Este manuscrito apresenta uma técnica de aplicar ou libertar forças em células aderentes ou tecidos usando alongamento unidirecional.
Forças mecânicas exercidas sobre as células e / ou tecidos, desempenham um papel importante em numerosos processos. Desenvolvemos um dispositivo para esticar as células semeadas em um polidimetilsiloxano (PDMS) de membrana, compatível com a imagem. Esta técnica é reproduzível e versátil. A membrana pode ser micropadronadas PDMS, a fim de limitar as células ou tecidos a uma geometria específica. O primeiro passo é a impressão micropadrões sobre a membrana de PDMS com uma técnica de UV profundo. A membrana PDMS é, em seguida, montado sobre um esticador mecânica. A câmara está ligada na parte superior da membrana com lubrificante biocompatível para permitir deslizamento durante o estiramento. As células são semeadas e deixada espalhar-se por várias horas nas micropadrões. A amostra pode ser esticado e não esticada várias vezes com a utilização de um parafuso micrométrico. Demora menos de um minuto para aplicar o trecho em toda sua extensão (cerca de 30%). A técnica aqui apresentada não inclui um dispositivo motorizado, o qual é necessário para umapplying ciclos repetidos de alongamento de forma rápida e / ou controlado alongamento computador, mas isso pode ser implementado. Alongamento de células ou tecidos podem ser de interesse para as questões relacionadas com as forças de celulares, a resposta celular ao estresse mecânico ou morfogênese do tecido. Esta apresentação de vídeo vai mostrar como evitar problemas típicos que podem surgir quando se faz este tipo de experimento aparentemente simples.
As células que constituem um tecido em organismos superiores estão sujeitos a tensões mecânicas e as forças de alongamento ou provenientes do ambiente externo, ou a partir de células que rodeiam 1,2. As células devem se adaptar e resistir a essas forças, a fim de manter a integridade do tecido. Essas forças também são importantes para os tecidos morfogênese durante o desenvolvimento 3,4. Aplicação de forças mecânicas sobre as células em cultura é uma forma de imitar o que pode acontecer num tecido, mas com um controlo quantitativo e independente da forma da célula e de deformação célula 5,6. Por isso, várias técnicas podem ser usadas. Pode-se pressionar sobre as células (a célula inteira ou parte dela), por exemplo, usando AFM ou derivados 7,8 ou esticar o substrato as células estão crescendo diante.
O método descrito neste artigo demonstra como esticar um substrato plano revestida com as células. Esta técnica foi originalmente desenvolvido para avaliar o papel das forças exercidas sobre mcélulas de mamíferos itotic 9. As células mitóticas ficar ligado ao substrato por meio de fibras de retracção e o alongamento da membrana exercida uma força sobre as fibras, o que por sua vez, provocou a rotação do fuso mitótico. O interesse de se combinar micropadrões adesivas e de alongamento é conseguir um controlo independente das forças e forma de células individuais. Por exemplo, é possível esticar uma célula oval em uma forma perfeitamente redonda isotrópica, enquanto estiramento uniaxial é aplicada. Se as células não estão em tecendo micropadrões, estiramento uniaxial resultados do alongamento celular, com a maioria das células com um longo eixo alinhado com o eixo de estiramento. Em seguida, é difícil separar o efeito do alinhamento do eixo longo e o efeito do alongamento aplicado às células.
O dispositivo é adequado para qualquer imagem de células vivas, incluindo microscopia fluorescente lapso de tempo longo, e os medicamentos podem ser acrescentados durante o experimento. O método UVs micropatterning profunda 10foi descrito em detalhes em Azioune et al. 11 Patterning em PDMS foi descrito em 12 Azioune et al. O presente protocolo de alongamento é uma versão em vídeo de Carpi et al. 13
Embora esta técnica tem sido utilizada inúmeras vezes e é exaustivamente testado, há várias etapas críticas que podem levar a uma experiência fracassada.
Sobre o PDMS:
Para este trabalho, GelPak, uma folha fina de PDMS comercialmente disponível, foi usado. Alternativamente folhas PDMS pode ser convertido diretamente do mix PDMS. Recomendamos a utilização de GelPak porque é mais reprodutível e é menos propensos a quebrar em comparação com custom made P…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi fundada pelo Institut Curie, Paris, França. O esticador mecânico foi projetado por Damien Cuvelier (Institut Curie) e é fabricado pela GREM (mecanique-grem.com). A padronização de PDMS foi desenvolvido por Ammar Azioune (Bordeaux II University).
GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself. |
Silicon grease | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | This one is biocompatible |
Stretching device | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | Stable 6 months at -20 °C |
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt) | Sigma | 56485 | Protect from humidity |
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
Synthetic Quartz photomask | Toppan | Take standard binary photomask in Quartz | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 |