Summary
في طرق الثقافة القياسية تؤخذ خلايا من بيئتهم الفسيولوجية ونمت على سطح البلاستيك من صحن. لدراسة سلوك خلايا نخاع العظام البشرية الأولية أنشأنا نظام الثقافة 3-D حيث تزرع الخلايا تحت الظروف تلخص المكروية مواطن من الأنسجة.
Abstract
وقد تم زراعة الأنسجة أداة لا تقدر بثمن لدراسة جوانب كثيرة من وظيفة الخلية، من التطور الطبيعي للمرض. طرق زراعة الخلايا التقليدية تعتمد على قدرة الخلايا إما أن نعلق على التحتية الصلبة من صحن زراعة الأنسجة أو أن تنمو في تعليق في وسط سائل. وقد تم إنشاء خطوط الخلايا الخالد متعددة ونمت باستخدام هذه النهج، ومع ذلك، تفشل هذه الأساليب في كثير من الأحيان عندما تحتاج الخلايا الأولية التي يمكن زراعتها خارج الحي. ويعزى هذا الفشل إلى عدم وجود مكونات المصفوفة خارج الخلية المناسبة من الأنسجة المكروية من النظم القياسية حيث يتم استخدام البلاستيك زراعة الأنسجة كسطح لنمو الخلايا. المصفوفة خارج الخلية هو جزء لا يتجزأ من النسيج المكروية وجودها أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوظائف الفسيولوجية مثل الاستقطاب الخلية، والبقاء على قيد الحياة، وانتشار الأسلحة النووية. هنا نقدم الأنسجة 3 الابعاد طريقة ثقافة حيث نخاع العظم الأولية سلوتزرع ليرة سورية في المصفوفة خارج الخلية وضعت لألخص المكروية من العظام البشرية (نظام الإدارة القائمة على النتائج). جزءا لا يتجزأ في المصفوفة خارج الخلية، يتم تزويد الخلايا مع المواد المغذية من خلال وسيلة تستكمل مع البلازما البشرية، وبالتالي توفير نظام شامل حيث يمكن أن يستمر بقاء الخلية والانتشار لمدة تصل إلى 30 يوما مع الحفاظ على التركيبة الخلوية من النسيج الأساسي. باستخدام نظام الإدارة القائمة على النتائج لقد نمت بنجاح خلايا نخاع العظام الأولية من المانحين العادية والمرضى الذين يعانون من الداء النشواني، ومختلف الأورام الخبيثة الدموية. يسمح نظام الإدارة القائمة على النتائج لالمباشر، في مصفوفة التصور في الوقت الحقيقي من سلوك الخلية وتقييم فعالية قبل السريرية من علاجات جديدة. علاوة على ذلك، يمكن عزل الخلايا من الإدارة القائمة على النتائج في وقت لاحق واستخدامها لزرع في الجسم الحي، الفرز الخلية، والتدفق الخلوي، وتحليل الحمض النووي والبروتينات. أخذت معا، ويوفر طريقة RBM نظام موثوق لنمو العظام الأولية ماروث الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية.
Introduction
وقد تم تطوير زراعة الأنسجة لدراسة سلوك الخلية في بيئة تسيطر عليها للحد من التباين المنهجي عند مقارنة العمليات المختلفة في الكائنات سليمة. تأسست هذه الطريقة لأول مرة في أوائل عام 1900 1،2 ويشير إلى تقنية حيث كانت إإكسبلنتس الأنسجة مثقف فيفو السابقين في طبق زجاجي. في منتصف 1900s تم تعديل النظام لتنمو الخلايا المتفرقة بدلا من شظايا الأنسجة سليمة، وأصبح "زراعة الأنسجة" ومصطلح "ثقافة الخلية مرادفا 3. في مثل هذه الأنظمة زراعة الخلايا التقليدية تزرع الخلايا على سطح البلاستيك زراعة الأنسجة مضافين مع متوسط النمو تستكمل مع عوامل النمو المختلفة. ظهرت نوعين من الثقافات على أساس قدرة التصاق الخلايا المختلفة: زراعة الخلايا الملتصقة، حيث تعلق الخلايا وتنتشر على البلاستيك زراعة الأنسجة والثقافات غير ملتصق، حيث يتم نشر الخلايا في التعليق. منذ الأيام الأولى للخليةوقد تم إنشاء والثقافة، ومتعددة خطوط الخلايا الخالدة، مثل هيلا 4، وأول خط الخلايا السرطانية البشرية. هذه خطوط الخلايا لديها القدرة على التكاثر إلى ما لا نهاية في خلية ثقافة، ومعظمها لا تتطلب أي معاملة خاصة للحفاظ على قدرتها على البقاء.
وقد تم تصميم المنهج الاختزالي الطرق الثقافة الخلية الأصلية إلى تبسيط النظام قدر الإمكان من قبل بما في ذلك المكونات فقط الحد الأدنى المطلوب للحفاظ على بقاء الخلية والانتشار. ومع ذلك، تفشل تبسيط النهج زراعة الخلايا لدعم فيفو السابقين معظم أنواع الخلايا البشرية الأولية مع المتناهي فترة الحياة. لذلك، يجري تصميم نظم ثقافة جديدة لتقريب المكروية الأنسجة بأكبر قدر ممكن، وبالتالي السماح إإكسبلنتس الخلايا أن تنمو في ظل الظروف الفسيولوجية. وعلى النقيض من التقليدية / الاختزالية النهج ثقافة الخلية، 3 الأبعاد (3-D) ونظم الثقافة أصبحت الآن الأسلوب المفضل لثقافة مختلفة بكفاءةخطوط الخلايا البشرية والخلايا الأولية لدراسة الآليات التي تشارك لاحقا في الصحة والمرض، في سياق المكروية داعمة. عادة ما يتم تعيين هذه النظم 3-D حتى باستخدام المصفوفات أعيد بناؤها و / أو متوسطة تستكمل مع عوامل النمو، من أجل ألخص المكروية الأنسجة لدراسة أنواع الخلايا في المصالح. وقد وضعت أول هذه 3 الأبعاد (3-D) نماذج الثقافة لدراسة التنمية الغدة الثديية. لتوفير الخلايا مع الظروف المحلية وجزءا لا يتجزأ من الخلايا الظهارية الثديية في Matrigel، والكولاجين الرابع ومصدر laminin غنية من المصفوفة خارج الخلية (ECM)، ومضافين مع النمو المتوسط. في ظل هذه الظروف، فإن الخلايا الظهارية الثديية شكلت مجموعات تشبه عنيبات الثديية، وعلى التحفيز مع الهرمونات المولد للبن، وهذه عنيبات يفرز الكازين، وبروتينات الحليب الأخرى، في lumena جوفاء من هياكل مثل عنيبات. لم يكن لوحظ إفراز الكازين في الثقافات القياسية حتى بعد إضافة البرولاكتين 5، مزيد من التأكيد على دور المكروية في الحفاظ على الخصائص المورفولوجية والمظهري من الخلايا. دليل آخر على فقدان وظيفة الخلوية العادية عندما تؤخذ خلايا من سياق المكروية بهم الفسيولوجية هو أن مظاهرة دون المكروية داعمة، تفشل الخلايا الكيراتينية لتشكيل البشرة طبقية 6. وقد تم إنشاء عدد من النماذج الأخرى 3-D للسماح فيفو السابقين انتشار الخلايا الأولية 7،8.
وقد تجلى الدور الحاسم للالمكروية في سلوك الخلية ذكية في دراسة الخلايا الظهارية الثديية حيث شكلت "من الداخل إلى الخارج" عنيبات عند تربيتها في الكولاجين أنا المصفوفة، مقارنة عنيبات الاستقطاب بشكل صحيح التي تشكلت في Matrigel. وقد عادت هذه الخسارة من التشكل الصحيح عندما أضيفت خلايا عضلية ظهارية المنتجة laminin على ثقافات الكولاجين أنا 9. علاوة على ذلك، مطلوب المكروية الصحيح للدقيقةراثى مظهر. نمت في طبق، وسرطان الخلايا MCF7 الثدي transfected مع لخلية خلية التصاق جزيء CEACAM1 تتصرف بالضبط نفس الخلايا السلبية CEACAM untransfected. ومع ذلك، عند تربيتها في Matrigel، في اتصال مع ECM، شكل wildtype MCF7 هياكل تشبه الورم في حين أن الخلايا MCF7 transfected مع CEACAM1 العودة إلى النمط الظاهري والنموذج العادي عنيبات مع lumena جوفاء، كما أنشئت مع غير خبيثة ظهارة الثديية 10. وبالمثل، حظر في خلايا سرطان الثدي إنتغرين β1 لا يغير سلوكهم في ظل ظروف ثقافة القياسية، ولكن نفس التجربة التي أجريت في الثقافات 3-D يوضح أن حجب β1-إنتغرين يعود الخلايا الخبيثة إلى النمط الظاهري العادي 11. وبالتالي، ليس مطلوبا المكروية الأنسجة فقط للحفاظ على بقاء الخلية، ولكن أيضا للاحتفاظ ظيفة الخلايا السليمة.
بالإضافة إلى توفير نظام حيث يمكن دراسة سلوك الخلية تحت ظروف فسيولوجيةق والثقافات 3-D بشكل المتوسطة وقوية وموثوق بها للاختبار قبل السريرية لعلاجات جديدة 8،12،13. زراعة خلايا في 3-D يسمح فحص مجمعات الفحص في ظل ظروف البيئة بوساطة العقاقير المقاومة 14، حيث يمكن تقييم مساهمة خلية خلية وخلية التصاق ECM. علاوة على ذلك، بعيدا عن الهدف سمية مركبات جديدة يمكن التأكد من خلال دمج مقصورات الخلوية متعددة من الأنسجة المختلفة. هذه الشاشات يمكن أن يؤديها بسرعة أكبر وأكثر من الدراسات المماثلة في الجسم الحي 8 فعالة من حيث التكلفة.
هنا نقدم الإعداد لنموذج 3-D من نخاع العظام أعيد بناؤها (RBM) حيث تتكاثر العادية والخبيثة نخاع العظم (BM) الخلايا فيفو السابقين في نظام محاكاة عن كثب المكروية من BM الإنسان. المحاولات السابقة في تزايد الخلايا الأولية BM الإنسان في الثقافات 2-D، سائلة أو cocultures ملتصقة مع مختلف مكونات BM سدى، أو 3-D، وقد اجتمع الثقافات أجار شبه صلبة مع نجاح محدود نظرا لعدم قدرتها على تزويد الخلايا التي تحتوي على مكونات الأنسجة المكروية 15-18. في هذه النظم زيارتها الخلايا الأولية BM الفقراء جدوى وفشلت في الانتشار خارج الحي. نظام آخر حيث تزرع الخلايا الاصلية BM الإنسان في cocultures كروي مع الخلايا اللحمية BM هو نظام 3-D حيث أصيب بقاء الخلية الجذعية المكونة للدم وانتشار لمدة 96 ساعة على الأقل 19. ومع ذلك، على الرغم مفيد للغاية لفهم السلف الأحياء المكونة للدم، وهذا النظام لا ألخص بأمانة المكروية من BM نظرا لعدم وجود مكونات ECM، وبالتالي، يحد من فائدته. نموذج الإدارة القائمة على النتائج الموضحة هنا يقدم نظاما شاملا حيث يتم بناؤها على حد سواء مقصورات الخلوية وخارج الخلية من BM الإنسان في المختبر. وتبين لنا أن الثقافات الإدارة القائمة على النتائج يمكن أن تدعم فيفو السابقين نمو الخلايا BM الإنسان العادي، ونحنليرة لبنانية باسم خلايا معزولة من المرضى الذين يعانون من مختلف الاضطرابات الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحضير مسبقا
- الحفاظ على ماصات المصلية العقيمة ونصائح ماصة في 4 درجات مئوية.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: المواد الهلامية Matrigel في درجة حرارة الغرفة (RT)، وسوف تستخدم ماصات الباردة ونصائح منع Matrigel من التبلور أثناء الإعداد الثقافة. - ذوبان الجليد زجاجة من Matrigel في 4 درجات مئوية خلال الليل.
