Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио
Summary
Описанный здесь это протокол для полу-автоматизированной визуализации тканеспецифической флуоресценции у эмбрионов рыбок данио.
Abstract
Эмбрионы рыбок данио являются мощным инструментом для крупномасштабного скрининга малых молекул. Трансгенные данио, которые выражают флуоресцентные репортер белки часто используются для выявления химических веществ, которые модулируют экспрессию генов. Химические экраны, которые анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования для скрининга высокое содержание. Мы описываем процедуру с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскоп с моторизованным этапе для автоматической изображения эмбрионов данио рерио и выявления тканеспецифической флуоресценции. Использование трансгенных данио, что отчет о деятельности рецептора эстрогена через выражение GFP, мы разработали процедуру полуавтоматического для выявления рецептора эстрогена лигандов, активирующих репортеру в тканеспецифического образом. В этом видео мы описываем процедуры выстроив эмбрионов данио рерио в 24-48 часов после оплодотворения (ФВЧ) в 96-луночный планшет и добавляя небольшие молекулы, которые связывают рецепторы эстрогена. В 72-96 часов после оплодотворения, образы каждую лунку отвся пластина автоматически собираются и вручную проверять на тканеспецифической флуоресценции. Этот протокол демонстрирует способность обнаруживать эстрогены, которые активируют рецепторы в сердечных клапанов, но не в печени.
Introduction
Трансгенные данио были разработаны, которые позволяют прямой визуализации активности в пути, такие как роста фибробластов факторы 1, ретиноевой кислоты 2 и эстрогены 3, в живых эмбрионов сигнализации. Такие инструменты позволяют скрининг для химических веществ, которые возмущают сигнальных путей (анализировали, как изменение интенсивности флуоресценции) или химических веществ, которые модулируют сигнализации в ткане-специфическим образом (изменение локализации флуоресценции) 4. Автоматизированный ввод изображений увеличивает пропускную способность химических экранов резко 5,6. Экраны, которые автоматически анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования. Так называемый скрининг высокого содержания обеспечивает преимущества высокого разрешения, количественного изображений, но за счет использования специализированных читателей пластины оборудованные для конфокальной микроскопии 7,8. Цель этого метода состоит в автоматическом анализе тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рериов 96-луночный планшет с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскопа. Тканеспецифическая флуоресценции можно отличить с помощью этой техники и может быть разумным подходом для лабораторий, которые не имеют доступа к специализированным читателей пластины или высокой-контент оборудования для досмотра.
В этом протоколе, мы используем автоматизированную изображений для обнаружения тканеспецифической рецептора эстрогена (ER) агонисты в живом рыбок данио в 3 дней после оплодотворения (DPF). Трансгенной линии Tg (5xERE: GFP) c262/c262 содержит 5 тандем реагирования эстрогена элементов последовательности ДНК (ЭРД) вверх по течению от зеленого флуоресцентного белка (GFP) 3. В отсутствие лиганда, ERS обычно неактивны. Связывание лиганда вызывает конформационные изменения, что позволяет рецепторы для связывания ERE ДНК и регулируют транскрипцию 9. 5xERE: GFP рыба может быть использован для скрининга химических библиотек для ER модуляторов и может быть использован для скрининга образцов окружающей воды для эстрогенных загрязнений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает прямой метод, автоматически изображений тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рерио. Протокол был разработан с использованием Zeiss Axio Observer. Z1 с дзен Синий 2011 программного обеспечения, однако методика может быть адаптирована с помощью любого инвертир…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сьюзен Фармер и коллектив ЗАО данио научно-исследовательский центр для рыбок данио помощи. Финансовые средства, предоставленные пуско-наладочные средств с кафедрой фармакологии и токсикологии.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
- Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
- Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
- Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
- Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
