Summary
Dans les procédés de culture standards cellules sont retirées de leur environnement physiologique et cultivées sur la surface en plastique d'un plat. Pour étudier le comportement de cellules primaires de moelle osseuse humaine, nous avons créé un système de culture en 3-D, où les cellules sont cultivées dans des conditions récapitulant le microenvironnement du tissu natif.
Abstract
La culture de tissus a été un outil précieux pour étudier de nombreux aspects de la fonction de la cellule, du développement normal de la maladie. Les méthodes de culture cellulaire classiques reposent sur la capacité des cellules, soit à attacher à un substrat solide d'une boîte de culture tissulaire ou de croître en suspension dans un milieu liquide. Des lignées de cellules immortelles multiples ont été créées et cultivées à l'aide de telles approches, cependant, ces méthodes ne parviennent souvent lorsque des cellules primaires besoin d'être cultivées ex vivo. Un tel échec a été attribué à l'absence de composants de la matrice extracellulaire appropriées du micro-environnement tissulaire à partir des systèmes classiques où la culture de tissu en plastique est utilisé en tant que surface pour la croissance cellulaire. La matrice extracellulaire est un composant intégral de la micro-environnement tissulaire et sa présence est indispensable pour le maintien des fonctions physiologiques telles que la polarisation des cellules, la survie et la prolifération. Nous présentons ici une méthode de culture des tissus en 3 dimensions où cel os primaire de la moellels sont cultivées dans une matrice extracellulaire formulé pour récapituler le microenvironnement de la moelle humaine (système RBM). Incorporé dans la matrice extracellulaire, les cellules sont alimentées en nutriments à travers le milieu supplémenté avec du plasma humain, fournissant ainsi un système complet où la survie et la prolifération cellulaires peuvent être maintenues pendant jusqu'à 30 jours, tout en maintenant la composition cellulaire du tissu primaire. En utilisant le système FrP nous avons développé avec succès des cellules de moelle osseuse provenant de donneurs normaux primaires et les patients atteints d'amylose, et diverses hémopathies malignes. Le système permet FrP directe pour la visualisation en temps réel, dans la matrice du comportement cellulaire et évaluation de l'efficacité préclinique de nouveaux agents thérapeutiques. De plus, les cellules peuvent être isolées à partir de la GR et ensuite utilisés pour la transplantation in vivo, le tri cellulaire, cytométrie de flux, et de l'acide nucléique et l'analyse des protéines. Pris dans leur ensemble, le procédé FrP fournit un système fiable pour la croissance de l'os primaire Marrow cellules dans des conditions physiologiques.
Introduction
La culture de tissus a été développé pour étudier le comportement des cellules dans un environnement contrôlé pour minimiser la variabilité systémique lorsque l'on compare différents processus dans les organismes intacts. Cette méthode a été créé dans le début des années 1900 et 1,2 réfère à une technique où explants de tissus ont été cultivées ex vivo dans un plat en verre. Au milieu des années 1900 le système a été adapté pour cultiver des cellules dispersées plutôt que des fragments de tissus intacts, et de la culture de tissus »et de« culture cellulaire »est devenu synonyme de 3. Dans de tels systèmes de culture de cellules classiques cellules sont cultivées sur la surface de la matière plastique de culture de tissu recouvert avec un milieu de croissance supplémenté avec divers facteurs de croissance. Deux types de cultures sont apparues sur la base de la capacité d'adhérence de cellules différentes: la culture de cellules adhérentes, dans laquelle les cellules se fixent et se répandent sur le plastique de culture de tissus et les cultures non adhérentes, où les cellules sont propagées en suspension. Depuis les premiers jours de celluleculture, plusieurs lignées de cellules immortelles ont été créées, telles que les cellules HeLa 4, la première ligne de cellules de cancer humain. Ces lignées cellulaires sont capables de proliférer indéfiniment en culture cellulaire, et la plupart ne nécessitent pas de traitement spécial pour maintenir la viabilité.