2. إعداد الكواشف
- إعداد محلول المخزون فبرونيكتين: إصنع 1 ملغ / مل محلول المخزون من فبرونيكتين عن طريق إذابة 100 ملغ فبرونيكتين الإنسان في 100 مل من الماء المقطر. مرة واحدة وقد حل فبرونيكتين، فلتر عقيمة، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إذا لم فبرونيكتين تذوب بسرعة احتضان الحل لبضع في مجموعة حمام مائي دقيقة عند 37 درجة مئوية. - إعداد 10X PBS: ذوب 80 جم كلوريد الصوديوم كلوريد الصوديوم، 14.4 ز نا 2 هبو 4، 2 ز بوكل و 2.4 غ KH 2 PO
- إعداد تحييد العازلة 20: جعل محلول يحتوي على 100 ملي HEPES في الفوسفات 2X المالحة (PBS) مخزنة باستخدام 1 M HEPES و 10x PBS حلول الأسهم. ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل إلى 7.0. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أشهر.
- إعداد الحل 2 ملغ / مل من ذيل فأر نوع الكولاجين أنا: جعل حل 2 ملغ / مل الكولاجين أنا في المخزن المؤقت تحييد (الخطوة 2.3). دوامة الحل بسرعة منخفضة والمزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. لأن هذا الكولاجين هو لزج جدا، وتجنب توليد فقاعات الهواء في حين pipetting ل. فمن المستحسن أن يعد الحل الأول الكولاجين جديدة في كل مرة. الحفاظ على الحل على الجليد حتى الاستخدام.
- إعداد طلاء بطانة العظم (رند): اخلطي 1 ملغ / مل الأسهم فبرونيكتين مع 2 ملغ / مل الكولاجين أنا الاسهم (الخطوات 2.1 و 2.4) إلى تركيز النهائي من 77 ميكروغرام / مل و 29 ميكروغرام / مل على التوالي، في 1X و# 160؛ برنامج تلفزيوني العقيمة. خلط وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
- إعداد مصفوفة العظام أعيد بناؤها (RBM):
- Precool 1.5 مل أنابيب microcentrifuge على الجليد. إبقاء جميع الحلول مصفوفة على الجليد في جميع الأوقات.
- خلط 4 أجزاء Matrigel (تركيز Matrigel يختلف من الكثير إلى الكثير، ولكن تم العثور على اختلافات لا تذكر)، 2.5 أجزاء من 1 ملغ / مل فبرونيكتين و1 جزءا من 2 ملغ / مل الكولاجين أنا على الجليد من قبل pipetting الأولى في Matrigel الأنبوب باستخدام ماصة نصائح الباردة ثم قم بإضافة فبرونيكتين والكولاجين أولا سيبدأ Matrigel ترسيخ في درجات الحرارة فوق 4 درجات مئوية، لذلك العمل بسرعة في حين pipetting لMatrigel. مزيج من مصفوفة بلطف شديد من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتجنب إدخال فقاعات. إبقاء الأنابيب على الجليد في حين خلط الإدارة القائمة على النتائج.
- إعداد نخاع العظم متوسطة النمو (BMGM): جعل 500 مل من BMGM تحتوي على 6.2 × 10 -4 M و CaCl 2، 10 -6 M سكسينات الصوديوم، 10 -6 M الهيدروكورتيزون، البلازما البشرية 20٪ (طبيعية أو الخبيثة التي تم جمعها من المتبرعين الأصحاء أو المرضى)، و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين في RPMI-1640. و CaCl 2، سكسينات الصوديوم، والمكملات الهيدروكورتيزون يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 6> أشهر 1،000 الحلول الأسهم السينية. عندما ينمو خطوط الخلايا، مصل بقري جنيني (FBS) يمكن أن تكون بديلا لبلازما الإنسان.
- إعداد 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة (NBF): إضافة 37٪ محلول الفورمالديهايد الأسهم لبرنامج تلفزيوني 1X بنسبة 10٪ الخامس / ضد تخلط جيدا وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أسابيع محمية من الضوء.
- إعداد 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA): وزن كمية مناسبة من جيش صرب البوسنة وحلها في برنامج تلفزيوني 1X. تخزينها في 4 درجة مئوية وتستخدم في حدود 1 في الاسبوع. حل جيش صرب البوسنة يميل إلى الحصول على الملوثة إذا ما واصلت المبردة لفترات أطول. بدلا من ذلك، يمكن حل جيش صرب البوسنة aliquoted والمجمدة في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. تجنب تجميد أذاب دورات.
- إعداد الحل الانتعاش الخلية (CRS): جعل 5 ملم EDTA، 1 ملم فانادات الصوديوم (نا <الفرعية> 3 VO 4) و 1.5 ملي فلوريد الصوديوم (ناف) الحل في برنامج تلفزيوني 1X. تصفية العقيمة وتخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى 6 أشهر.
