Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

Summary

Este manuscrito apresenta uma técnica de aplicar ou libertar forças em células aderentes ou tecidos usando alongamento unidirecional.

Abstract

Forças mecânicas exercidas sobre as células e / ou tecidos, desempenham um papel importante em numerosos processos. Desenvolvemos um dispositivo para esticar as células semeadas em um polidimetilsiloxano (PDMS) de membrana, compatível com a imagem. Esta técnica é reproduzível e versátil. A membrana pode ser micropadronadas PDMS, a fim de limitar as células ou tecidos a uma geometria específica. O primeiro passo é a impressão micropadrões sobre a membrana de PDMS com uma técnica de UV profundo. A membrana PDMS é, em seguida, montado sobre um esticador mecânica. A câmara está ligada na parte superior da membrana com lubrificante biocompatível para permitir deslizamento durante o estiramento. As células são semeadas e deixada espalhar-se por várias horas nas micropadrões. A amostra pode ser esticado e não esticada várias vezes com a utilização de um parafuso micrométrico. Demora menos de um minuto para aplicar o trecho em toda sua extensão (cerca de 30%). A técnica aqui apresentada não inclui um dispositivo motorizado, o qual é necessário para umapplying ciclos repetidos de alongamento de forma rápida e / ou controlado alongamento computador, mas isso pode ser implementado. Alongamento de células ou tecidos podem ser de interesse para as questões relacionadas com as forças de celulares, a resposta celular ao estresse mecânico ou morfogênese do tecido. Esta apresentação de vídeo vai mostrar como evitar problemas típicos que podem surgir quando se faz este tipo de experimento aparentemente simples.

Introduction

As células que constituem um tecido em organismos superiores estão sujeitos a tensões mecânicas e as forças de alongamento ou provenientes do ambiente externo, ou a partir de células que rodeiam ^1,2. As células devem se adaptar e resistir a essas forças, a fim de manter a integridade do tecido. Essas forças também são importantes para os tecidos morfogênese durante o desenvolvimento ^3,4. Aplicação de forças mecânicas sobre as células em cultura é uma forma de imitar o que pode acontecer num tecido, mas com um controlo quantitativo e independente da forma da célula e de deformação célula ^5,6. Por isso, várias técnicas podem ser usadas. Pode-se pressionar sobre as células (a célula inteira ou parte dela), por exemplo, usando AFM ou derivados ^7,8 ou esticar o substrato as células estão crescendo diante.

O método descrito neste artigo demonstra como esticar um substrato plano revestida com as células. Esta técnica foi originalmente desenvolvido para avaliar o papel das forças exercidas sobre mcélulas de mamíferos itotic ^9. As células mitóticas ficar ligado ao substrato por meio de fibras de retracção e o alongamento da membrana exercida uma força sobre as fibras, o que por sua vez, provocou a rotação do fuso mitótico. O interesse de se combinar micropadrões adesivas e de alongamento é conseguir um controlo independente das forças e forma de células individuais. Por exemplo, é possível esticar uma célula oval em uma forma perfeitamente redonda isotrópica, enquanto estiramento uniaxial é aplicada. Se as células não estão em tecendo micropadrões, estiramento uniaxial resultados do alongamento celular, com a maioria das células com um longo eixo alinhado com o eixo de estiramento. Em seguida, é difícil separar o efeito do alinhamento do eixo longo e o efeito do alongamento aplicado às células.