L'approche réductionniste des méthodes de culture de cellules d'origine a été conçu pour simplifier le système autant que possible en incluant uniquement les composants minimum requis pour maintenir la viabilité et la prolifération cellulaire. Cependant, les approches de culture de cellules ne parviennent pas à soutenir simplifiées ex vivo la plupart des types de cellules humaines primaires avec durée de vie finie. Par conséquent, de nouveaux systèmes de culture sont conçus pour se rapprocher autant que possible le microenvironnement tissulaire, permettant ainsi explants cellulaires de se développer dans des conditions physiologiques. Contrairement aux approches traditionnelles réductrices / de culture cellulaire, en 3 dimensions (3-D) des systèmes de culture sont en train de devenir une méthode privilégiée pour la culture efficacement diversdes lignées cellulaires humaines et des cellules primaires d'étudier les mécanismes impliqués dans la suite, la santé et la maladie, dans le contexte d'un micro-environnement favorable. Ces systèmes 3-D sont généralement mis en place en utilisant des matrices et / ou reconstruits milieu supplémenté avec des facteurs de croissance, afin de récapituler le microenvironnement tissulaire pour étudier les types d'intérêt cellulaires. Le premier de ces trois dimensions (3-D) des modèles de culture a été développé pour étudier le développement de la glande mammaire. À fournir des cellules avec des conditions natives des cellules épithéliales mammaires ont été incorporés dans le Matrigel, le collagène IV et la source de la matrice extracellulaire (ECM), de la laminine-riche, et recouvert avec un milieu de croissance. Dans ces conditions, les cellules épithéliales mammaires formés grappes ressemblant acini mammaire, et lors d'une stimulation avec des hormones lactogènes, ces acini sécrétées caséine et d'autres protéines du lait, en l'lumena creux des structures d'acini-like. Caséine sécrétion n'a pas été observée dans les cultures classiques, même après plus de prolactine 5, Mettant l'accent sur le rôle des micro-en préservant les caractéristiques morphologiques et phénotypiques des cellules. Une autre démonstration de la perte de la fonction cellulaire normale lorsque les cellules sont retirées du cadre de leur micro-environnement physiologique est une démonstration que sans micro-environnement favorable, les kératinocytes ne parviennent pas à former épiderme stratifié 6. Un certain nombre d'autres modèles 3-D ont été créés pour permettre aux ex vivo propagation de cellules primaires 7,8.
Le rôle crucial des micro-environnement dans le comportement des cellules a été élégamment démontrée dans une étude où les cellules épithéliales mammaires formés "inside-out" acini lorsqu'elles sont cultivées dans du collagène I matriciel, par rapport à la acini correctement polarisé qui ont été formés dans le Matrigel. Cette perte de la morphologie correcte s'est inversée lorsque les cellules myoépithéliales laminine productrices ont été ajoutés aux cultures de collagène I 9. En outre, microenvironnement correct est nécessaire pour la précisiongénotype manifestation. Cultivées dans un plat, des cellules de cancer du sein MCF7 transfectées avec une cellule-cellule molécule d'adhésion CEACAM1 se comportent exactement les mêmes que les cellules négatives de CEACAM non transfectées. Toutefois, lorsqu'elles sont cultivées en Matrigel, en contact avec ECM structures ressemblant à des tumeurs, de forme de type sauvage MCF7 tandis que les cellules MCF7 transfectées avec CEACAM1 reviennent à un phénotype et forme acini normale avec lumena creux, comme cela a été établi avec l'épithélium mammaire bénigne 10. De même, le blocage de l'intégrine β1-dans les cellules cancéreuses du sein ne modifie pas leur comportement dans des conditions de culture standard, mais la même expérience réalisée dans des cultures en 3-D montre que le blocage de l'intégrine β1-revient des cellules malignes à un phénotype normal 11. Par conséquent, les micro-environnement tissulaire n'est pas seulement nécessaire pour maintenir la viabilité des cellules, mais également de conserver un fonctionnement correct des cellules.
En plus de fournir un système dans lequel le comportement des cellules peut être étudiée dans des conditions physiologiquess, cultures 3-D fonctionner comme moyen robuste et fiable pour les essais précliniques de nouveaux traitements 8,12,13. La culture de cellules en 3-D permet le criblage de composés expérimentaux dans les conditions de l'environnement médiation pharmacorésistance 14, où la contribution de la cellule-cellule et cellule-ECM adhésion pourrait être évaluée. En outre, la toxicité hors cible de nouveaux composés peut être déterminée par incorporation de multiples compartiments cellulaires de différents tissus. Ces écrans peuvent être effectuées plus rapidement et sont plus rentables que les études comparables in vivo 8.
Nous présentons ici une configuration d'un modèle 3-D de reconstitution de la moelle osseuse (RBM) où les cellules normales et malignes de la moelle osseuse (BM) prolifèrent ex vivo dans un système imitant de près le microenvironnement de la BM humaine. Les précédentes tentatives de culture de cellules primaires humaines BM dans les cultures 2-D, liquide ou co-cultures adhérentes avec diverses composantes de la BM stromaOu 3-D, des cultures d'agar semi-solides ont rencontré un succès limité en raison de leur incapacité à fournir les cellules avec les composants du micro-environnement tissulaire de 15 à 18. Dans ces systèmes, les cellules BM primaires avaient une mauvaise viabilité et n'ont pas réussi à proliférer ex vivo. Un autre système dans lequel les cellules progénitrices BM humaines sont cultivées dans les co-cultures avec des sphéroïdes cellules stromales BM est un système 3-D, où la viabilité des cellules souches hématopoïétiques et la prolifération a été maintenue pendant au moins 96 h 19. Cependant, bien que très bénéfique pour la compréhension de la biologie progéniteur hématopoïétique, ce système ne récapituler pas fidèlement le micro-environnement de la BM en raison de l'absence de composants de la MEC, par conséquent, ce qui limite son utilité. Le modèle décrit ici FrP présente un système complet où les deux compartiments cellulaires et extracellulaires de la BM humaine sont reconstruits in vitro. Nous montrons que les cultures RBM peut soutenir la croissance ex vivo de cellules BM humains normaux, comme nousll que les cellules isolées de patients atteints de divers troubles hématologiques.
