التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة
Summary
الموصوفة هنا هو بروتوكول للتصوير شبه الآلي من مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد.
Abstract
الأجنة الزرد هي أداة قوية لفحص واسعة النطاق من جزيئات صغيرة. وكثيرا ما تستخدم الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل لتحديد المواد الكيميائية التي تعدل التعبير الجيني. شاشات الكيميائية التي مقايسة مضان في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة لفحص نسبة عالية. نحن تصف الإجراء باستخدام المجهر epifluorescence معيار مع مرحلة الآلية تلقائيا صورة الأجنة الزرد وكشف مضان الأنسجة محددة. باستخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تبلغ عن نشاط مستقبلات هرمون الاستروجين عن طريق التعبير عن GFP، وضعنا الداخلي شبه الآلي للكشف عن بروابط مستقبلات هرمون الاستروجين التي تنشط مراسل بطريقة الأنسجة محددة. في هذا الفيديو وصفنا إجراءات arraying الأجنة الزرد في 24-48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في لوحة 96 جيدا وإضافة جزيئات صغيرة التي تربط مستقبلات الاستروجين. في 72-96 HPF والصور من كل بئر منيتم جمع لوحة بأكمله تلقائيا وتفتيشها يدويا لمضان الأنسجة محددة. يوضح هذا البروتوكول القدرة على اكتشاف هرمون الاستروجين التي تنشط المستقبلات في صمامات القلب ولكن ليس في الكبد.
Introduction
وقد وضعت الزرد المعدلة وراثيا التي تسمح لرؤية مباشرة من النشاط في مسارات الإشارات، مثل عوامل نمو الخلايا الليفية 1، حمض الريتينويك 2 و 3 الاستروجين، في الأجنة الحية. هذه الأدوات تمكين الكشف عن المواد الكيميائية التي التشويش على مسارات إشارات (يعاير مثل تغير في كثافة مضان) أو المواد الكيميائية التي تعدل يشير بطريقة الأنسجة محددة (تغيير في مضان التعريب) 4. التقاط الصور الآلي يزيد من الإنتاجية بشكل كبير من شاشات الكيميائية 5،6. الشاشات التي مضان فحص تلقائيا في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة. يوفر ما يسمى الفرز الفائق محتوى صالح ارتفاع القرار، والتصوير الكمي ولكن على حساب من استخدام لوحة القراء المتخصصة المجهزة لالمجهري متحد البؤر 7،8. الهدف من هذا الأسلوب هو تلقائيا مقايسة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزردفي لوحة 96 جيدا باستخدام مجهر epifluorescence القياسية. ويمكن تمييز مضان الأنسجة محددة باستخدام هذه التقنية، وربما يكون نهجا معقولا للمختبرات التي تفتقر إلى الوصول إلى القراء لوحة المتخصصة أو معدات الفحص العالية المحتوى.
في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم التصوير الآلي للكشف عن الأنسجة محددة مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) منبهات في الزرد حية في 3 أيام بعد الإخصاب (DPF). خط المعدلة وراثيا تيراغرام (5xERE: GFP) c262/c262 يحتوي على 5 جنبا إلى جنب استجابة هرمون الاستروجين تسلسل الحمض النووي عنصر (موسوعة الدين و الأخلاق) المنبع من البروتين الفلورية الخضراء (GFP) 3. في غياب يجند، المتطلبات البيئية عادة ما تكون غير نشطة. يجند ملزم يتسبب في تغيير متعلق بتكوين جزئي، مما يسمح للمستقبلات لربط ااا الحمض النووي وتنظيم النسخ 9. 5xERE: الأسماك GFP يمكن استخدامها لفحص المكتبات الكيميائية لجهري ER، ويمكن استخدامها لفحص عينات المياه للملوثات البيئية استروجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة مباشرة لتلقائيا صورة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد. وقد تم تطوير بروتوكول باستخدام زايس محوري المراقب. Z1 مع زن الأزرق 2011 برنامج، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها باستخدام أي مجهر مقلوب مع مرحلة الآلية وبرامج التحكم المجهر التي يمكن أن تؤدي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سوزان المزارعين وموظفي البنك العربي المتحد الزرد مرفق البحوث لرعاية الزرد. التمويل التي تقدمها صناديق بدء من قسم علم الأدوية والسموم.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
- Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
- Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
- Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
- Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
