минимизировать системную изменчивость при сравнении различных процессов в интактных организмов. Этот метод был впервые создан в начале 1900 1,2 и относится к технике, где тканевые эксплантаты культивируют экс естественных в стеклянной посуде. В середине 1900-х годов система была адаптирована расти несмежных ячеек, а не фрагментами здоровых тканей, а термины «тканевой культуры» и «клеточная культура" стало синонимом 3. В таких обычных системах клеточных культур клетки выращивают на поверхности тканевой культуры пластика с наложением ростовой среде, дополненной различными факторами роста. Два типа культур появились на основе адгезии мощности различных клеток: приверженцем культуры клеток, где клетки придают и распространения на пластике культуры ткани и прилипших культур, где клетки распространяются в виде суспензии. С первых дней клеткикультура, несколько бессмертные линии клеток были созданы, например, HeLa 4, первая линия клеток рака у человека. Эти клеточные линии имеют способности к пролиферации на неопределенный срок в культуре клеток, и большинство из них не требует никакого специального лечения для поддержания жизнеспособности.
Редукционистский подход из оригинальных методов культивирования клеток было разработано, чтобы упростить систему как можно больше, включив только голых компонентов минимальных, необходимых для поддержания жизнеспособности клеток и пролиферацию. Однако упрощенные подходы клеточных культур не поддержать Экс Vivo большинство основных типа клеток человека с конечной продолжительности жизни. Таким образом, новые системы культуры в настоящее время разрабатываются, чтобы приблизить ткани микросреду, насколько это возможно, таким образом позволяя сотовые экспланты расти в физиологических условиях. В отличие от обычных подходов / редукционистских клеточной культуры, 3-мерной (3-D) системы культуры в настоящее время становится предпочтительным способом для эффективного культура различныеклеточные линии человека и первичные клетки, чтобы впоследствии изучать механизмы, участвующие в здоровье и болезни, в контексте благоприятной микросреды. Такие 3-D системы обычно созданы с использованием восстановленных матриц и / или среде с добавлением факторов роста, для того, чтобы повторять тканевое микроокружение для изучения типов клеток, представляющих интерес. Первый из этих 3-мерной (3-D) моделей культуры была разработана для изучения развития молочных желез. Для обеспечения клеток с нативных условиях эпителиальные клетки молочной железы были встроены в Матригель, коллагена IV и ламинином богатых источника внеклеточного матрикса (ECM), и обложил ростовой среды. При таких условиях, эпителиальные клетки молочной железы сформированы кластеры, напоминающие молочную ацинусов, и после стимуляции лактогенных гормонов, эти ацинусов секретируется казеин и другие белки молока, в полую LUMENA из ацинусами-подобных структур. Секреции казеином, не наблюдалось в стандартных культур даже после того пролактина 5, Далее подчеркивая роль микроокружения в сохранении морфологические и фенотипические характеристики клеток. Это еще одно доказательство потери нормальной клеточной функции, когда клетки берутся из контекста их физиологического микросреды является демонстрация того, что без поддержки микросреды, кератиноциты не способны формировать слоистые эпидермис 6. Ряд других моделей 3-D были созданы, чтобы позволить Экс Vivo распространение первичных клеток 7,8.
Решающая роль микроокружения в поведении клеток был элегантно продемонстрировано в исследовании, где эпителиальные клетки молочной железы образуется "наизнанку" ацинусы при культивировании в коллагена я матрица, по сравнению с правильно поляризованного ацинусов, которые формировались в Матригель. Эта потеря правильной морфологии был возвращен когда ламинина-продуцирующие миоэпителиальные клеток добавляли к культурам коллаген I 9. Кроме того, правильно микросреда требуется для точнойгенотип проявление. Выращенный в чашке, раковые клетки молочной железы MCF7, трансфицированные CEACAM1 молекулы адгезии с клетка-клетка ведут себя точно так же, как и нетрансфицированных CEACAM негативных клетках. Тем не менее, при культивировании в Матригель, в контакте с ECM, образуют дикого типа опухолевых MCF7-подобных структур в то время как MCF7 клетки, трансфицированные CEACAM1 вернуться к нормальному фенотипу и формы ацинусов с полым LUMENA, как было установлено с доброкачественной эпителия молочной железы 10. Точно так же, блокируя β1-интегрина в клетках рака молочной железы не изменить свое поведение в стандартных условиях культивирования, но тот же самый эксперимент выполняется в 3-D культур показывает, что блокирование β1-интегрина возвращается злокачественные клетки к нормальному фенотипу 11. Таким образом, ткань микроокружение не требуется только для поддержания жизнеспособности клеток, но и сохранить правильное функционирование клеток.