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Protocol
Une. Préparation à l'avance
- Gardez pipettes sérologiques stériles et embouts de pipette à 4 ° C.
Dépannage: gels Matrigel à température ambiante (RT); l'aide de pipettes froid et conseils vous empêcher Matrigel de gélification lors de la configuration de la culture. - Décongeler une bouteille de Matrigel à 4 ° C pendant la nuit.
2. Préparation des réactifs
- Préparation de la solution de fibronectine stock: Faire un / ml solution de fibronectine de stock 1 mg par dissolution de 100 mg fibronectine humaine dans 100 ml d'eau distillée. Une fois la fibronectine a dissous, filtre stérile, aliquote, et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
Dépannage: Si la fibronectine ne se dissout pas rapidement incuber la solution pendant quelques minutes dans un jeu de bain d'eau à 37 ° C. - Préparation de 10x PBS: Dissoudre 80 g de chlorure de sodium NaCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2 g de KCl et 2,4 g de KH 2 PO
- Préparation du tampon de neutralisation 20: Préparer une solution contenant 100 mM de HEPES à 2x tampon phosphate salin (PBS) en utilisant 1 M HEPES et 10x PBS solutions mères. Ajuster le pH de la solution à 7,0. Stocker à 4 ° C pendant 2-3 mois.
- Préparation de la solution 2 mg / ml de queue de rat de collagène de type I: Faire une solution à 2 mg / ml de collagène I dans le tampon de neutralisation (étape 2.3). Vortex la solution à basse vitesse et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Comme ce collagène est très visqueux, d'éviter la génération de bulles d'air lors du pipetage. Il est recommandé de préparer la solution de collagène I frais à chaque fois. Conserver la solution sur la glace jusqu'à utilisation.
- Préparation de revêtement endo-osseux (REND): Mélanger 1 mg / stock fibronectine ml avec 2 mg / ml de collagène I actions (étapes 2.1 et 2.4) à une concentration finale de 77 pg / ml et 29 pg / ml, respectivement, en 1x et# 160; PBS stérile. Mélanger et conserver à 4 ° C pendant 1 mois.
- Préparation de reconstruit la matrice osseuse (RBM):
- Prérefroidir 1,5 ml microtubes sur la glace. Gardez toutes les solutions de la matrice sur la glace en tout temps.
- Mélanger 4 parties Matrigel (concentration Matrigel varie de lot à lot, mais les variations ont été jugés négligeables), 2,5 parties de 1 mg / ml de fibronectine et une partie de 2 mg / ml de collagène I sur la glace d'abord pipetage Matrigel en le tube à l'aide des embouts de pipette froid puis ajouter la fibronectine et le collagène I. Matrigel va commencer solidification à des températures supérieures à 4 ° C, afin de travailler rapidement lors du pipetage du Matrigel. Mélanger la matrice très doucement par pipetage de haut en bas, d'éviter d'introduire des bulles. Gardez les tubes sur la glace tout en mélangeant le FrP.
- Préparation du milieu de croissance de la moelle osseuse (BMGM): Ajoutez 500 ml d'BMGM contenant 6,2 x 10 ~ 4 M de CaCl2, 10 -6 M de succinate de sodium, 10 -6 M d'hydrocortisone, 20% de plasma humain (normale ou maligne provenant de donneurs sains ou de patients), et 1% de pénicilline / streptomycine dans un milieu RPMI-1640. CaCl 2, le succinate de sodium, et des suppléments d'hydrocortisone peuvent être conservés à -80 ° C pendant> 6 mois à 1 000 x solutions mères. Lors de la croissance de lignées cellulaires, du sérum bovin fœtal (FBS) peut être remplacé par du plasma humain.
- Préparation de 10% du formol tamponné neutre (FBN): Ajouter la solution de formaldéhyde des stocks de 37% à 1x PBS à 10% v / v Bien mélanger et stocker à température ambiante pendant 2-3 semaines abri de la lumière.
- Préparation de 1% d'albumine de sérum bovin (BSA): Peser quantité appropriée de BSA et le dissoudre dans du PBS 1x. Conserver à 4 ° C et utiliser dans 1 semaine. Solution de BSA a tendance à être contaminé s'il est conservé au réfrigérateur pendant de longues périodes. En variante, la solution de BSA peut être réparti en portions aliquotes et congelé à -20 ° C pour une conservation à long terme. Éviter les cycles de gel-dégel.