O dispositivo é adequado para qualquer imagem de células vivas, incluindo microscopia fluorescente lapso de tempo longo, e os medicamentos podem ser acrescentados durante o experimento. O método UVs micropatterning profunda ¹⁰foi descrito em detalhes em Azioune et al. ¹¹ Patterning em PDMS foi descrito em ¹² Azioune et al. O presente protocolo de alongamento é uma versão em vídeo de Carpi et al. ¹³

Protocol

1. A passivação do PDMS

1. Corte um pedaço de PDMS aproximadamente 35 mm x 20 mm a partir de uma folha pré feita (por exemplo, GelPak, conforme listado na tabela de materiais).
2. Remover a parte superior e as camadas de protecção inferior de plástico (se necessário) e usar uma pinça para colocar o PDMS numa plástico (não tratados de cultura celular), uma placa de Petri.
3. Lavar o PDMS com etanol a 70% durante 5 minutos num rotor a 30 oscilações / min.
4. Seca-se a superfície de fluxo de ar sobre ela.
5. Iluminar com UV profunda (λ = 180 nm), durante 5 min, a uma certa distância das lâmpadas de UV de cerca de 5 cm (ver folha de Materiais para referência lâmpada; parâmetros irão variar de acordo com diferentes lâmpadas).
6. Prepare a 200 ul de solução de EDC / NHS para cada pedaço de PDMS (isto deve ser preparado imediatamente antes da utilização porque a reactividade da solução decai em questão de horas). Para se 1 ml de 0,05 M de MES + 0,5 M de tampão de NaCl a pH 6,0, adiciona 11,5 mg de Sulfo-NHS e 19,2 mg de EDC.
7. Transferir oPDMS folhas da placa de Petri para a tampa da caixa de Petri, a qual não foi esclarecida. Isto irá assegurar que o ambiente de PDMS são muito hidrofóbicas e facilitar o passo seguinte.
8. Adicionar solução de EDC / NHS e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
9. Enxágüe EDC / NHS com água.
10. Adicionar solução de PLL-g-PEG (0,5 mg / ml em HEPES 10 mM, pH 8,6) e incuba-se a partir de 3 horas a durante a noite à temperatura ambiente.
11. Lavar o PLL-g-PEG com água. PDMS passivadas (funcionalizadas com PLL-g-PEG) podem ser armazenadas durante vários dias a 4 ° C.

2. Padronização do PDMS

1. Pegue uma folha de PDMS e colocá-lo em um photomask quartzo sintético tendo as microestruturas para padronização (veja a Figura 1). Coloque o lado do PDMS tendo a PLL-g-PEG de frente para o lado cromo do photomask.
2. Iluminar durante 7 min através da fotomáscara a uma distância das lâmpadas de UV de cerca de 5 cm.
3. Adicionar água sobre a máscara + PDMS e descascar as PDMS lentamente para fora da máscara.
4. Incubar com uma solução de fibronectina, a 50 mg / mL em tampão de HEPES, a pH 8.6 durante 1 hora à temperatura ambiente. É possível utilizar outras proteínas de ECM, mas estes não foram testados com este protocolo.
5. Lavar com PBS.

3. Montagem do Dispositivo

1. Monte os PDMS anteriormente passivadas para o dispositivo de alongamento (ver discussão para solução de problemas).
   1. Anexar um lado do PDMS para a parte fixa da maca.
   2. Corrigir o outro lado à parte móvel da maca sem apertar demasiado a folha de PDMS.
2. Corte um retângulo de PDMS (22 mm x 19 mm) em um facada PDMS espessura e corte outro retângulo dentro, a fim de ter uma piscina (ou frame) que vai manter as células e meios de comunicação (ver Figura 2).
3. Adicionar graxa de silicone sob este PDMS piscina e colocá-lo no topo da folha de PDMS para criar um medium retenção piscina. A massa vai permitir o deslizamento da piscina sobre a folha de PDMS durante o alongamento.