В дополнение к предоставлению систему, в которой поведение клеток можно изучать под физиологического состоянияс, 3-D культур функционировать как прочная и надежная среда для доклинических испытаний новых терапии 8,12,13. Культивирование клеток в 3-D позволяет скрининг исследуемых соединений в условиях окружающей среды опосредованного лекарственной устойчивости 14, где вклад клетка-клетка и клетка-ЕСМ адгезии могли быть оценены. Кроме того, проходит мимо токсичность новых соединений может быть установлено путем включения нескольких клеточных компартментах различных тканей. Такие экраны могут быть выполнены более быстро и более экономически эффективным, чем сравнимые исследований в естественных условиях 8.
Здесь мы представляем установку 3-D модели реконструированного костного мозга (УКР), где нормальных и злокачественных костного мозга (BM) клетки размножаться экс естественных в системе тесно подражая микросреды человеческого BM. Предыдущие попытки растет первичные BM-клеток человека в 2-D культур, жидкости или адгезивных совместных культурах с различными компонентами БМ стромы, Или 3-D, полутвердые агар культуры имели ограниченный успех из-за их неспособности поставлять клетки с компонентами ткани микросреды 15-18. В этих системах первичные элементы BM было плохое жизнеспособность и не размножаются экс естественных. Другая система, где клетки-предшественники BM человека выращивают в сфероида совместных культурах с BM стромальных клеток находится в 3-D система, где был поддержан жизнеспособность гемопоэтических стволовых клеток и пролиферации, по крайней мере 96 часов 19. Однако, несмотря на весьма полезным для понимания кроветворной биологии предшественников, эта система не верно воспроизводят на микроокружение BM из-за отсутствия компонентов ECM, поэтому, ограничивая его полезность. УКР модель, описанная здесь представляет собой целостную систему, где оба клеточные и внеклеточные отсеки человеческого BM реконструируются в пробирке. Мы покажем, что RBM культуры может поддерживать Экс Vivo рост нормальных клеток человека BM, как мыLL как клетки, выделенные от пациентов с различными гематологическими нарушениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Предварительная подготовка
- Держите стерильные серологические пипетки и наконечники при 4 ° С.
Поиск и устранение неисправностей: Matrigel гели при комнатной температуре (RT); используя холодные пипеток и советы помешает Матригель от гелеобразования во время установки культуры. - Оттепель бутылку Матригель при 4 ° С в течение ночи.
2. Подготовка реагентов
- Получение исходного раствора фибронектин: Создать 1 мг / мл исходного раствора фибронектина растворением 100 мг человеческого фибронектина в 100 мл дистиллированной воды. После того, как фибронектин растворится, стерильный фильтр, аликвоту, и хранить при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
Устранение неполадок: Если фибронектин не растворяется быстро инкубировать решение в течение нескольких минут в наборе водяной бане при 37 ° С - Подготовка 10x PBS: Растворите 80 г хлорида натрия NaCl, 14,4 г Na 2 HPO 4, 2 г KCl и 2,4 г KH 2 PO
- Подготовка нейтрализации буфера 20: Марка раствора, содержащего 100 мМ HEPES в 2 раза фосфатным буферным раствором (PBS) с использованием 1М HEPES и 10-кратное PBS растворы. Доводят рН раствора до 7,0. Хранить при температуре 4 ° С в течение 2-3 месяцев.
- Получение 2 мг / мл раствора хвоста крысы коллагена типа I: Сделать 2 мг / мл коллагена I раствор в буфере нейтрализации (шаг 2,3). Vortex раствора при низкой скорости и аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Как это коллаген очень вязкими, избежать образования воздушных пузырьков в то время как пипетки. Рекомендуется подготовить коллагена I решение свежий каждый раз. Хранить раствор на льду до использования.