- Préparation de la solution de récupération de cellule (CRS): Assurez-EDTA 5 mM, vanadate de sodium à 1 mM (Na <sub> 3 VO 4) et 1,5 mM de fluorure de sodium (NaF), solution dans du PBS 1x. Filtre stérile et conserver à 4 ° C jusqu'à 6 mois.
3. Embarqué 3-D de la culture de cellules BM humain non malignes et malignes
- Purifier les cellules mononucléaires BM primaires par Ficoll-Plaque gradient centrifugation selon les instructions du fabricant.
Étape facultative: les cellules peuvent être étiquetés avec 0,25 uM diacétate de carboxyfluorescéine, succinimidylester (CFSE) selon les instructions du fabricant pour suivre la prolifération des cellules tout au long de la période de culture.
Dépannage: Si les cellules meurent après coloration CFSE, titrer la quantité de CFSE que la concentration dépend du type de cellule; 0,25 uM fonctionne bien pour les cellules mononucléaires BM primaires. - Ajouter 65 ul de solution déchirent dans chaque puits d'une culture de tissus traités plaque de 48 puits. Étendre la solution uniformément pour recouvrir toute la surface du puits et incuber pendant> 30min à température ambiante.
- Préparer la suspension de cellules à une densité de 0,5 x 10 6 cellules dans 10 ul de 1 x PBS par puits d'une plaque à 48 puits. Dans un tube de centrifugation de 1,5 ml de mélange de la suspension de cellules avec 100 pi de matrice FrP par puits. Mélanger les cellules et la matrice FrP par pipetage de haut en bas; éviter d'introduire des bulles. Maintenir le mélange cellule / matrice sur de la glace pour éviter la gélification de la matrice.
Remarque: le système FrP est entièrement modulable, de mettre en place le système dans un format non 48 puits, ajuster les quantités de tous les réactifs (matrices et moyennes) sur la base de la surface de la plaque utilisée. À l'échelle le nombre de cellules devant être plaqué en conséquence. - Aspirer le déchirent restant et ajouter le mélange cellules / matrice dans le centre d'un puits. Rapidement, étaler le mélange cellules / matrice pour couvrir toute la surface du puits de façon uniforme. Placer la plaque pendant 30-60 min à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur de culture tissulaire pour permettre à la matrice de se solidifier. Ne pas secouer ou disTurb la plaque pendant l'incubation.
Dépannage: Pour empêcher la distribution inégale des cellules dans FrP, bien mélanger avant le plaquage. Mélanger après chaque 5 ème bien plaqué les cellules pour éviter la décantation au fond du tube. Une fois plaqué, les cellules ne tombent pas au fond du puits du fait de la tension de surface dans la matrice.
Dépannage: Pour empêcher la distribution inégale des cellules dans FrP, bien mélanger avant le plaquage. Mélanger après chaque 5 ème bien plaqué les cellules pour éviter la décantation au fond du tube. Une fois plaqué, les cellules ne tombent pas au fond du puits du fait de la tension de surface dans la matrice. - Préchauffer BMGM dans un bain-marie réglé à 37 ° C.
- Après 30 minutes, vérifiez que la matrice a mis correctement, il va former un gel mou comme couche qui ne bouge pas lorsque la plaque est incliné. Superposer la couche cellulaire / matrice avec 1 ml de chaud BMGM. Pour éviter tout doucement la déchirure de la pipette la matrice de support (distribution goutte-à-goutte) à l'aideune pipette sérologique. Placer la culture FrP assemblées en un 37 ° C, 5% CO 2 incubateur de culture tissulaire et la culture pendant la période de temps souhaitée.
Remarque: la viabilité des cellules est maintenue pendant au moins 30 jours sans changer moyen, si le changement moyen est nécessaire de changer seulement 50% de milieu à chaque fois.
Étape critique: Il est essentiel que le milieu ne fait pas froid que la température froide peut perturber la matrice déjà mis. Prenez soin de ne pas injecter le milieu sur le dessus de la matrice au risque de rupture de la couche de matrice molle.
Dépannage: Si la viabilité des cellules dans le système FrP est faible, la densité cellulaire peut avoir à déterminer expérimentalement lorsque l'on travaille avec des cellules autres que les cellules mononucléaires primaires de ponctions BM. Lorsque l'on travaille avec des lignées cellulaires, de diminuer le nombre de cellules de 10 fois, que des lignées cellulaires immortalisées prolifèrent plus rapidement que les cellules primaires.
4. Imaging "En-matrice»
- L'image des cellules cultivées directement dans FrP utilisant fond clair, contraste d'interférence différentiel (DIC), confocale ou d'autres techniques d'imagerie qui permettent l'imagerie à longue distance que la matrice est d'environ 1 mm d'épaisseur. Utilisez la fonction Z-stack disponible sur la plupart des microscopes à l'image toute la culture de haut en bas.