3. جزءا لا يتجزأ من 3-D ثقافة خلايا BM الإنسان غير خبيثة والخبيثة
- تنقية الخلايا وحيدات النوى BM الابتدائي بحلول Ficoll-البلاك التدرج الطرد المركزي في تعليمات الشركة الصانعة.
خطوة اختيارية: الخلايا يمكن أن توصف مع 0.25 ميكرومتر carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات، succinimidyl استر (CFSE) في تعليمات الشركة الصانعة لمتابعة انتشار الخلايا طوال فترة الثقافة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إذا الخلايا تموت بعد CFSE تلوين، يعاير كمية CFSE كما تركيز يعتمد على نوع من الخلايا؛ 0.25 ميكرومتر يعمل بشكل جيد للخلايا وحيدات النوى BM الأولية. - إضافة 65 ميكرولتر من الحل رند في كل بئر من زراعة الأنسجة المعالجة وحة 48 جيدا. نشر الحل بالتساوي لتغطية كامل سطح البئر واحتضان لمدة> 30دقيقة في RT.
- إعداد تعليق خلية في مناطق ذات كثافة من 0.5 × 10 6 خلايا في 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X لكل بئر من لوحة 48 جيدا. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مزيج تعليق خلية مع 100 ميكرولتر من الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة لكل بئر. مزيج من الخلايا والإدارة القائمة على النتائج مصفوفة من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا، وتجنب إدخال فقاعات. الحفاظ على خليط الخلية / مصفوفة على الجليد لتجنب التبلور من المصفوفة.
ملاحظة: نظام الإدارة القائمة على النتائج غير قابلة تماما؛ لاقامة نظام في شكل غير 48 بشكل جيد، وضبط كميات من جميع الكواشف (المصفوفات والمتوسطة) على أساس المساحة السطحية للوحة المستخدمة. تسلق عدد من الخلايا لتكون مطلية تبعا لذلك. - نضح رند المتبقية وإضافة خليط الخلية / مصفوفة في وسط البئر. بسرعة، وانتشار الخليط خلية / مصفوفة لتغطية كامل سطح البئر بالتساوي. وضع لوحة لمدة 30-60 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة زراعة الأنسجة للسماح للمصفوفة لترسيخ. لا تهزه أو ديسTURB لوحة أثناء الحضانة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: لمنع التوزيع غير المتكافئ للخلايا في الإدارة القائمة على النتائج، وتخلط جيدا قبل الطلاء. خلط بعد كل 5 عشر مطلي جيدا لتجنب الخلايا تسوية في الجزء السفلي من الأنبوب. مرة واحدة مطلية بالذهب، والخلايا لا تنزل الى قاع البئر إلى السطح بسبب التوتر في المصفوفة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: لمنع التوزيع غير المتكافئ للخلايا في الإدارة القائمة على النتائج، وتخلط جيدا قبل الطلاء. خلط بعد كل 5 عشر مطلي جيدا لتجنب الخلايا تسوية في الجزء السفلي من الأنبوب. مرة واحدة مطلية بالذهب، والخلايا لا تنزل الى قاع البئر إلى السطح بسبب التوتر في المصفوفة. - Prewarm BMGM في حمام مائي تعيين إلى 37 درجة مئوية.
- بعد 30 دقيقة، تحقق لمعرفة أن مصفوفة وضعت بشكل صحيح، وسوف تشكل مادة هلامية لينة مثل الطبقة التي لا تتحرك عند إمالة لوحة. تراكب طبقة الخلايا / مصفوفة مع 1 مل من الحارة BMGM. لتجنب تمزق ماصة مصفوفة المدى المتوسط بلطف جدا (الاستغناء عن قطرة تلو قطرة) باستخدامماصة المصلية. وضع ثقافة الإدارة القائمة على النتائج تجميعها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة زراعة الأنسجة والثقافة للفترة الزمنية المطلوبة.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ بقاء الخلية لمدة 30 يوما على الأقل دون تغيير المتوسطة، وإذا كان مطلوب تغيير المتوسطة فقط تغيير 50٪ من المتوسط في كل مرة.
خطوة حاسمة: ومن الأهمية بمكان أن الوسيلة ليست باردة كما درجات الحرارة الباردة قد يزعج بالفعل تعيين المصفوفة. والحرص على عدم بخ المتوسطة على رأس المصفوفة على أنه قد كسر طبقة مصفوفة لينة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إذا بقاء الخلية في نظام الإدارة القائمة على النتائج منخفضة، قد يكون كثافة الخلية يتحدد تجريبيا عند العمل مع الخلايا الأخرى من خلايا وحيدة النواة الأولية من حرف هاء BM. عند العمل مع خطوط الخلايا، وانخفاض عدد الخلايا 10 أضعاف، وخطوط الخلايا خلد تتكاثر بشكل أسرع من الخلايا الأولية.
4. 'في مصفوفة' التصوير
- صورة الخلايا المستزرعة في الإدارة القائمة على النتائج مباشرة باستخدام الحقل مشرق، وعلى النقيض تدخل الفرق (DIC)، متحد البؤر أو أي تقنيات التصوير الأخرى التي تسمح التصوير لمسافات طويلة مثل المصفوفة هو حوالي 1 مم. استخدام ميزة Z-كومة متاح في العديد من المجاهر لصورة ثقافة كاملة من أعلى إلى أسفل.
نصيحة: للحصول على بروتوكول المناعية أدناه تجنب الشفط حلول تلطيخ / الغسيل، وبدلا من ذلك إمالة لوحة وإزالة الحلول باستخدام ماصة.