- Подготовка эндостальной покрытием (раздирать): Смешайте 1 мг / мл фибронектина акции с 2 мг / мл коллагена I складе (шаги 2.1 и 2.4) в конечной концентрации 77 мкг / мл и 29 мкг / мл соответственно, в 1х &# 160; стерильной PBS. Смешивать и хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 месяца.
- Подготовка реконструированной костной матрицы (УКР):
- Предварительного охлаждения 1,5 мл микроцентрифужных пробирок на льду. Храните все матричные решения на льду во все времена.
- Смешать 4 части Матригель (концентрация Матригель варьируется от партии к партии, но вариации оказались незначительны), 2,5 части 1 мг / мл фибронектина и 1 часть 2 мг / мл коллагена I на льду по первым пипетки Матригель в трубка используя холодные наконечники, а затем добавить фибронектин и коллаген I. Матригель начнет твердеть при температуре выше 4 ° С, так что работать быстро, а пипетки Матригель. Смешайте матрицу очень мягко с помощью пипетки вверх и вниз, избежать введения пузырьков. Держите пробирки на лед во время смешивания УОР.
- Подготовка среды для роста костного мозга (BMGM): Сделайте 500 мл BMGM содержащие 6,2 х 10 -4 М CaCl 2, 10 -6 М сукцинат натрия, 10 -6 м гидрокортизон, 20% человеческой плазмы (нормальной или злокачественная собраны у здоровых доноров или больных), и 1% пенициллина / стрептомицина в RPMI-1640. CaCl 2, сукцинат натрия и гидрокортизон добавки можно хранить при -80 ° С в течение> 6 мес как 1000 х маточных растворов. При выращивании клеточных линий, фетальной бычьей сыворотки (FBS) может быть заменен на человеческой плазмы.
- Подготовка 10% нейтральном буферном растворе формалина (НСБ): Добавить 37% формальдегида маточного раствора, чтобы 1x PBS при 10% об / об Хорошо перемешать и хранить при комнатной температуре в течение 2-3 недель, защищенных от света.
- Получение 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA): Взвешивают необходимое количество BSA и растворить его в 1х PBS. Хранить при 4 ° С и использовать в течение 1 недели. Решение БСА имеет тенденцию быть зараженным, если хранить в холодильнике в течение более длительных периодов времени. Альтернативно, раствор BSA может быть аликвоты и замораживали при -20 ° С в течение длительного хранения. Избегайте циклов замораживания-оттаивания.
- Приготовление раствора для восстановления клеток (CRS): Сделайте 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ванадата натрия (Na <суб> 3 VO 4) и 1,5 мМ фторид натрия (NaF) решение в 1x PBS. Стерильный фильтр и хранить при температуре 4 ° С до 6 месяцев.
3. Встроенный 3-D Культура доброкачественных и злокачественных клеток человека BM
- Очищают первичные мононуклеарных клеток BM на Ficoll-Налет градиентного центрифугирования в соответствии с инструкциями изготовителя.
Необязательный шаг: клетки могут быть помечены 0,25 мкм карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидиловым эфиром (CFSE) в соответствии с инструкциями изготовителя следовать пролиферацию клеток в течение всего периода культуры.
Устранение неполадок: Если клетки умирают после окрашивания CFSE, титрование количество CFSE как концентрация зависит от типа клеток; 0,25 мкм хорошо работает для первичных мононуклеаров BM. - Добавить 65 мкл раствора REND в каждую лунку тканевой культуры обрабатывали пластины 48-луночного. Распространение решение равномерно покрыть всю поверхность колодца и инкубировать> 30мин при комнатной температуре.
- Подготовка суспензии клеток при плотности 0,5 × 10 6 клеток в 10 мкл 1х PBS на лунку 48-луночного планшета. В 1,5 мл трубки микроцентрифужных смешать клеточной суспензии с 100 мкл УКР матрицы на лунку. Смешайте клетки и УОР матрицу, осторожно пипеткой вверх и вниз; избежать введения пузырьков. Хранить клеток / матрицу смесь на лед, чтобы избежать гелеобразования матрицы.