Astuce: Pour le protocole d 'immuno-dessous éviter l'aspiration des solutions coloration / lavage, au lieu incliner la plaque et enlever solutions aide d'une pipette.
- Retirez le BMGM en utilisant une pipette et laver 2-3x avec 100 pl / lavage / puits de PBS 1x RT. Assurez-vous que suffisamment de PBS est utilisé pour couvrir toute la surface du puits.
- Fixer les cellules de la matrice en ajoutant 100 pl / puits (pour une plaque à 48 puits) de 10% NBF pour 15 min à température ambiante. Retirer FBN et laver les cellules deux fois avec 100 pl / lavage / puits de PBS 1x RT.
Remarque: Évitez d'utiliser FBN froid comme il peut liquéfier la matrice. - Retirer du PBS, ajouter 1% de BSA pendant 1 heure à température ambiante ou à 4 ° C pendant une nuit afin de bloquer la liaison non spécifique d'anticorps.
- Préparer la solution d'anticorps primaire dans 1% de BSA à la dilution nécessaire. Dilution variera pour chaque anticorps, vérifiez auprès du fabricant ou titrer pour déterminer la concentration d'anticorps optimal. Ajouter 100 ul / puits de solution d'anticorps primaire et incuber selon les instructions du fabricant.
Étape cruciale: Toutes les incubations impliquant des anticorps conjugués à des fluorophores ou des colorants fluorescents doivent être effectuées dans l'obscurité. - Retirer la solution d'anticorps primaire et laver 3 fois avec PBS 1x pendant 5 min.
- Pour la coloration par immunofluorescence indirecte, l'incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la sonde fluorescente pendant 1 h à RT. Diluer les anticorps dans 1% de BSA à une concentration suggéré par le fabricant.
- Retirez le secondairesolution ntibody et laver 3 fois avec PBS 1x pendant 5 min.
Dépannage: Pour éviter un bruit de fond lors de l'imagerie, titrer les anticorps secondaires conjugués à fluorescence et utiliser la plus faible concentration que fournit le signal adéquat. Si un bruit de fond est toujours un problème, augmenter le nombre et la durée des étapes de lavage, ou utiliser des anticorps primaires directement conjugués, et passer à l'étape 4.2.6. - Pour colorer les noyaux ajouter 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution de coloration nucléaire, à la dilution suggéré par le fabricant, et incuber pendant 7-10 min à température ambiante.
- Retirer la solution de coloration nucléaire et laver 2 fois avec PBS 1x pendant 5 min.
- Retirez le PBS à partir du dernier lavage et ajouter une goutte de milieu de montage (série régulière), sur l'échantillon de préserver fluorescence. L'image en utilisant les paramètres d'excitation / émission appropriées sur un microscope à fluorescence ou confocal.
Remarque: L'imagerie doit être fait dans les 2 jours de colorationpour éviter la dégradation de la matrice et la perte de l'intégrité GR et une perte de signal fluorescent. Si ce n'est pas imagée immédiatement, les échantillons colorés doivent être conservés à 4 ° C, à l'abri de la lumière, jusqu'à ce que l'imagerie.
5. Isolement de cellules à partir de FrP
- Retirez délicatement milieu sans déranger la couche de matrice. Ne pas aspirer.
- Laver les cellules avec 2x stérile 1x PBS. Ne pas aspirer.
- Ajouter 0,5 ml de CRS glacées à chaque puits et enlever la couche de matrice entière avec les cellules, par pipetage vigoureusement de haut en bas. Recueillir les cellules, la matrice, et CRS dans un tube de 1,5 ml. Placez sur la glace.
- Ajouter un supplément de 0,5 ml CRS le même puits et de recueillir tous les documents restants. Transfert à la même microtube.
- Vortex le mélange de cellules, la matrice et du SRC et incuber sur de la glace pendant 1 heure. cellules Vortex toutes les 15 min pour faciliter la libération de la matrice.
- Vérifier le mélange après 1 h, sans grumeaux visiblesde la matrice doit être présent.
Dépannage: si touffes de matrice sont encore visibles après 1 h, les cellules de transfert / matrice / mélange CRS à un tube plus grand, ajouter plus de 2-5 ml de CRS, et incuber pendant un 30-60 min supplémentaire. - Centrifuger les cellules dans CRS à 1000 rpm pendant 5-10 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS froid 1x.
- Centrifuger à 1000 rpm pendant 5-10 min et éliminer le surnageant. Répétez le lavage PBS une fois de plus.
- Le second lavage PBS achève la récupération des cellules de matrice et des cellules isolées peut être utilisé pour toutes les applications en aval telles que l'isolement d'ADN / ARN / protéine, la cytométrie en flux, la transplantation in vivo, etc.
