Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징
Summary
제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.
Abstract
제브라 피쉬 배아는 작은 분자의 대규모 스크리닝을위한 강력한 도구입니다. 형광 리포터 단백질을 표현 형질 전환 지브라 피쉬 자주 유전자 발현을 조절하는 물질을 식별하는 데 사용된다. 라이브 제브라 피쉬에서 형광을 분석 실험 화학의 화면은 종종 높은 콘텐츠 심사를 위해 고가의 전문 장비에 의존하고 있습니다. 우리는 모터 단계 자동으로 이미지 제브라 피쉬 배아에 함께 표준 표면 형광 현미경을 사용하여 프로 시저를 설명하고 조직 특이 형광을 감지합니다. GFP의 발현을 통해 에스트로겐 수용체의 활동을보고 형질 전환 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 조직 특정 방식으로 기자를 활성화 에스트로겐 수용체 리간드에 대한 화면으로 반 자동화 된 절차를 개발했다. 이 비디오에서 우리는 96 – 웰 플레이트에 24-48시간 포스트 수정 (HPF)에서 제브라 피쉬 배아으로 배열 및 에스트로겐 수용체를 바인딩 작은 분자를 추가하는 절차에 대해 설명합니다. 72-96 HPF에서, 각각의 이미지를 잘에서전체 판을 자동으로 수집 및 수동으로 조직 특이 형광을 위해 검열된다. 이 프로토콜은 아니지만 간에서의 심장 판막의 수용체를 활성화 에스트로겐을 감지하는 능력을 보여준다.
Introduction
형질 전환 제브라 피쉬는 섬유 아세포 성장 1, 레티노 산 2 인자 라이브 배아, 3 에스트로겐과 같은 경로를, 신호의 활동의 직접적인 시각화 수 있도록 개발되었다. 이러한 도구는 (형광 강도의 변화로 정량) 신호 전달 경로를 교란 화학 물질 또는 조직 특이하게 4 (형광 현지화의 변화)에 신호를 변조 화학 물질에 대한 검사를 가능하게합니다. 자동 이미지 캡처는 크게 5,6 화학 화면의 처리량을 증가시킨다. 라이브 제브라 피쉬의 자동 분석 형광 종종 고가의 전문 장비에 의존 화면. 소위 높은 콘텐츠 심사는 높은 해상도, 양적 이미징하지만, 공 초점 현미경 7,8에 장착 된 특수 플레이트 리더를 사용하는 비용의 혜택을 제공합니다. 이 방법의 목적은 제브라 피쉬 배아 자동 분석 조직 특이 형광하다표준 표면 형광 현미경을 사용하여 96 – 웰 플레이트에. 조직 특이 형광이 기술을 사용하여 구분할 수 있습니다 전문 플레이트 리더 또는 높은 콘텐츠 검사 장치에 대한 액세스를 부족 실험실을위한 합리적인 방법이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 3 일 포스트 수정 (DPF)에서 조직 특정 에스트로겐 수용체 (ER) 라이브 제브라 피쉬의 효능을 감지하는 자동화 이미징을 사용합니다. 유전자 변형 라인의 Tg (5xERE : GFP) c262/c262 녹색 형광 단백질 (GFP)의 상류에 5 탠덤 에스트로겐 반응 요소의 DNA 시퀀스 (ERE)을 포함 3. 리간드의 부재에서, ER로는 일반적으로 비활성이다. 리간드 결합은 수용체가 ERE DNA를 결합하여 전사 9를 조절 할 수 있도록 구조적 변화를 트리거합니다. 5xERE : GFP 물고기 ER 변조기 화학 라이브러리를 화면으로 사용할 수 있으며, 에스트로겐 오염 물질에 대한 환경 물 샘플을 선별하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 제브라 피쉬 배아에 자동으로 이미지 조직 특이 형광을 간단한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 자이스의 Axio 옵저버를 사용하여 개발되었습니다. Z1은 선 블루 2011 소프트웨어와 함께, 그러나이 기술은 합성 이미지를 만들 수 타일링을 수행 할 수있는 자동화 된 무대와 현미경 제어 소프트웨어와 함께 모든 거꾸로 현미경을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 전동 무대 거꾸로 현미경?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 수잔 농부와 제브라 피쉬의 치료에 대한 UAB의 제브라 피쉬 연구 시설의 직원을 감사드립니다. 약리학 및 독물학의 부에서 창업 자금에 의해 제공되는 자금.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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