Примечание: система УОР полностью масштабируемым, чтобы настроить систему в формате не-48-а, корректировать суммы всех реагентов (матриц и средних) на основе площади поверхности пластины, используемой. Шкала количество клеток в быть покрыты соответствующим образом. - Аспирируйте оставшиеся Ренд и добавьте клеток / матричную смесь, в центре хорошо. Быстро, распространять клеток / матричную смесь, чтобы покрыть всю поверхность скважины равномерно. Место пластины в течение 30-60 мин в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе культуры ткани, чтобы матрица затвердеть. Не трясите и не расTurb пластину во время инкубации.
Поиск и устранение неисправностей: Для предотвращения неравномерного распределения клеток в УОР, хорошо перемешать до посева. Смешайте после каждого 5-й и покрытием, чтобы избежать клеток располагающиеся на дне пробирки. После покрытием, клетки не опускаются на дно скважины благодаря поверхностному натяжению в матрице.
Поиск и устранение неисправностей: Для предотвращения неравномерного распределения клеток в УОР, хорошо перемешать до посева. Смешайте после каждого 5-й и покрытием, чтобы избежать клеток располагающиеся на дне пробирки. После покрытием, клетки не опускаются на дно скважины благодаря поверхностному натяжению в матрице. - Prewarm BMGM на водяную баню устанавливается на 37 ° С
- Через 30 мин, проверьте, что матрица установил правильно; он образует мягкий гель, как слой, который не перемещается, когда пластина наклонена. Наложение клеток / матричный слой 1 мл теплой BMGM. Чтобы избежать образования трещин на матрицы пипетки среднего очень мягко (дозирования падение за каплей), используясерологические пипетки. Поместите собранный УКР культуры в 37 ° С, 5% СО 2 культуре ткани инкубатора и культуры для требуемого периода времени.
Примечание: жизнеспособность клеток сохраняется в течение не менее 30 дней, не меняя среду; если требуется среда изменение изменить только 50% от среды каждый раз.
Критический шаг: Очень важно, чтобы среда не холодно, как холодная температура может нарушить уже установленный матрицу. Будьте осторожны, не шприц среды в верхней части матрицы в это может нарушить мягкую матричного слоя.
Устранение неполадок: Если жизнеспособность клеток в системе УКР низкий, плотность клеток, возможно, придется быть определена экспериментально при работе с другими, чем первичные мононуклеарных клеток из BM аспиратов клеток. При работе с клеточными линиями, уменьшение числа клеток в 10 раз, как иммортализованных клеточных линий размножаться быстрее, чем первичные клетки.
4. 'В-матрицы' изображений
- Изображение культивируемые клетки непосредственно в УОР, используя яркий поле, дифференциальный интерференционный контраст (DIC), конфокальной или любые другие методы визуализации, которые позволяют дальней изображений как матрица имеет толщину около 1 мм. Используйте функцию Z-Stack доступны на многих из микроскопов к изображению всю культуру сверху донизу.
Совет: Для протокол иммуноокрашивание ниже избежать аспирации окрашивание / моющих растворов, а наклонять тарелку и снимите решения с помощью пипетки.
- Снимите BMGM с помощью пипетки и мыть 2-3x 100 мкл / стирки / а РТ 1x PBS. Убедитесь, что достаточно PBS используется, чтобы покрыть всю поверхность скважины.
- Исправить клетки в матрице путем добавления 100 мкл / лунку (для 48-луночного планшета) 10% NBF в течение 15 мин при комнатной температуре. Удалить НСБ и промыть клетки дважды 100 мкл / стирки / а РТ 1x PBS.
Примечание: Избегайте использования холодной НСБ, как это может разжижения матрицу. - Удаление PBS, добавляют 1% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре или при 4 ° С в течение ночи, чтобы блокировать неспецифического связывания антител.
- Подготовка основной раствор антител в 1% BSA при требуемой разбавления. Разведение будет разным для каждого антитела, обратитесь к производителю или титрование для определения оптимальной концентрации антител. Добавить 100 мкл / лунку раствора первичного антитела и инкубировать в соответствии с инструкциями изготовителя.
