ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング
Summary
ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。
Abstract
ゼブラフィッシュ胚は、小分子の大規模スクリーニングのための強力なツールである。蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、しばしば、遺伝子発現を調節する化学物質を同定するために使用される。ライブゼブラフィッシュで蛍光を分析化学の画面は、多くの場合、高含有量のスクリーニングのために高価な、特殊な装置に依存しています。私たちは、電動ステージ自動的に画像ゼブラフィッシュ胚に標準落射蛍光顕微鏡を用いて手順を説明し、組織特異的な蛍光を検出。 GFPの発現を介して、エストロゲン受容体活性を報告するトランスジェニックゼブラフィッシュを用いて、組織特異的にレポーターを活性化するエストロゲン受容体のリガンドをスクリーニングするための半自動化された手順を開発した。このビデオでは、96穴プレートに24〜48時間後に受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚を配列し、エストロゲン受容体に結合する小分子を追加するための手順について説明します。 72〜96 HPFで、それぞれの画像は、ウェルからプレート全体が自動的に収集され、手動で組織特異的な蛍光検査される。このプロトコルは、心臓弁ではなく、肝臓での受容体を活性化エストロゲンを検出する能力を実証する。
Introduction
トランスジェニックゼブラフィッシュは、線維芽細胞増殖は1、レチノイン酸2因子 、ライブ胚において、3のエストロゲンシグナル伝達経路における活性を直接可視化を可能に開発されている。このようなツールは（蛍光強度の変化としてアッセイ）シグナル伝達経路を撹乱化学物質または組織特異的様式4（蛍光の局在の変化）でシグナル伝達を調節する化学物質のスクリーニングを可能にする。自動化された画像取り込みは、化学画面劇的5,6のスループットが向上します。ライブゼブラフィッシュにおける自動的アッセイ蛍光は、多くの場合、高価な、特殊な装置に依存している画面。いわゆる高含有量スクリーニングは、高分解能、定量的なイメージングが、共焦点顕微鏡、7,8のために装備、特殊なプレートリーダーを使用してのコストでの利点を提供します。このメソッドの目的は、ゼブラフィッシュ胚で自動的に分析組織特異的な蛍光である標準的な落射蛍光顕微鏡を用いて96ウェルプレート中。組織特異的蛍光は、この技術を用いて区別することができ、特殊なプレートリーダーまたはハイコンテントスクリーニング装置へのアクセスを欠いている実験室のための合理的なアプローチであり得る。
このプロトコルでは、3日後に受精（DPF）で組織特異的エストロゲン受容体（ER）ライブゼブラフィッシュにおけるアゴニストを検出するための自動化されたイメージングを使用する。トランスジェニック系統のTg（5xERE：GFP）c262/c262は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の上流に5タンデムエストロゲン応答エレメントDNA配列（ERE）を含む3。リガンドの非存在下で、ERは、通常は不活性である。リガンド結合は、受容体がERE DNAと結合し、転写9を調節することができるように、コンフォメーション変化を誘発する。 5xERE：GFP魚ERモジュレーターのための化学ライブラリーをスクリーニングするために使用することができ、エストロゲン汚染物質の環境水サンプルをスクリーニングするために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚で自動的に画像の組織特異的な蛍光の簡単な方法を説明します。プロトコルはツァイスアクシオオブザーバを使用して開発されました。禅ブルー2011ソフトウェアでZ1は、しかし技術は、合成画像を作成するためにタイリングを行うことができる電動ステージと顕微鏡制御ソフトウェアとの任意の倒立顕微鏡を使用して適合させることができる。電動ス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、スーザン·ファーマーやゼブラフィッシュケアのためのUABのゼブラフィッシュ研究施設のスタッフに感謝します。薬理学および毒物学の部門からの起動の資金が提供する資金調達。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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