- إزالة BMGM باستخدام ماصة ويغسل 2-3X مع 100 ميكرولتر / غسل / بئر RT برنامج تلفزيوني 1X. تأكد من أن يكفي PBS يستخدم لتغطية كامل سطح البئر.
- إصلاح الخلايا في المصفوفة بإضافة 100 ميكرولتر / جيد (لوحة 48 أيضا) 10٪ بنك الفجيرة الوطني لمدة 15 دقيقة في RT. إزالة بنك الفجيرة الوطني وغسل الخلايا مرتين مع 100 ميكرولتر / غسل / بئر RT برنامج تلفزيوني 1X.
مذكرة: تجنب استخدام بنك الفجيرة الوطني الباردة كما قد تسييل المصفوفة. - إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 1٪ BSA لمدة 1 ساعة على RT أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل من أجل منع ملزم غير محدد من الأجسام المضادة.
- إعداد الحل الضد الأولية في 1٪ BSA في التخفيف المطلوبة. سوف التخفيف تختلف عن كل الأضداد، يرجى مراجعة الشركة المنتجة أو يعاير لتحديد تركيز الأجسام المضادة الأمثل. إضافة 100 ميكرولتر / جيد من محلول الأجسام المضادة الأولية واحتضان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
خطوة حاسمة: جميع حضانات تنطوي على الأجسام المضادة مترافق إلى fluorophores أو الأصباغ الفلورية يجب أن يؤديها في الظلام. - إزالة حل الأجسام المضادة الأولية وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
- لتلطيخ المناعي غير المباشر، واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى التحقيق الفلورسنت لمدة 1 ساعة على RT. تمييع الأجسام المضادة في 1٪ BSA في تركيز المقترح من قبل المصنع.
- إزالة ثانويالحل ntibody وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: لتجنب خلفية عالية أثناء التصوير، وعاير الأجسام المضادة الثانوية مترافق fluorescently واستخدام أقل تركيز توفر إشارة كافية. إذا خلفية عالية ولا تزال مسألة، وزيادة عدد ومدة خطوات الغسيل، أو استخدام الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة، وتخطي الخطوة 4.2.6. - وصمة عار على النوى إضافة 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) حل تلطيخ النووية، في التخفيف المقترح من قبل المصنع، واحتضان لمدة 7-10 دقيقة في RT.
- إزالة حل تلطيخ النووية وغسل 2X مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
- إزالة برنامج تلفزيوني من غسل الماضي وإضافة قطرة من تصاعد المتوسطة (مجموعة العادية)، على عينة للحفاظ على مضان. الصورة باستخدام إعدادات الإثارة / الانبعاثات المناسبة على المجهر الفلورسنت أو متحد البؤر.
ملاحظة: يجب أن يتم التصوير في غضون أيام 2 تلطيخلتجنب تدهور المصفوفة وفقدان النزاهة الإدارة القائمة على النتائج وفقدان إشارة الفلورسنت. إن لم يكن تصويرها على الفور، وينبغي أن تظل عينات الملون في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، حتى التصوير.
5. عزل خلايا من الإدارة القائمة على النتائج
- إزالة المتوسطة بلطف من دون إزعاج طبقة المصفوفة. لا نضح.
- خلايا غسل 2X مع برنامج تلفزيوني 1X العقيمة. لا نضح.
- إضافة 0.5 مل من الجليد الباردة CRS إلى كل بئر وإزالة طبقة المصفوفة بأكملها جنبا إلى جنب مع الخلايا، من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا. جمع الخلايا، مصفوفة، وCRS في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. وضع على الجليد.
- إضافة مبلغ إضافي قدره 0.5 مل CRS لنفس البئر وجمع كل المواد المتبقية. نقل إلى نفس أنبوب microcentrifuge.
- دوامة خليط من الخلايا، مصفوفة، وCRS واحتضان على الجليد لمدة 1HR. خلايا دوامة كل 15 دقيقة لتسهيل الإفراج عن المصفوفة.
- تحقق الخليط بعد 1 ساعة، عدم وجود كتل واضحةمن المصفوفة يجب أن تكون موجودة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إذا كتل من المصفوفة لا تزال مرئية بعد 1 ساعة، وخلايا نقل / مصفوفة / CRS الخليط إلى أنبوب أكبر، إضافة إضافية 2-5 مل من CRS، واحتضان ل30-60 دقيقة إضافية. - خلايا الطرد المركزي في CRS في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X الباردة.
- أجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقائق وإزالة طاف. تكرار غسل PBS احد مزيد من الوقت.
- اكتمال يغسل PBS الثاني على الانتعاش من الخلايا من مصفوفة وخلايا معزولة يمكن استخدامها لأي طلبات المصب مثل DNA / RNA / البروتين العزلة، والتدفق الخلوي، زرع في الجسم الحي، الخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
منذ خلايا نخاع العظام الأولية تفشل لتتكاثر في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية، تم إنشاء نظام الإدارة القائمة على النتائج لتقليد عن كثب المكروية العظام، وتوفير نظام للثقافة وتوسيع الخلايا BM فيفو السابقين. أدمجت مكونات رئيسية من المصفوفة خارج الخلية BM، فبرونيكتين، والكولاجين الأول، الكولاجين الرابع، وlaminin 21، في الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة لتوفير سقالة هيكلية لهذه الثقافة 3-D. السمحاق الداخلي المبطن للتجويف النخاعي، واجهة بين العظام وBM، غنية في الكولاجين الأول وفبرونيكتين، أعيد بناؤها بواسطة طلاء سطح طبق زراعة الأنسجة مع هذه البروتينات. الحديث المتبادل بين مقصورات الخلوية متعددة داخل BM يساهم في التوازن العام للأنسجة. لضمان ترك أن أيا من المكونات الخلوية خارج، تم تعيين ثقافة الإدارة القائمة على النتائج حتى باستخدام خلايا وحيدات النوى غير المجزأ من BM الخزعات إبرة نضح الإنسان. لضمان أن يتم توفير النظام مع الهرمونات، عوامل النمو، ود السيتوكينات موجودة في البيئة في الدورة الدموية، واستكملت مستنبت مع البلازما البشرية الموافق العينة التي يجري تربيتها (أي تم إضافة البلازما من المانحين العادية عندما وضعت الخلايا BM غير خبيثة في الإدارة القائمة على النتائج، في حين تم إضافة البلازما من المرضى إلى ثقافات الخبيثة خلايا) (الشكل 1).