Критический шаг: Все инкубации с участием антител, конъюгированных с флуорофорами или флуоресцентных красителей должны быть выполнены в темноте. - Удаление раствора первичного антитела и промыть 3 раза с 1x PBS в течение 5 мин.
- Для непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания, инкубировать с вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентного зонда в течение 1 ч при комнатной температуре. Развести антител в 1% BSA в концентрации, предложенным производителем.
- Снимите вторичный Antibody решение и промыть 3 раза с 1x PBS в течение 5 мин.
Поиск и устранение неисправностей Во избежание высокий фон во время съемки, титрование флуоресцентно сопряженных вторичными антителами и использовать самую низкую концентрацию, обеспечивающей должную сигнал. Если высокий фон по-прежнему является проблемой, увеличить количество и продолжительность стадий промывки, или использовать непосредственно сопряженных первичных антител, и пропустите шаг 4.2.6. - Чтобы окрасить ядра добавьте 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) ядерного красящего раствора, при разведении, предложенном производителем, и выдержать в течение 7-10 минут при комнатной температуре.
- Удалить решение ядерной окрашивания и мыть 2 раза с 1x PBS в течение 5 мин.
- Снимите PBS от последней промывки и добавить каплю монтажной среды (регулярное множество), по образцу сохранить флуоресценции. Изображение с помощью соответствующих настроек возбуждения / эмиссии на флуоресцентной или конфокальной микроскопии.
Примечание: изображений должно быть сделано в течение 2 дней окрашивания, чтобы избежать деградации матрицы и потери целостности RBM и потери флуоресцентного сигнала. Если не отображены немедленно, окрашенные образцы не должны храниться при температуре 4 ° С в защищенном от света, пока визуализации.
5. Выделение клеток из RBM
- Удалите среду осторожно, не нарушая матричного слоя. Не аспирации.
- Вымойте клетки 2x стерильной 1x PBS. Не аспирации.
- Добавить 0,5 мл ледяной CRS в каждую лунку и удалить весь матричный слой вместе с клетками, энергично пипетки вверх и вниз. Соберите клетки, матрицу и CRS в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Поместите на льду.
- Добавить еще 0,5 мл CRS в той же скважине и собрать все оставшийся материал. Переезд в то же трубки микроцентрифужных.
- Vortex смесь клеток, матрицы и CRS и инкубировать на льду в течение 1 часа. Вихревые клетки каждые 15 мин, чтобы облегчить освобождение от матрицы.
- Проверьте смеси после 1 часа, без видимых комковматрицы должны присутствовать.
Устранение: если комки матрицы все еще видимы через 1 час, передача клеток / матрица / CRS смесь в большую пробирку, добавить дополнительные 2-5 мл CRS, и инкубируют в течение дополнительного 30-60 мин. - Центрифуга клетки в CRS в 1000 оборотов в минуту в течение 5-10 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл холодного PBS 1x.
- Центрифуга при 1000 оборотов в минуту в течение 5-10 минут и удалите супернатант. Повторите стирке PBS еще раз.
- Второй PBS мыть завершения восстановления клеток из матрицы и изолированных клеток могут быть использованы в любых последующих приложений, таких как выделения ДНК / РНК / белок, проточной цитометрии, виво трансплантации, и т.д..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поскольку клетки первичной костного мозга не в состоянии размножаться в стандартных условиях культивирования тканей, система УОР был создан, чтобы точно имитировать костную микросреду, обеспечивая систему культуры и расширить BM клетки экс естественных. Основными компонентами внеклеточного матрикса, BM, фибронектин, коллаген I, коллаген IV, ламинин и 21, были включены в УОР матрицы, чтобы обеспечить структурную каркас в этом 3-D культуры. Эндосте, интерфейс между костью и Б.М., богатой коллагеном I и фибронектина, была реконструирована путем нанесения на поверхность ткани культуры блюдо с этих белков. Перекрестные помехи между множеством клеточных компартментах в пределах BM способствует общему гомеостаза ткани. Чтобы убедиться, что ни один из клеточных компонентов не за бортом, культура УКР был создан с использованием нефракционированного мононуклеарных клеток из человеческих BM игла аспирации биопсии. Чтобы убедиться, что система поставляется с гормоны, факторы роста,д цитокинов, присутствующих в кровеносной окружающей среды, культуральную среду с добавлением человеческой плазмы, соответствующий образец быть культивированы (т.е. плазмы от нормальных доноров был добавлен при доброкачественных клеток BM были помещены в УОР, в то время как плазма от пациентов был добавлен в культурах злокачественных клетки) (рис. 1).