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Representative Results
Comme les cellules de moelle osseuse primaires sont incapables de proliférer dans des conditions de culture tissulaire standard, le système RBM a été créé pour imiter étroitement le microenvironnement osseux, en fournissant un système de culture de cellules et d'élargir BM ex vivo. Les principaux composants de la matrice extracellulaire BM, la fibronectine, collagène de type I, le collagène IV, la laminine et 21, ont été incorporés dans la matrice FrP de fournir l'échafaudage structurel à cette culture 3-D. Endosteum, l'interface entre l'os et la BM, riche en collagène I et la fibronectine, a été reconstruit par revêtement de la surface d'une boîte de culture de tissu avec ces protéines. La diaphonie entre de multiples compartiments cellulaires au sein de la BM contribue à l'homéostasie du tissu global. Pour veiller à ce qu'aucun des composants cellulaires sont laissés de côté, la culture RBM a été mis en place en utilisant des cellules mononucléées non fractionnées des BM biopsies aiguille aspirer humaines. Afin de s'assurer que le système est fourni avec des hormones, des facteurs de croissance, und cytokines présentes dans le milieu de circulation, le milieu de culture a été complété avec du plasma humain correspondant à l'échantillon étant mis en culture (par exemple le plasma provenant de donneurs normaux a été ajouté lorsque les cellules de BM non malignes ont été placés dans GR, tandis que le plasma des patients a été ajouté aux cultures du malin cellules) (Figure 1).
BM et des échantillons de sang provenant de donneurs sains et des patients atteints de diverses tumeurs malignes hématologiques ont été recueillies après l'approbation de l'Université de Purdue et de l'Université de l'Alberta institutionnels conseils de recherche et après consentement éclairé écrit, conformément à la Déclaration d'Helsinki (tableau 1). Les cellules mononucléaires isolées de biopsies BM prolifèrent et maintenir leur viabilité dans le système FrP pour jusqu'à 30 jours (Figure 2). La concentration cellulaire de 0,5 x 10 6 cells/100μl de matrice RBM a été déterminée comme étant la densité optimale de cellules de MO primaires. Au-delà de thidensité de s provoque l'engorgement du système en diminuant la viabilité des cellules et le taux de prolifération dans le temps. Une densité plus faible a aussi été démontré que cela nuise à la santé globale du système en tant que contacts cellule-cellule sont révélés essentiels pour une croissance cellulaire robuste. Croissance dans le FrP peut être suivie après marquage des cellules avec diacétate de carboxyfluorescéine, ester succinate (CFSE). L'intensité de fluorescence de CFSE moitiés avec chaque division cellulaire, donc la prolifération cellulaire peut être suivie par microscopie ou cytométrie de flux dans le temps. En outre, les compartiments cellulaires au sein de la culture RBM sont maintenues dans les mêmes proportions que étaient présents dans les échantillons de biopsie 8. En plus des cellules des lignées hématopoïétiques, compartiments stromales affichent une croissance robuste dans FrP. Phosphatase alcaline exprimer ostéoblastes capables de minéralisation calcium, résistant tartrate acide phosphatase ostéoclastes de coloration, l'huile adipocytes positifs rouges, et la production de cellules stromales de la fibronectine se trouvent à la endoste/ BM l'interface du système FrP (figure 3).
Dans l'ensemble, nos données montrent que le modèle FrP fournit un premier système ex vivo où les cellules humaines primaires BM provenant de donneurs et patients atteints de diverses malignités hématologiques telles que la leucémie, le lymphome, le myélome multiple et en bonne santé peuvent être maintenus et étendus jusqu'à 30 jours. FrP fournit un modèle complet pour étudier le comportement des cellules dans des conditions physiologiques dans le cadre de la micro-natif BM. Ce système a été utilisé par notre laboratoire pour déterminer le phénotype des multiples cellules souches cancéreuses de myélome et d'étudier les interactions entre les cellules malignes et la matrice extracellulaire BM, ainsi que la diaphonie entre les cellules malignes et le stroma BM.