BM وعينات الدم من المتبرعين الأصحاء والمرضى الذين يعانون جمعت مختلف سرطانات الدم بعد موافقة من جامعة بوردو وجامعة ألبرتا المؤسسية لوحات البحوث وبعد الموافقة المسبقة الخطية وفقا لإعلان هلسنكي (الجدول 1). الخلايا وحيدات النوى معزولة عن الخزعات BM تتكاثر والحفاظ على قدرتها على الاستمرار في نظام الإدارة القائمة على النتائج لمدة تصل إلى 30 يوما (الشكل 2). وقد تم تحديد تركيز خلية من 0.5 × 10 6 cells/100μl الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة لتكون الكثافة المثلى للخلايا BM الأولية. تتجاوز ثيق كثافة overcrowds نظام خفض معدلات بقاء الخلية والانتشار مع مرور الوقت. وقد تبين أيضا وأقل كثافة أن يكون ضارا الصحية الشاملة للنظام كما أثبتت الاتصالات خلية خلية حيوية لنمو الخلايا قوية. النمو داخل الإدارة القائمة على النتائج يمكن اتباعها بعد وصفها الخلايا مع ثنائي الأسيتات carboxyfluorescein، استر succinimidyl (CFSE). كثافة مضان CFSE نصفين مع كل انقسام الخلايا، وبالتالي يمكن تتبع تكاثر الخلايا بواسطة المجهر أو التدفق الخلوي مع مرور الوقت. وعلاوة على ذلك، يتم الاحتفاظ المقصورات الخلوية داخل ثقافة الإدارة القائمة على النتائج في نفس النسب كما كانت موجودة في عينات الخزعة 8. بالإضافة إلى الخلايا المكونة للدم من الأنساب، مقصورات اللحمية تظهر نموا قويا في الإدارة القائمة على النتائج. الفوسفاتيز القلوي معربا عن بانيات قادرة على الكالسيوم التمعدن، طرطرات مقاومة الخلايا الآكلة حمض الفوسفاتيز تلطيخ والنفط الخلايا الشحمية إيجابية الأحمر، وفبرونيكتين إنتاج الخلايا اللحمية وجدت في السمحاق الداخلي المبطن للتجويف النخاعي/ واجهة BM من نظام الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 3).
أخذت معا، وإظهار البيانات المتوفرة لدينا أن نموذج الإدارة القائمة على النتائج يوفر أول نظام فيفو السابقين حيث الخلايا BM الإنسان الأساسية من المتبرعين الأصحاء والمرضى الذين يعانون من مختلف الأورام الخبيثة مثل سرطان الدم الدم، والأورام اللمفاوية، والمايلوما المتعددة يمكن أن يستمر وتوسعت لمدة تصل إلى 30 يوما. توفر الإدارة القائمة على النتائج نموذج شامل لدراسة سلوك الخلية في ظل الظروف الفسيولوجية في سياق BM المكروية الأصلية. وقد استخدم هذا النظام من قبل المختبر لدينا لتحديد النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية المايلوما المتعددة ودراسة التفاعلات بين الخلايا الخبيثة وخارج الخلية مصفوفة BM فضلا عن الحديث المتبادل بين الخلايا الخبيثة وBM سدى.
| التشخيص | نوع من الخلايا | بقاء | |
| غير خبيثة | BM | معتدل | معتدل |
| الداء النشواني | BM | ارتفاع | ارتفاع |
| اعتلال غامائي وحيدة النسيلة من أهمية غير محدد | BM | ارتفاع | ارتفاع |
| PBMC | لا | لا | |
| البلازماويات | BM | ارتفاع | ارتفاع |
| المشتعلة المايلوما المتعددة | BM | ارتفاع | ارتفاع |
| المايلوما المتعددة | BM | ارتفاع | ارتفاع |
| PBMC | لا | لا | |
| MB | ارتفاع | ارتفاع | |
| وكيميا الخلايا البلازما | BM | ارتفاع | ارتفاع |
| Waldenstroms macroglobulenemia | BM | HIGح | ارتفاع |
| ابيضاض الدم النقوي الحاد | BM | ارتفاع | ارتفاع |
| اللوكيميا الحادة | BM | ارتفاع | ارتفاع |
| PBMC | لا | لا | |
| سرطان الدم الليمفاوي الحاد | BM | معتدل | معتدل |
| ابيضاض الدم النقوي المزمن | BM | معتدل | ارتفاع |
| سرطان الدم الليمفاوي المزمن | BM | منخفض | بطيء |
| PBMC | لا | لا | |
| سرطان الغدد الليمفاوية غير هودجكين | BM | معتدل | بطيء |
| PBMC | لا | لا |
الجدول 1. البقاء على قيد الحياة وانتشار مختلف العينات تربيتها في الإدارة القائمة على النتائج. نخاع العظم مononuclear الخلايا (BM)، وكانت الخلايا المحيطية وحيدات النوى الدم (PBMC)، أو عينات الدم تعبئة (MB) من المتبرعين الأصحاء والمرضى الذين شخصت مع مختلف الأورام الخبيثة مثقف في الإدارة القائمة على النتائج. يسرد الجدول جميع أنواع العينات التي كانت تربيتها في الإدارة القائمة على النتائج جنبا إلى جنب مع نوع من الخلايا (أي BM، PBMC، أو MB). لاحظت مدى بقاء الخلية والانتشار في الإدارة القائمة على النتائج. بينما BM MB وتظهر نموا قويا في الإدارة القائمة على النتائج، وPBMCs المعزولة من المرضى الذين يعانون من مختلف الأورام الخبيثة غير قابلة للتطبيق في الإدارة القائمة على النتائج.