БМ и образцы крови здоровых доноров и пациентов с различными гемобластозы были собраны после утверждения Университета Пердью и Университета Альберты институциональных исследований советов и после письменного информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией (табл. 1). Мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга пациентов биопсии размножаться и сохранять свою жизнеспособность в системе УОР на срок до 30 дней (рис. 2). Концентрация клеток 0,5 х 10 6 cells/100μl УКР матрицы был определен как оптимальная плотность для первичных клеток BM. Выход за пределы ТхиПлотность overcrowds систему убывающую жизнеспособность клеток и скорость пролиферации в течение долгого времени. Низкая плотность Также было показано, чтобы быть вредным для общего вереск системы в качестве межклеточных контактов доказали, жизненно важно для устойчивого роста клеток. Рост в RBM может следовать после мечения клеток с карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидиловым эфиром (CFSE). Интенсивность флуоресценции из CFSE половинки с каждым делением клетки, таким образом, пролиферация клеток можно отследить с помощью микроскопа или проточной цитометрии с течением времени. Кроме того, сотовые отсеки внутри культуры УКР ведутся в тех же пропорциях, присутствовали в образцах биопсии 8. В дополнение к клетках кроветворных линий, стромальных отсеки демонстрируют устойчивый рост в УОР. Щелочной фосфатазы выражая остеобласты, способные минерализующего кальция, тартрат окрашивания кислой фосфатазы остеокластов устойчивых, нефть красных положительных адипоцитов, и фибронектина производству стромальных клеток находятся в эндоста/ Б. М. интерфейс системы RBM (рис. 3).
Взятые вместе, наши данные показывают, что модель RBM обеспечивает первый Экс Vivo систему, в которой первичные человека BM клетки от здоровых доноров и пациентов с различными гемобластозами, таких как лейкемия, лимфома, и множественной миеломы можно сохранить и расширить до 30 дней. УКР предоставляет полный модель для изучения поведения клеток в физиологических условиях в контексте родной BM микросреды. Эта система была использована нашей лаборатории, чтобы определить фенотип многочисленных раковых стволовых клеток миеломы и изучить взаимодействие между злокачественными клетками и внеклеточным матриксом BM, а также перекрестные помехи между злокачественными клетками стромы и BM.
| Диагностика | Тип клетки | Выживание | |
| Доброкачественных | Б.М. | Умеренный | Умеренный |
| Амилоидоз | Б.М. | Высокий | Высокий |
| Моноклональные гаммапатия неопределенного значения | Б.М. | Высокий | Высокий |
| РВМС | Нет | Нет | |
| Плазмоцитома | Б.М. | Высокий | Высокий |
| Тлеющий множественной миеломы | Б.М. | Высокий | Высокий |
| Множественная миелома | Б.М. | Высокий | Высокий |
| РВМС | Нет | Нет | |
| МБ | Высокий | Высокий | |
| Лейкоз плазматических клеток | Б.М. | Высокий | Высокий |
| Waldenstroms macroglobulenemia | Б.М. | Герметический интегрирующий гироскопчас | Высокий |
| Острый миелобластный лейкоз | Б.М. | Высокий | Высокий |
| Острый лейкоз промиелоцитарного | Б.М. | Высокий | Высокий |
| РВМС | Нет | Нет | |
| Острый лимфолейкоз | Б.М. | Умеренный | Умеренный |
| Хронический миелолейкоз | Б.М. | Умеренный | Высокий |
| Хронический лимфолейкоз | Б.М. | Низкий | Медленно |
| РВМС | Нет | Нет | |
| Лимфома Неходжкинская | Б.М. | Умеренный | Медленно |
| РВМС | Нет | Нет |
Таблица 1. Выживание и распространение различных образцов, культивируемых в УОР. Костный мозг мononuclear клеток (BM), мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), или мобилизованные образцы крови (MB) от здоровых доноров и больных с диагнозом различных злокачественных опухолей культивировали в УКР. В таблице приведены все образцы типы, которые культивировали в RBM вместе с типом клеток (т.е. BM, РВМС или Мб). Степень выживания и пролиферации клеток в RBM отмечены. В то время как Б.М. и МБ демонстрируют высокие темпы роста в области УКР, МНПК, выделенные из пациентов с различными злокачественными новообразованиями не были жизнеспособными в УОР.