| Diagnostic | Type de cellules | Survie | |
| Bénigne | BM | Modéré | Modéré |
| Amylose | BM | Haut | Haut |
| Gammapathie monoclonale de signification indéterminée | BM | Haut | Haut |
| PBMC | Aucun | Aucun | |
| Plasmocytome | BM | Haut | Haut |
| Myélome multiple dormant | BM | Haut | Haut |
| Le myélome multiple | BM | Haut | Haut |
| PBMC | Aucun | Aucun | |
| MB | Haut | Haut | |
| leucémie des cellules plasmatiques | BM | Haut | Haut |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | High | Haut |
| La leucémie myéloïde aiguë | BM | Haut | Haut |
| Leucémie aiguë promyélocytaire | BM | Haut | Haut |
| PBMC | Aucun | Aucun | |
| Leucémie aiguë lymphoblastique | BM | Modéré | Modéré |
| La leucémie myéloïde chronique | BM | Modéré | Haut |
| La leucémie lymphoïde chronique | BM | Faible | Lentement |
| PBMC | Aucun | Aucun | |
| Le lymphome non hodgkinien | BM | Modéré | Lentement |
| PBMC | Aucun | Aucun |
Tableau 1. La survie et la prolifération de divers spécimens cultivés dans FrP. Moelle osseuse mononuclear cellules (BM), les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ou des échantillons de sang mobilisé (MB) provenant de donneurs sains et de patients atteints de diverses tumeurs malignes ont été cultivées dans GAR. Le tableau ci-dessous présente tous les types d'échantillons qui ont été cultivées en GAR ainsi que le type de cellule (c'est-BM, PBMC, ou Mo). La mesure de la survie cellulaire et la prolifération dans RBM sont notés. Alors que BM et MB affichent une croissance robuste dans FrP, PBMC isolées de patients atteints de diverses tumeurs malignes ne sont pas viables dans FrP.
Figure 1. . Représentation schématique de la configuration FrP FrP se compose de deux phases: 1) le revêtement endo-osseux (fibronectine, collagène de type I (CI)) et 2) la matrice de la GAR (fibronectine, collagène de type I (CI), le collagène IV (CIV) et laminine) Note. : collagène IV et la laminine sont la mcomposants AJOR de Matrigel, donc pas plus séparé de ces protéines est nécessaire. Ces phases sont mises en place en deux étapes, en recouvrant le mélange RBM matrice / cellules sur le dessus de la mince couche de matrice endo-osseux. Pour suivre la prolifération cellulaire au cours du temps, les cellules peuvent être marquées avec du CFSE avant le mélange avec la matrice GAR. Au cours de la durée de la culture, les cellules peuvent être visualisées par microscopie et la migration cellulaire peut être suivie en temps réel en utilisant un microscope équipé d'une / CO 2 chambre à température contrôlée. Après 14-30 jours dans des cellules en culture peuvent être isolés à partir de la matrice et soumis à diverses analyses en aval, y compris à la fois in vitro et in vivo procédures. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Évolution dans le temps de l'auto-ségrégation des compartiments cellulaires dans FrP. cellules BM ont été cultivées dans FrP pour le nombre de jours indiqués. Éléments stromales se manifestent par jour 14, mais peuvent être détectés dès le jour 5 de la GAR. Au cours des cellules de la période de culture peut être vu de la migration à travers la matrice FrP et l'agrégation en groupes distincts. Des masses de cellules malignes développer au fil du temps (comparer les tailles de cluster entre le jour 9-30). Vue représentative de la culture à chaque point de temps a été capturé en utilisant la microscopie en champ clair sur un microscope inversé (grossissement: 200X). Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Compartiments stromales sont «livrés» au FrP. Afin d'évaluer la composition des composants du stroma qui envahissent les cultures dans FrP, les cellules à la transition entre la matrice FrP et revêtement endo-osseux ont été évalués pour la morphologie des fibroblastes, ostéoblastes, adipocytes, et spécifique des ostéoclastes et l'expression du marqueur . (a) Pour détecter les fibroblastes, les cellules ont été colorées pour la fibronectine (vert), l'actine (rouge), et les noyaux (bleu) et reproduits sur un microscope confocal (grossissement 200X). (b) Les cellules stromales avec la morphologie se sont avérées préostéoblastes avec des niveaux élevés d'activité de la phosphatase alcaline (b.1) et capable de minéraliser calcium tel que déterminé par coloration au rouge d'alizarine (b.2). (c) Les cellules avec une présence visible de gouttelettes de lipides ont été identifiés comme des adipocytes en fonction de coloration positive avec huile rouge (c.1). (d) Les cellules avec des noyaux multiples occasionnels ont été reconnus comme preosteoclasts et étaient positifs pour la phosphatase acide tartrate résistante (TRAP) (d.1). Champ lumineux et la couleur (non fluorescentes) images ont été acquises sur un microscope inversé équipé d'une caméra couleur (grossissement: 200X). Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Le modèle FrP fournit un système complet où la composition cellulaire de la BM est maintenue ex vivo pendant 30 jours. BM cellules cultivées dans FrP auto-stratifier selon leur fonction imitant de près l'architecture BM trouvé in vivo. En outre, il s'agit du premier système qui permet l'expansion de l'myélome multiple clone 8. Les étapes les plus critiques pour assurer la croissance robuste des cellules BM et le succès global de la culture sont les suivantes: 1) pour obtenir une population saine des cellules BM avec> 70% de viabilité et la plupart du temps libre de globules rouges, 2) veiller à ce que les composants de la matrice sont bien mélangés, et que les cellules sont réparties uniformément dans la matrice, et 3) de prendre soin de ne pas endommager la matrice lorsque le milieu de croissance est ajouté au système. Afin d'assurer la prolifération de cellules malignes solides, le milieu de croissance doit être complété avec du plasma humain correspondant le diagnostic du patient dont les cellules sont mises en culture. One limitation du système FrP qui a été remarqué, c'est son incapacité à soutenir les populations purifiées de hématopoïétiques CD34 + des cellules souches, des cellules B CD20 + et les cellules CD138 + plasma sans le compartiment stromal de la BM.