الشكل 1. . التمثيل التخطيطي من الإعداد الإدارة القائمة على النتائج وتتألف الإدارة القائمة على النتائج من مرحلتين: 1) طلاء بطانة العظم (فبرونيكتين، والكولاجين الأول (CI)) و 2) مصفوفة الإدارة القائمة على النتائج (فبرونيكتين، والكولاجين الأول (CI)، والكولاجين الرابع (CIV) وlaminin) ملاحظة. : الكولاجين الرابع وlaminin هي ممكونات ajor من Matrigel، وبالتالي ليس هناك حاجة إلى ذلك منفصلة من هذه البروتينات. يتم تعيين هذه المراحل حتى في خطوتين عن طريق تتراكب الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة / خليط الخلية على الجزء العلوي من طبقة رقيقة من مصفوفة بطانة العظم. لمتابعة انتشار الخلايا مع مرور الوقت، يمكن أن الخلايا المسمى مع CFSE قبل الاختلاط مع مصفوفة الإدارة القائمة على النتائج. خلال مدة من الثقافة، والخلايا يمكن تصور بواسطة المجهر ويمكن أن يتبع الهجرة الخلية في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر مجهزة درجة الحرارة / CO 2 غرفة التحكم. بعد 14-30 يوما في الخلايا الثقافة يمكن أن تكون معزولة عن مصفوفة ويتعرض لمجموعة متنوعة من التحليلات المصب، بما في ذلك على حد سواء في التجارب المختبرية والإجراءات الجسم الحي. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. دوام الفصل الذاتي من المقصورات الخلوية في الإدارة القائمة على النتائج. كانت تزرع الخلايا BM في الإدارة القائمة على النتائج لعدد من الأيام المشار إليها. العناصر اللحمية تصبح واضحة بعد يوم 14، ولكن يمكن أن يتم الكشف عن أقرب وقت اليوم 5 في الإدارة القائمة على النتائج. يمكن على مدى الفترة الخلايا الثقافة أن ينظر إليها من خلال الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة المهاجرة وتجميع في مجموعات متميزة. جماهير الخلايا الخبيثة توسيع بمرور الوقت (مقارنة أحجام الكتلة بين يوم 9-30). تم القبض على عرض ممثل الثقافة في كل نقطة زمنية باستخدام المجهر مشرق الميدان على مجهر مقلوب (التكبير: 200X). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. مقصورات اللحمية هي 'الموردة' داخل الإدارة القائمة على النتائج. لتقييم تكوين المكونات اللحمية التي تتفوق في الإدارة القائمة على النتائج، وجرى تقييم الخلايا في الانتقال بين الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة وطلاء بطانة العظم للمورفولوجيا الخلايا الليفية، بناء العظم، خلية شحمية، وناقضة العظم محددة وعلامة التعبير (أ) للكشف عن الخلايا الليفية، وكانت ملطخة الخلايا لفبرونيكتين (الأخضر)، الأكتين (الحمراء)، ونوى (الازرق) وتصويرها على المجهر متحد البؤر (التكبير: 200X). (ب) عرضت الخلايا اللحمية مع التشكل لتكون وقد تم تحديد preosteoblasts مع مستويات عالية من النشاط الفوسفاتيز القلوية (B.1) وقادرة على التمعدن الكالسيوم على النحو الذي يحدده الصبغ الأحمر الأحمر تلطيخ (B.2). (ج) خلايا مع وجود واضح من قطرات الدهون كما الخلايا الشحمية يعتمد على تلطيخ إيجابية مع واعترف النفط الأحمر (C.1). (د) خلايا متعددة الأنوية مع عرضية كما العلاقات العامةكانت eosteoclasts وإيجابية لمقاومة حمض الفوسفاتيز tartarate (فخ) (D.1). حقل مشرق واللون تم الحصول عليها (nonfluorescent) الصور على مجهر مقلوب مجهزة بكاميرا اللون (التكبير: 200X). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر نموذج الإدارة القائمة على النتائج نظاما شاملا حيث يتم الاحتفاظ تكوين الخلوية من BM فيفو السابقين لمدة تصل إلى 30 يوما. BM الخلايا المزروعة في الإدارة القائمة على النتائج الذاتي تطبق وفقا لوظيفتها محاكاة عن كثب العمارة BM جدت في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، وهذا هو أول نظام يسمح للتوسع في المايلوما المتعددة استنساخ 8. أهم الخطوات الحاسمة لضمان نمو قوي من الخلايا BM والنجاح الشامل للثقافة هي: 1) للحصول على صحة السكان من الخلايا BM مع> 70٪ قابلية ومعظمها خالية من خلايا الدم الحمراء، 2) للتأكد من أن يتم خلط المكونات جيدا والمصفوفة التي يتم توزيعها الخلايا بشكل موحد في جميع أنحاء مصفوفة، و 3) إلى الحرص على عدم تلف مصفوفة عند إضافة النمو المتوسط إلى النظام. لضمان انتشار قوية من الخلايا الخبيثة، ينبغي أن تستكمل النمو المتوسطة مع البلازما البشرية مطابقة تشخيص المريض الذي يجري مثقف الخلايا. Oالحد من شمال شرق نظام الإدارة القائمة على النتائج التي لوحظ هو عدم قدرتها على دعم السكان تنقيته من CD34 + الخلايا الجذعية المكونة للدم، والخلايا CD20 + B، والخلايا CD138 + البلازما دون المقصورة اللحمية من BM.