Рисунок 1. . Схематическое изображение установки УКР УКР состоит из двух этапов: 1) эндостальная покрытия (фибронектин, коллаген I (CI)) и 2) УКР матричных (фибронектин, коллаген I (CI), коллаген IV (CIV) и ламинином) Примечание. : коллаген IV и ламинин являются мAJOR компоненты Матригель, таким образом никакого отдельного добавление этих белков не требуется. Эти фазы установить в два этапа путем наложения УКР матрицы / смеси клеток в верхней части тонким слоем эндостальной матрицы. Чтобы следовать пролиферацию клеток с течением времени, клетки могут быть помечены CFSE перед смешиванием с матрицей УОР. За продолжительности культивирования клетки могут быть визуализированы с помощью микроскопии и миграции клеток может следовать в режиме реального времени с помощью микроскопа, снабженного температуры / CO 2 контролируемой камеры. После 14-30 дней в культуре клеток могут быть выделены из матрицы и подвергали различным вниз по течению анализов, в том числе и в пробирке и в естественных условиях процедур. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Время курс самосегрегации клеточных отсеков в УОР. BM клетки выращивали в RBM для указанного количества дней. Стромальные элементы становятся очевидными на 14 день, но могут быть обнаружены в начале 5-й день в УКР. В течение периода клеток культуры можно увидеть мигрирующих через УКР матрицы и агрегирования в различных кластерах. Массы злокачественных клеток расширить со временем (сравните размеры кластеров между день 9-30). Представитель вид культуры в каждый момент времени был захвачен с помощью яркие микроскопии области на инвертированный микроскоп (увеличение: 200X). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Стромальные отсеки "поставляется" в УОР. Чтобы оценить состав стромальных компонентов, которые перерастают в УОР, клетки при переходе между УКР матрицы и эндостальной покрытия были оценены для фибробластов, остеобластов, адипоцитов и остеокластов конкретных морфологии и экспрессии маркеров . (а) Для обнаружения фибробласты, клетки окрашивали для фибронектина (зеленый), актин (красный), и ядра (синий) и отображается на конфокальной микроскопии (увеличение: 200X). (б) Клетки с стромы морфологии было показано, что преостеобластами с высоким уровнем активности щелочной фосфатазы (Б.1) и способен минерализации кальция, как определено Ализарин Красной окрашивания (В.2). (с) Клетки с видимой присутствии липидных капель были определены как адипоциты на основе положительного окрашивания Нефть Красные (с.1). (г) Клетки с редкими нескольких ядер были признаны пр.eosteoclasts и оказались позитивными на тартрат фосфатазы стойкого кислоты (TRAP) (д.1). Яркий поле и цвет (нефлуоресцентный) изображения были получены на инвертированный микроскоп, снабженный цветной камерой (увеличение: 200X). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель RBM представляет собой завершенную систему, где клеточный состав БМ поддерживается Экс Vivo на срок до 30 дней. BM клетки, выращенные в RBM само-стратификации в соответствии с их функция тесно имитируя архитектуру BM найдено в естественных условиях. Кроме того, это первая система, которая позволяет для расширения множественной миеломой клона 8. Наиболее важные шаги для обеспечения устойчивого роста БМ клеток и общий успех культуры являются: 1) для получения здорового населения клеток BM с> 70% жизнеспособность и в основном бесплатно эритроцитов, 2) для того, чтобы матричные компоненты хорошо смешивают и что клетки равномерно распределены по всей матрице, и 3) заботиться, чтобы не повредить матрицу, когда средний рост добавляется к системе. Для обеспечения надежной пролиферацию злокачественных клеток, средний рост должен быть дополнен человеческой плазмы соответствующие диагноз пациента, чьи клетки в настоящее время культивируют. Опе ограничение системы RBM, что был замечен является его неспособность поддерживать очищенные популяции CD34 + гемопоэтических стволовых клеток, CD20 + В-клеток и CD138 + клеток плазмы без стромы отсеке BM.
