שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.
עוברי דג הזברה הם כלי רב עוצמה להקרנה בקנה מידה גדולה של מולקולות קטנות. דג הזברה מהונדס המבטאים את חלבוני כתב ניאון משמש לעתים קרובות כדי לזהות כימיקלים המווסתים את ביטוי הגנים. מסכי כימיים שassay הקרינה בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכים על ציוד יקר, מיוחד להקרנת תוכן גבוה. אנו מתארים הליך באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence רגיל עם במה ממונעת באופן אוטומטי לעוברי דג הזברה תמונה ולזהות הקרינה רקמות ספציפיות. שימוש בדג זברה מהונדס שלדווח על פעילות קולטן אסטרוגן דרך ביטוי של ה-GFP, פיתחנו הליך חצי אוטומטי למסך לligands קולטן אסטרוגן המפעיל את הכתב באופן רקמות ספציפיות. בסרטון זה אנו מתארים נהלים לעריכת עוברי דג הזברה ב24-48 שעות שלאחר הפריה (hpf) בצלחת 96 היטב והוספת מולקולות קטנות אשר נקלטות קולטני אסטרוגן. ב72-96 hpf, תמונות של כל אחד גם מכל הצלחת באופן אוטומטי שנאספו ונבדקה באופן ידני לקרינת רקמות ספציפיות. פרוטוקול זה מדגים את היכולת לזהות אסטרוגנים המפעילים קולטנים במסתמי לב, אך לא בכבד.
דג הזברה מהונדס פותחו המאפשרת הדמיה הישירה של פעילות במסלולי איתות, כגון צמיחת פיברובלסטים גורמי 1, חומצה רטינואית 2 ואסטרוגנים 3, בעוברים בשידור חי. כלים אלה מאפשרים הקרנה של כימיקלים שיוצרים הפרעת מסלולי איתות (assayed כשינוי בעוצמת הקרינה) או לכימיקלים המווסתים איתות באופן רקמות ספציפיות (שינוי בלוקליזציה הקרינה) 4. לכידת תמונה אוטומטית מגדילה את התפוקה של מסכי כימיים באופן דרמטי 5,6. מסכים שהקרינה באופן אוטומטי assay בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכת על ציוד יקר, מיוחד. מה שנקרא גבוה הקרנת תוכן מספקת את היתרון של רזולוציה גבוהה, הדמיה כמותית אך במחיר של שימוש בקוראי צלחת מיוחדים מצוידים למיקרוסקופיה confocal 7,8. מטרתה של שיטה זו היא באופן אוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות assay בעוברי דג הזברהבצלחת 96 היטב באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence סטנדרטי. הקרינה רקמות ספציפיות ניתן להבחין באמצעות טכניקה זו ועלולה להיות גישה סבירה למעבדות שאין גישה לקוראי צלחת מיוחדות או ציוד גבוה הקרנת תוכן.
בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהדמיה אוטומטית כדי לזהות קולט רקמות ספציפיות אסטרוגן (ER) אגוניסטים בדג הזברה לחיות ב3 ימים לאחר הפריה (DPF). הקו המהונדס Tg (5xERE: GFP) c262/c262 מכיל 5 רצפי טנדם תגובת אסטרוגן אלמנט ה-DNA (ERE) במעלה הזרם של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 3. בהעדר ליגנד, מיונים הם בדרך כלל לא פעילים. ליגנד מחייב מעורר שינוי קונפורמציה, המאפשר הקולטנים להיקשר ERE-DNA ולווסת את השעתוק 9. 5xERE: ניתן להשתמש בדגים GFP למסך ספריות כימיות למאפנני ER ויכולים לשמש מסך דגימות מים סביבתיים למזהמים אסטרוגניים.
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לאוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות תמונה בעוברי דג הזברה. הפרוטוקול פותח באמצעות Zeiss Axio אובזרוור. Z1 עם תוכנת זן 2011 כחול, עם זאת הטכניקה יכולה להיות מותאם באמצעות כל מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת ותוכנת שליטת מיקרוסקופ שיכול לבצע ריצוף כדי ליצו…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לסוזן פארמר ואת צוות של מתקן מחקר דג הזברה UAB לטיפול בדג זברה. מימון הניתן על ידי קופות הזנק מהמחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |