Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's
Summary
Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.
Abstract
Zebravis embryo's zijn een krachtig hulpmiddel voor grootschalige screening van kleine moleculen. Transgene zebravis dat fluorescente reporter eiwitten tot expressie worden vaak gebruikt om chemicaliën die genexpressie moduleren. Chemische schermen die fluorescentie assay in levende zebravis vaak een beroep op dure, gespecialiseerde apparatuur voor hoge gehalte screening. We beschrijven een procedure met behulp van een standaard epifluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde podium om het beeld automatisch zebravis embryo's en detecteren weefsel-specifieke fluorescentie. Met behulp van transgene zebravis dat oestrogeen receptor-activiteit via expressie van GFP melden, we een semi-geautomatiseerde procedure ontwikkeld voor het screenen op oestrogeen receptor liganden die de verslaggever in een weefsel-specifieke wijze te activeren. In deze video beschrijven we procedures arraying zebravis embryo 24-48 uur na de bevruchting (HPF) in een 96-well plaat en het toevoegen van kleine moleculen die oestrogeenreceptoren binden. Op 72-96 HPF, beelden van elk putje vande hele plaat worden automatisch verzameld en handmatig gecontroleerd op weefsel-specifieke fluorescentie. Dit protocol toont het vermogen aan oestrogenen die receptoren in hartkleppen inschakelen, lever detecteren.
Introduction
Transgene zebravis ontwikkeld die het mogelijk maken de directe visualisatie van de activiteit in signaaltransductiewegen zoals fibroblast groeifactoren 1, retinoïnezuur 2 en 3 oestrogenen, in levende embryo. Dergelijke tools kunnen screenen op stoffen die signalerende wegen verstoren (getest als verandering in de fluorescentie-intensiteit) of voor chemische stoffen die moduleren signalering in een weefsel-specifieke wijze (verandering in de fluorescentie lokalisatie) 4. Geautomatiseerde beeldopname verhoogt de doorvoer van chemische schermen dramatisch 5,6. Schermen die automatisch assay fluorescentie in levende zebravis vaak een beroep op dure, gespecialiseerde apparatuur. Zogenaamde high content levert het voordeel van hoge resolutie kwantitatieve beeldvorming maar ten koste van het gebruik van gespecialiseerde plaatlezers ingericht voor confocale microscopie 7,8. Het doel van deze methode is automatisch assay weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryoin een 96-wells plaat met een standaard epifluorescentiemicroscoop. Weefsel-specifieke fluorescentie kan worden onderscheiden met behulp van deze techniek en kan een redelijke benadering voor laboratoria die de toegang tot gespecialiseerde plaat lezers of high content apparatuur ontbreekt zijn.
In dit protocol gebruiken we geautomatiseerde beeldvorming om weefselspecifieke oestrogeenreceptor (ER) agonisten in levende zebravis detecteren 3 dagen na de bevruchting (dpf). De transgene lijn Tg (5xERE: GFP) c262/c262 bevat 5 tandem oestrogeen respons element DNA-sequenties (ERE) stroomopwaarts van groen fluorescerend eiwit (GFP) 3. Bij afwezigheid van ligand, ERs gewoonlijk inactief. Ligandbinding veroorzaakt een conformationele verandering waardoor receptoren ERE DNA te binden en transcriptie te reguleren 9. 5xERE: GFP vis kan worden gebruikt om chemische bibliotheken te screenen ER modulatoren en kan worden gebruikt om de milieu watermonsters oestrogene verontreinigingen screenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om het beeld automatisch weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's. Het protocol is ontwikkeld met behulp van een Zeiss Axio Observer. Z1 met Zen Blue 2011-software, maar de techniek kan worden aangepast met behulp van een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde podium en microscoop controle software die tegels kunnen voeren maken van samengestelde afbeeldingen. Het uitrusten van een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde podium kan een praktische…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Susan Farmer en het personeel van de UAB zebravis onderzoeksfaciliteit voor zebravis zorg. Financiering verstrekt door start-up fondsen van de afdeling Farmacologie en Toxicologie.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
- Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
- Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
- Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
- Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