Система RBM очень универсальны и могут быть изменены во многом, наиболее подходящий для целей конкретных исследований. Эндотелия отсек может быть добавлен в систему, чтобы имитировать сосудистой системы БМ и дополнительных компонентов внеклеточного матрикса может поставляться довести состав матрицу как можно ближе к в естественных макияж в БМ и концентрации матричных может быть настроен на отражать болезненных состояний, где концентрация отдельных компонентов матрицы могут быть изменены 21. В дополнение к культивирования первичных клеток, система RBM подходит для сокультивировани различные клеточные линии для изучения межклеточных взаимодействий между конкретными клеточных популяций. Например, система может быть настроена как сокультивирования где стромыл клетки высевают в течение эндостальной покрытием, гемопоэтические клетки добавляются в верхней части стромальных клеток, и весь стромальных / гемопоэтических сокультивирования накладывается сначала с матрицей УКР а затем с ростовой среды. Также полезно, может быть модификации состава среды включить плазму из различных источников или среды, обусловленных стромы, чтобы изучить, как растворимые факторы влияют на поведение клеток 12. Цитокины, факторы роста и гормоны также могут быть добавлены в ростовой среде, однако, следует соблюдать осторожность, чтобы не заменить все питательную среду в культуре сразу как поддержание роста факторов, которые секретируются клетками в УОР может быть потеряна, таким образом , влияет на общий жизнеспособности системы. Мы предлагаем замены до 50% среды одновременно.
Система RBM можно использовать для изучения как поведение клеток (т.е. распространение, жизнеспособность, миграции и т.д.) и для оценки потенцию и мимо ворот эффекты новый терапевтическийы 8,12. Система настроена на резюмировать тканевое микроокружение, таким образом, эффективность исследуемых препаратов можно оценить в условиях окружающей среды опосредованной лекарственной устойчивости 14. Использование живых клеток в реальном времени микроскопии, жизнеспособность клеток в течение лечения можно оценить с помощью живой / мертвый окрашивания и аффект лечения на различных органелл может быть оценена с использованием нескольких коммерчески доступных органеллоспецифичными красители, которые легко проникают в матрицу RBM и взяты вверх клетками без этого значительную фон, который может повлиять на воображение.
Система RBM обеспечивает очень гибкое и адаптируемой модель для изучения расстройств BM. Преимущество такого 3-D способа культивирования по сравнению со стандартными 2-D культур в способность к обучению поведение клеток в контексте ткани микросреды гарантируя, что эффекты множественных взаимодействий, не пропустил, когда клетки выделяют из их физигические среда и помещали в пластиковую чашку. Привлекательность системы RBM над естественных условиях моделей в заключается в прозрачности системы, где взаимодействия, которые не могут быть замечены в естественных условиях из-за ограничений методов визуализации может быть легко расчлененного. Система RBM обеспечивает среду для облегчения работы компонентов при сохранении состава общей ткани, что позволяет исследователю анализировать молекулярные механизмы в рамках расследования. Кроме того, система RBM была утверждена в качестве экономически эффективным способом, по сравнению с исследования на живом, проводить доклинические исследования новых терапии 8,12. Взятые вместе, модель RBM обеспечивает систему, где многие аспекты ткани биологии можно исследовать экс естественных использованием первичных образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет грантов от Национального института здравоохранения, Национальный институт рака (1R21CA141039), BD Biosciences Research выдаче гранта, Американское общество рака институциональных исследований Грант (IRG # 58-006-53), в Purdue University Центра Рака Исследования и канадские Институты Исследования Здоровья и научно-исследовательских инициатив Программы Альберта совета Рак. Депутат при поддержке Национального института здравоохранения, Национальный институт рака, профилактики рака программе стажировки (R25CA128770; PI: Д. Teegarden) в ведении онкологического Центра Наук и Научно-исследовательский центр Discovery обучения в Университете Пердью.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