Le système FrP est très polyvalent et peut être modifiée de nombreuses façons de répondre au mieux aux objectifs d'études spécifiques. Compartiment endothélial peut être ajouté au système pour imiter la vascularisation de la BM et des composants supplémentaires de la matrice extracellulaire peut être fourni pour amener la composition de matrice la plus proche possible de l'vivo maquillage dans du BM et les concentrations de la matrice peut être ajustée à refléter les états pathologiques où les concentrations des différents composants de la matrice 21 peuvent être modifiés. En plus de la culture de cellules primaires, système FrP est adapté pour co-culture de diverses lignées cellulaires pour étudier les interactions cellule-cellule entre les populations de cellules spécifiques. Par exemple, le système peut être configuré en tant que co-culture où stromales cellules L sont plaquées sur le revêtement endo-osseux, les cellules hématopoïétiques sont ajoutées au-dessus des cellules stromales, et l'ensemble de coculture stromale / hématopoïétique est superposée avec la première matrice GR et ensuite avec le milieu de croissance. Sont également utiles, peuvent être les modifications de la composition du milieu d'inclure plasma provenant de différentes sources ou de milieu conditionné par des stroma d'étudier la façon dont des facteurs solubles influent sur le comportement de la cellule 12. Les cytokines, les facteurs de croissance et les hormones peuvent également être ajoutés au milieu de croissance, cependant, il faut prendre soin de ne pas remplacer tout le milieu de croissance dans la culture à la fois en tant que facteurs de maintien de croissance qui ont été sécrétées par les cellules en GAR peut être perdue, ainsi , ce qui affecte la viabilité globale du système. Nous suggérons remplaçant jusqu'à 50% de la moyenne à la fois.
Le système RBM peut être utilisée pour étudier à la fois le comportement des cellules (c.-à-prolifération, la viabilité, la migration, etc) et à évaluer la puissance et les effets hors-cible de roman thérapeutiques 8,12. Le système est configuré de récapituler le micro-environnement tissulaire, par conséquent, l'efficacité de médicaments à l'étude peut être évaluée dans les conditions de l'environnement à médiation par la résistance aux médicaments 14. Utilisation de cellules vivantes microscopie en temps réel, la viabilité cellulaire au cours du traitement peut être évaluée par coloration Vivant / Mort et de l'incidence du traitement sur les différents organites peut être évaluée à l'aide de multiples disponibles dans le commerce colorants spécifiques à l'organite qui pénètrent facilement la matrice GR et sont prises en livraison par les cellules sans générer de fond important qui pourrait affecter l'imagerie.
Le système FrP fournit un modèle très polyvalent et adaptable pour étudier les troubles BM. L'avantage d'une telle méthode de culture 3-D par rapport aux cultures standards en 2-D est dans la capacité d'étudier le comportement des cellules dans le contexte du micro-environnement tissulaire veillant à ce que les effets des interactions multiples ne sont pas manqué lorsque les cellules sont isolées de leur phyenvironnement gique et placé dans une boîte en plastique. L'appel du système FrP sur des modèles in vivo réside dans la transparence du système où les interactions qui ne peuvent être vus in vivo en raison des limites des techniques d'imagerie peuvent être facilement disséquées. Le système FrP fournit un support pour une manipulation facile des composants tout en maintenant la composition globale des tissus, permettant ainsi aux chercheurs de disséquer les mécanismes moléculaires à l'étude. En outre, le système RBM a été validé comme un moyen rentable, par rapport à des tests in vivo, de mener des études précliniques de nouveaux produits thérapeutiques 8,12. Pris ensemble, le modèle FrP fournit un système dans lequel de nombreux aspects de la biologie des tissus peuvent être étudiés en utilisant des échantillons ex vivo primaires.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions des Instituts nationaux de la santé, Institut national du cancer (1R21CA141039), BD Biosciences Subvention de recherche, la subvention de la Société américaine du cancer recherche institutionnelle (IRG # 58-006-53), au Centre de l'Université de Purdue pour le cancer recherche, et les Instituts du programme Initiatives de recherche Alberta Cancer Board de recherche en santé du Canada. MP a été soutenu par le National Institutes of Health, National Cancer Institute, Programme de stages de prévention du cancer (R25CA128770; PI: D. Teegarden) administré par le Centre des sciences oncologique et le Centre de recherche Discovery Learning à l'Université Purdue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
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