Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra
Summary
Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.
Abstract
Embriones de pez cebra son una poderosa herramienta para el cribado a gran escala de las moléculas pequeñas. Pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes reportero se utilizan con frecuencia para identificar productos químicos que modulan la expresión génica. Pantallas químicas que ensayo de fluorescencia en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo costoso, especializado para el cribado de alto contenido. Se describe un procedimiento utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar con una platina motorizada a la imagen automáticamente embriones de pez cebra y detectar la fluorescencia específica del tejido. El uso de pez cebra transgénico que reportan la actividad del receptor de estrógeno a través de la expresión de GFP, hemos desarrollado un procedimiento semi-automático para la detección de ligandos del receptor de estrógeno que activan el reportero en una manera específica de tejido. En este video se describen los procedimientos para poner en orden embriones de pez cebra a las 24-48 horas después de la fecundación (HPF) en una placa de 96 pocillos y la adición de pequeñas moléculas que se unen a receptores de estrógeno. En 72-96 HPF, las imágenes de cada pocillo detoda la placa se recogen de forma automática y la inspección manual de la fluorescencia específica del tejido. Este protocolo demuestra la capacidad para detectar los estrógenos que activan los receptores en las válvulas del corazón, pero no en el hígado.
Introduction
Pez cebra transgénico se han desarrollado que permite la visualización directa de la actividad en las vías de señalización, tales como factores de crecimiento de fibroblastos 1, el ácido retinoico 2 y 3 estrógenos, en embriones vivos. Estas herramientas permiten la detección de productos químicos que perturban las vías de señalización (ensayada como el cambio en la intensidad de fluorescencia) o para los productos químicos que modulan la señalización de una manera específica de tejido (el cambio en la localización de la fluorescencia) 4. Captura de imagen automatizada aumenta el rendimiento de las pantallas químicas dramáticamente 5,6. Pantallas que la fluorescencia de ensayo de forma automática en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo caro y especializado. La llamada de cribado de alto contenido proporciona el beneficio de alta resolución, formación de imágenes cuantitativo pero a costa de la utilización de lectores de placas especializadas equipadas para microscopía confocal 7,8. El objetivo de este método es automáticamente ensayo de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebraen una placa de 96 pocillos usando un microscopio de epifluorescencia estándar. La fluorescencia específica del tejido se puede distinguir usando esta técnica y puede ser un enfoque razonable para los laboratorios que no tienen acceso a lectores de placas o equipos especializados-alto contenido de cribado.
En este protocolo, utilizamos imágenes automatizado para detectar los receptores de estrógenos específico de tejido (ER) agonistas en el pez cebra en vivo en 3 días después de la fertilización (dpf). La línea transgénica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 secuencias en tándem de respuesta de estrógeno de elementos de ADN (ERE) aguas arriba de la proteína verde fluorescente (GFP) 3. En ausencia de ligando, el ERS son normalmente inactivo. La unión del ligando provoca un cambio conformacional, permitiendo que los receptores de unirse al ADN y regulan la transcripción ERE 9. 5xERE: peces GFP se pueden utilizar para cribar bibliotecas químicas para moduladores de ER y se pueden utilizar para cribar muestras de agua ambiental para los contaminantes estrogénicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método directo para automáticamente una imagen de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra. El protocolo fue desarrollado utilizando un Zeiss Axio Observer. Z1 con el software de Zen Azul 2011, sin embargo, la técnica se puede adaptar usando cualquier microscopio invertido con una platina motorizada y software de control de microscopio que puede realizar suelo de baldosas para crear imágenes compuestas. Equipar a un microscopio invertido con una platina motorizada pued…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Susan Farmer y el personal del centro de investigación de la UAB pez cebra para el cuidado de pez cebra. Financiamiento proporcionado por los fondos de puesta en marcha del Departamento de Farmacología y Toxicología.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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