نظام الإدارة القائمة على النتائج هي متعددة للغاية ويمكن تعديلها بطرق عديدة لتناسب أفضل أهداف دراسات محددة. يمكن إضافة مقصورة البطانية لنظام لمحاكاة الأوعية الدموية من BM ومكونات المصفوفة خارج الخلية إضافية يمكن توفيره لتحقيق تكوين مصفوفة في أقرب وقت ممكن لفي الجسم الحي الماكياج من BM وتركيزات مصفوفة يمكن تعديلها ل تعكس الحالات المرضية التي يكون فيها تركيزات مكونات المصفوفة الفردية يجوز تغيير 21. بالإضافة إلى زراعة الخلايا الأولية، ونظام الإدارة القائمة على النتائج هو مناسبة لcoculturing خطوط الخلايا المختلفة لدراسة التفاعلات خلية خلية بين السكان خلية معينة. على سبيل المثال، يمكن وضع هذا النظام باعتباره coculture حيث سدىومطلي الخلايا لتر خلال طلاء بطانة العظم، تضاف الخلايا المكونة للدم على أعلى من الخلايا اللحمية، ومضافين كامل coculture اللحمية / المكونة للدم الأولى مع مصفوفة الإدارة القائمة على النتائج وبعد ذلك مع متوسط النمو. من المفيد أيضا، يمكن أن يكون إدخال تعديلات على تركيبة المتوسطة لتشمل البلازما من مصادر مختلفة أو متوسطة مشروطة سدى لدراسة كيفية تأثير العوامل القابلة للذوبان سلوك الخلية 12. ويمكن أيضا السيتوكينات وعوامل النمو والهرمونات يمكن ان تضاف الى متوسطة النمو، ومع ذلك، ينبغي الحرص على عدم استبدال جميع المتوسطة النمو في الثقافة في آن واحد بوصفها عوامل إدامة النمو التي تم يفرز من قبل خلايا في الإدارة القائمة على النتائج قد تكون فقدت، وبالتالي ، مما يؤثر على الجدوى الشاملة للنظام. نقترح استبدال ما يصل الى 50٪ من المتوسط في كل مرة.
نظام الإدارة القائمة على النتائج يمكن استخدامها لدراسة كل سلوك الخلية (أي انتشار، والسلامة، والهجرة، الخ)، وتقييم فعالية وخارج الهدف آثار رواية العلاجيةق 8،12. يتم وضع هذا النظام أن ألخص المكروية الأنسجة، وبالتالي، فإن فعالية الأدوية الفحص يمكن تقييمها تحت ظروف البيئة بوساطة المخدرات مقاومة 14. باستخدام الخلايا الحية في الوقت الحقيقي المجهري، بقاء الخلية على مسار العلاج يمكن أن تقيم من خلال العيش / تلطيخ القتلى ويؤثر العلاج على مختلف العضيات يمكن تقييم متعددة باستخدام الأصباغ عضية محددة المتاحة تجاريا التي تخترق بسهولة مصفوفة الإدارة القائمة على النتائج و تؤخذ المتابعة من قبل خلايا دون توليد الخلفية الهامة التي يمكن أن تؤثر على التصوير.
يوفر نظام الإدارة القائمة على النتائج نموذجا تنوعا للغاية وقابلة للتكيف لدراسة اضطرابات BM. الاستفادة من هذه الطريقة 3-D ثقافة مقارنة لمعيار الثقافات 2-D هو في القدرة على دراسة سلوك الخلية في سياق المكروية الأنسجة ضمان أن آثار التفاعلات متعددة لا يتم تفويتها عندما يتم عزل الخلايا من الفيزيائيين بهمالبيئة ological ووضعها في طبق من البلاستيك. النداء الذي وجهه نظام الإدارة القائمة على النتائج في الجسم الحي على نماذج يكمن في شفافية النظام حيث التفاعلات التي لا يمكن رؤيتها في الجسم الحي بسبب القيود المفروضة على تقنيات التصوير يمكن تشريح بسهولة. يوفر نظام الإدارة القائمة على النتائج وسيلة للتلاعب السهل من المكونات مع الحفاظ على تركيبة النسيج العام، مما يسمح للباحث لتشريح الآليات الجزيئية قيد التحقيق. علاوة على ذلك، تم التحقق من صحة نظام الإدارة القائمة على النتائج باعتبارها وسيلة فعالة من حيث التكلفة، مقارنة مع التجارب المجراة، لإجراء الدراسات قبل السريرية لعلاجات جديدة 8،12. أخذت معا، يوفر نموذج الإدارة القائمة على النتائج نظاما حيث يمكن التحقيق العديد من جوانب علم الأحياء الأنسجة خارج الجسم باستخدام العينات الأولية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب مصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان (1R21CA141039)، BD جائزة العلوم البيولوجية منحة بحثية، والبحوث المؤسسية جمعية السرطان الأمريكية غرانت (IRG # 58-006-53)، إلى مركز جامعة بوردو للسرطان البحوث، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة، وبرنامج المبادرات بحوث السرطان مجلس ألبرتا. وأيد النائب من قبل المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، وبرنامج التدريب الداخلي الوقاية من السرطان (R25CA128770؛ PI: D. Teegarden) من قبل مركز علوم الأورام ومركز الأبحاث التعلم ديسكفري في جامعة بوردو تدار.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD Biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD Biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S.
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
