Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen
Summary
Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.
Abstract
Zebrafisch-Embryonen sind ein mächtiges Werkzeug für große Screening kleiner Moleküle. Transgene Zebrafisch, die fluoreszierende Reporter-Proteine exprimieren, werden häufig verwendet, um Chemikalien, die die Genexpression modulieren. Chemische Bildschirme, die Fluoreszenz-in-Live Zebrabärblingtest verlassen sich oft auf teure Spezialausrüstung für High Content Screening. Wir beschreiben ein Verfahren, mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne, um automatisch Bildzebrafischembryonen und erkennen Gewebe-spezifische Fluoreszenz. Mit transgenen Zebrafisch, die Östrogen-Rezeptor-Aktivität berichten über die Expression von GFP, entwickelten wir eine semi-automatische Verfahren für Östrogen-Rezeptor-Liganden, die die Reporter in einem Gewebe-spezifisch aktivieren screenen. In diesem Video beschreiben wir Verfahren zum Ordnen von Zebrafisch-Embryonen von 24-48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in einer 96-Well-Platte und das Hinzufügen von kleinen Molekülen, die Östrogen-Rezeptoren binden. Bei 72-96 hpf, Bilder von jedem gut ausdie gesamte Platte, werden automatisch gesammelt und manuell für Gewebe-spezifischen Fluoreszenz untersucht. Dieses Protokoll zeigt die Fähigkeit, Östrogen-Rezeptoren, die in Herzklappen zu aktivieren, aber nicht in der Leber zu erkennen.
Introduction
Transgene Zebrafisch entwickelt worden, die zur direkten Visualisierung der Aktivität in Signalwege, wie beispielsweise Fibroblasten-Wachstumsfaktoren 1, 2 Retinsäure und Östrogene 3, lebenden Embryos zu ermöglichen. Solche Werkzeuge ermöglichen Screening für Chemikalien, die Signalwege zu stören (wie Änderung der Fluoreszenzintensität analysiert wurde) oder Chemikalien, die Signalgebung modulieren in einer gewebespezifischen Art und Weise (Änderung der Fluoreszenzlokalisierungs) 4. Automatisierte Bildaufnahme erhöht den Durchsatz der chemischen Bildschirme dramatisch 5,6. Bildschirme, die automatisch im Live-Test Fluoreszenz Zebrafisch verlassen sich oft auf teure Spezialgeräte. High-Content-Screening sogenannte bietet den Vorteil hoher Auflösung, quantitative Bildgebung, aber auf Kosten der Verwendung von spezialisierten Plattenleser für die konfokale Mikroskopie 7,8 ausgestattet. Das Ziel dieser Methode ist es, automatisch Assay gewebespezifische Fluoreszenz in Zebrafischembryonenin einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines Standard-Epifluoreszenz-Mikroskop. Gewebespezifische Fluoreszenz kann mit dieser Technik unterschieden werden und kann ein vernünftiger Ansatz für die Laboratorien, die den Zugang zu spezialisierten Plattenleser oder High-Content-Screening-Geräte fehlt sein.
In diesem Protokoll verwenden wir automatisierte Bildgebung von Gewebe-spezifischen Östrogen-Rezeptor (ER)-Agonisten in lebenden Zebrafisch nach 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) zu erfassen. Die transgene Linie Tg (5xERE: GFP) c262/c262 enthält 5 Tandem Östrogen-Response-Element-DNA-Sequenzen (ERE) stromaufwärts des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 3. In der Abwesenheit von Liganden, ERs sind normalerweise inaktiv. Ligandenbindung löst eine Konformationsänderung, wodurch Rezeptoren binden ERE DNA und regulieren die Transkription 9. 5xERE: GFP Fische verwendet werden, um Substanzbibliotheken für ER-Modulatoren zu screenen und kann verwendet werden, um Umweltwasserproben für östrogene Verunreinigungen zu screenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um automatisch Bild Gewebe-spezifischen Fluoreszenz in Zebrafischembryonen. Das Protokoll wurde mit einem Zeiss Axio Observer entwickelt. Z1 mit Zen-Blau-2011-Software, aber die Technik kann mit jedem inversen Mikroskop mit einem motorisierten Mikroskop Bühne und Steuerungssoftware, die Fliesen durchführen, um zusammengesetzte Bilder erstellen angepasst werden. Das Ausrüsten eines inversen Mikroskops mit einem motorisierten Stufe kann eine praktische, preiswerte Alte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Susan Farmer und die Mitarbeiter der UAB Zebrafisch-Forschungseinrichtung für Zebrafisch-Pflege. Finanzierung von Start-up-Fonds von der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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