Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish
Summary
Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.
Abstract
Embriões de peixe-zebra são uma poderosa ferramenta para a triagem em larga escala de pequenas moléculas. Zebrafish transgênicos que expressam proteínas repórter fluorescentes são freqüentemente usados para identificar os produtos químicos que modulam a expressão do gene. Telas químicas que ensaio de fluorescência no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados para rastreio de alto conteúdo. Nós descrevemos um procedimento usando um microscópio de epifluorescência padrão com um palco motorizado a imagem automaticamente embriões de peixes-zebra e detectar a fluorescência de tecido específico. Usando zebrafish transgênicos que relatam a atividade do receptor de estrogênio via expressão de GFP, foi desenvolvido um processo semi-automatizado para triagem de ligantes do receptor de estrogênio que ativam o repórter de uma forma específica de tecido. Neste vídeo, descrevemos os procedimentos para arraying embriões de peixe-zebra em 24-48 horas pós fertilização (hpf) em uma placa de 96 poços e adicionando pequenas moléculas que se ligam receptores de estrogênio. Em 72-96 hpf, imagens de cada poço a partir detoda a placa são coletados automaticamente e inspecionados manualmente para fluorescência de tecido específico. Este protocolo demonstra a capacidade para detectar os estrogénios que activam os receptores de válvulas cardíacas, mas não no fígado.
Introduction
Paulistinha transgênico foram desenvolvidos que permitem a visualização direta de atividade em vias de sinalização, como fatores de crescimento de fibroblastos 1, o ácido retinóico 2 e 3 estrógenos, em embriões vivos. Estas ferramentas permitem o rastreio de produtos químicos que perturbam as vias de sinalização (ensaiado como uma mudança na intensidade de fluorescência) ou por produtos químicos que modulam a sinalização de um modo específico do tecido (alteração na fluorescência de localização) 4. Captura de imagem automatizado aumenta a taxa de transferência de telas químicas dramaticamente 5,6. Telas que fluorescência automaticamente ensaio no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados. O chamado de triagem de alto teor fornece o benefício de alta resolução, imagens quantitativas, mas ao custo de usar leitores de placas especializadas equipadas para microscopia confocal 7,8. O objectivo deste método é a fluorescência específica de tecido automaticamente ensaio em embriões de peixe-zebraem uma placa de 96 poços, utilizando um microscópio de epifluorescência padrão. Fluorescência de tecidos específicos podem ser distinguidos utilizando esta técnica e pode ser uma abordagem razoável para laboratórios que não têm acesso a leitores de placas especializadas ou equipamentos de alta teor de triagem.
Neste protocolo, usamos de imagens automatizado para detectar receptor de estrogênio tecido específico (ER) agonistas em peixe-zebra ao vivo em três dias após a fertilização (dpf). A linhagem transgênica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contém 5 seqüências em tandem de resposta de estrogênio elementos de DNA (ERE) a montante da proteína verde fluorescente (GFP) 3. Na ausência de ligando, ERs são normalmente inactivos. Ligação do ligante desencadeia uma mudança conformacional, permitindo que os receptores para ligar DNA ERE e regulam a transcrição 9. 5xERE: peixe GFP pode ser utilizado para pesquisar bibliotecas químicas para moduladores de ER e pode ser utilizado para rastrear as amostras de água do meio ambiente para os contaminantes estrogênicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método simples para automaticamente a imagem de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra. O protocolo foi desenvolvido utilizando uma Zeiss Axio Observer. Z1 com software Zen azul 2011, no entanto, a técnica pode ser adaptada usando qualquer microscópio invertido com uma platina motorizada e software de controlo do microscópio que possa realizar a telha para criar imagens compostas. Equipar um microscópio invertido com um palco motorizado pode fornecer uma alternat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Susan Farmer e os funcionários do centro de pesquisa do peixe-zebra UAB para cuidado zebrafish. O financiamento é fornecido pelos fundos de start-up do Departamento de Farmacologia e Toxicologia.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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