4. Padronização das Células

1. Retire as células a partir de uma confluência garrafa de cultura de 50% com Versene.
2. Contar as células e ressuspender-los a uma concentração de 200.000 células / ml.
3. Adicionar 1 ml de suspensão de células na piscina (ver discussão para obter detalhes adicionais).
4. Deixe as células ligam-se aos padrões de 10-30 minutos (dependendo do tipo de célula, células EPR-1 terá 10 min, e as células HeLa de 20 min).
5. Lavar suavemente as células flutuantes com meio equilibrada (equilibrar médio na incubadora).
6. Que as células se espalham por algumas horas sobre os padrões (RPE-1 precisará de pelo menos 2 horas; células HeLa terá 3 horas).
7. Adicionar uma lamela por cima da piscina para evitar a evaporação e meio de fuga no caso de o PDMS quebras.
8. Colocar o dispositivo sobre um microscópio invertido e começar a imagiologia. Evite o uso de ob imersão em óleotivos, uma vez que não vai funcionar devido a problemas de foco.

5. Alongamento

1. Gire o parafuso micrométrico enquanto corrige a posição estágio no x, y, e z-axis (principalmente x). A posição de fase deve ser corrigido para compensar o aumento do PDMS e a perda do foco. (Consulte "Durante o trecho" parágrafo na discussão).

Representative Results

A técnica apresentada neste protocolo de vídeo permitiu a aplicação de forças sobre as fibras de retração da mitose de células de mamíferos. Com efeito, durante a divisão celular, na fase de mitose, as células de mamíferos retrair a tomar a forma de uma esfera e deixar para trás os cabos de actina finas rodeado por uma membrana, que estão ligadas ao substrato. Estes cabos (fibras de retração), são a memória da geometria da célula antes de entrar em divisão. Fazendo micropadrões com UV profundo através de uma fotomáscara sobre PDMS película fina (Figura 1) permitiu o controlo geométrico de adesão celular. Ao esticar o substrato no início da metáfase, algumas destas fibras de retracção foram puxados para fora do corpo celular, resultando em forças mecânicas aplicadas no córtex das células mitóticas (Figura 3). Estas forças foram mostrados para governar a orientação do eixo da ferramenta ^9.

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Figura 1. Synthetic Quartz Photomask tendo características micropadrões.   A) photomask típica utilizada para padronização UV profundo. Ele está a 10 cm x 10 cm máscara binária e as características são tipicamente de cerca de 20 m de largura para padronização única célula, com uma resolução submicron. Praças visíveis a olho nu são do tamanho de um campo de microscópio objetivo 10X de vista. O blowup mostra as características correspondentes aos padrões de células individuais (aqui discos). As características são transparentes para permitir que UVs profundas passar. B) O PDMS é aplicada sobre a foto-mascara evitando cuidadosamente a formação de bolhas. O lado PDMS passivados está em contato com o lado metálico do photomask. Os micropadrões será impresso em todo o PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2. A piscina.   Uma piscina PDMS é aplicado sobre a folha de PDMS. Graxa está cobrindo o perímetro fundo da piscina. A capacidade da piscina é de cerca de 2 ml de mídia. A piscina está cheia de meio de cultura (aqui água com fluoresceína aparece em amarelo). Para evitar a evaporação, uma lamela pode ser adicionado em cima. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

A) Antes de alongamento. A célula é revestida com um padrão oval. Para alcançar este objectivo, a padronização é feita com o PDMS ser esticados durante a impressão de padrões redondas através da foto-mascara. A fotomáscara é utilizada discriminado (a peça de máscara é de cerca de 1,5 cm de diâmetro). Para evitar quebrar uma máscara, use um padrão oval no photomask e imprimi-lo em uma folha de PDMS não esticada. B) Após o alongamento. O substrato é esticado como o padrão se torna um círculo. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Discussion

Embora esta técnica tem sido utilizada inúmeras vezes e é exaustivamente testado, há várias etapas críticas que podem levar a uma experiência fracassada.

Sobre o PDMS:

Para este trabalho, GelPak, uma folha fina de PDMS comercialmente disponível, foi usado. Alternativamente folhas PDMS pode ser convertido diretamente do mix PDMS. Recomendamos a utilização de GelPak porque é mais reprodutível e é menos propensos a quebrar em comparação com custom made PDMS.

Sobre o dispositivo:

O dispositivo de alongamento utilizado neste protocolo foi concebido "in house", mas também se pode aplicar a técnica micropatterning em macas disponíveis comercialmente como FlexCell. Opções personalizadas feitas são mais versáteis e muito mais barato.

Montagem do dispositivo:

A montagem dos PDMS pode levar à ruptura. Também é fácil de invertê-lo e não há nenhuma maneira de saber qual é o ladoqual. Se o PDMS é apertada em demasia, torna-se mais curto, e isto pode levar à ruptura (como a tensão será maior para a mesma distância de estiramento). Verifique se os parafusos estão bem apertados ou a folha de PDMS vai escorregar assim que o trecho começa ou, mais tarde, durante o experimento.

Adicionando as células:

Para destacar as células a partir do substrato de cultura, é melhor usar o EDTA 0,02% em PBS em vez de tripsina. Usando EDTA permitirá religação mais rápido das células sobre os padrões. Quando as células são adicionados para o PDMS, eles devem ser bem separados uns dos outros de modo a obter células individuais que se ligam ao padrão. Uma vez que estão em suspensão, pipeta-los várias vezes com uma ponta de 200 mL, o que irá acabar com agregados. Cerca de 200.000 células devem ser adicionados na superfície de 4 cm ^2, de modo a ter a ligação a cada padrão. Utilizar um volume pequeno, de modo que as células cair rapidamente para a superfície. Se não há número suficiente de células, mquaisquer padrões permanecerá vazio. As células não ligadas deve ser lavado pela remoção de mídia assim que células suficientes estão vinculados aos padrões. O tempo para que o descarregamento pode variar entre os tipos de células, mas 15 min é geralmente suficiente para que as células começam anexando aos padrões. Se as células são deixadas a ligar durante muito tempo, os padrões será ocupado por duas ou mais células. Este passo é descrito em ^13.

Durante o trecho:

Tenha cuidado extra, durante o alongamento, para evitar perder a posição da região de interesse. Com efeito, durante o estiramento, o PDMS irá alargar-se, e a posição de fase deve ser reajustada para compensar. Uma combinação de um dispositivo de alongamento e de software de controlo motorizado da fase pode ser desenvolvido para compensar automaticamente para este efeito ^14. O esticador manual simples e versátil apresentado aqui pode ser atualizado para alcançar tal compensação automatizada.

O po PDMSol pode vazar se a graxa de silicone não foi colocado corretamente ao redor da superfície. Certifique-se de que a configuração for corretamente selado, colocando PBS dentro e observando qualquer vazamento antes do plaqueamento de células nele.

Nossa maca permite que um trecho de cerca de 30%, mas macas design personalizado poderia permitir um maior grau de alongamento. Ter cuidado porque quanto maior a tensão, maior é o risco de ruptura da camada de PDMS.

Limitações:

Uma das principais limitações da técnica aqui apresentada é a falta de fácil automático alongamento / destretching usando um motor. No entanto, é possível adaptar um actuador, em vez de um parafuso micrométrico manual. Esta implementação, juntamente com uma programação específica do controle microscópio pode permitir a compensação para o deslocamento da amostra durante o alongamento.

Outra desvantagem é a dificuldade de ter alta resolução de imagem, porque o uso de objetivos de imersão em óleo emDuces movimentos do substrato macio quando o objetivo se move muito rápido. Isso pode ser resolvido usando a água (mas, em seguida, a evaporação é um problema para experimentos de longo prazo) ou óleo muito fluido.

Modificações e futuras aplicações:

Em colaboração com Yanlan Mao e Nic Tapon do Instituto de Investigação do Cancro (Londres, Reino Unido), foi desenvolvida uma outra versão do esticador que permite que duas camadas de PDMS em cima uns dos outros, com a amostra sendo no meio, a fim de comprimir e esticar tecidos completos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141