Summary
Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.
Abstract
Zebrafish embriyolar küçük moleküllerin büyük ölçekli tarama için güçlü bir araçtır. Floresan haberci proteinleri eksprese eden transjenik zebra balığı sıkça, gen ekspresyonunu modüle eden kimyasal tanımlamak için kullanılır. Canlı Zebrafish floresan tahlil Kimyasal ekranlar genellikle yüksek içerik tarama için pahalı, özel ekipman güveniyor. Biz, bir motorlu kaide otomatik görüntü zebra balığı embriyolar için olan standart bir epifluorışıma mikroskop kullanılarak bir prosedür tarif ve dokuya özel floresan tespit eder. GFP ekspresyonu üzerinden östrojen reseptörü aktivitesi rapor transgenik zebrafish kullanarak, bir dokuya-özgü şekilde raportör aktif östrojen reseptör ligandları taranması için bir yarı-otomatik bir prosedür geliştirilmiştir. Bu videoda, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 24-48 saat sonra döllenme (HPF) at zebra balığı embriyolar arraying ve östrojen reseptörlerine bağlanan küçük moleküller eklemek için işlemleri tarif eder. 72-96 hpf, her görüntüleri kuyudantüm plaka otomatik olarak toplanan ve el doku-spesifik floresan için denetlenmektedir. Bu protokol, ancak karaciğer, kalp valfleri reseptörlerinin aktive östrojen algılama yeteneği göstermektedir.
Introduction
Transgenik zebra balığı gibi fibroblast büyüme 1, retinoik asit 2 faktörleri ve canlı embriyolar, 3, östrojen gibi sinyal yolaklarına aktivite doğrudan görselleştirme için izin geliştirilmiştir. Bu tür araçlar (flüoresan yoğunluğundaki değişim olarak analiz) sinyal yolları bozmakta ve kimyasal ya da dokuya özel bir şekilde, 4 (floresan lokalizasyonunda değişim) olarak işaret modüle maddeler için tarama sağlar. Otomatik görüntü yakalama dramatik 5,6 kimyasal ekranların verimini artırır. Canlı Zebrafish otomatik tahlil floresan genellikle pahalı, özel ekipman güveniyor Ekranları. Sözde yüksek içerik tarama yüksek çözünürlük, sayısal görüntüleme ama konfokal mikroskopi 7,8 donanımlı özel plaka okuyucu kullanarak maliyetle yarar sağlar. Bu yöntemin amacı, zebra balığı embriyolar otomatik olarak analiz dokuya özel floresan etmektirStandart bir epifluorışıma mikroskobu kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde. Doku spesifik floresan bu tekniği kullanarak ayırt edilebilir ve özel plaka okuyucu veya yüksek içerik tarama donanımları ulaşamadıkları laboratuvarlar için makul bir yaklaşım olabilir.
Bu protokol, biz 3 gün sonra döllenme (DPF) doku-spesifik östrojen reseptörü (ER) canlı zebrabalıkları agonistleri algılamak için otomatik görüntüleme kullanın. Transgenik satır Tg (5xERE: GFP) c262/c262 yeşil floresan protein (GFP) akış yukarı 5 tandem östrojen tepki elemanı DNA dizileri (ERE) içeren 3. Ligandın yokluğunda, ER normal olarak etkin değildir. Ligand bağlayıcı bir reseptör ERE DNA bağlama ve transkripsiyonu düzenleyen 9 sağlayan uygun bir değişiklik başlatır. 5xERE: GFP balık ER modülatörleri için kimyasal kütüphanelerinin taranması için kullanılabilir ve östrojenik kirletici maddeler için çevre su örnekleri taranması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol Birmingham Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi de Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1.. Zebra balığı Yetiştiriciliği ve Yumurta Koleksiyonlar
- Üç gün kimyasal maruz başlamadan önce, ayrı erkek ve kadınlar için bölücüler ile üreme tankları monte. Yetiştiricilik sistemi su ile her bir tank yarıya doldurun. Bir bölücü ayırarak her tankta 2 erkek ve 3 kadın yerleştirerek, üreme tanklarında c262/c262 balık: Bir ağının kullanılması, Tg (GFP 5xERE) aktarmak. Her tankın üzerinde bir kapak yerleştirin ve tarih ve çapraz olmak üzere suşları ile etiket.
- Ertesi sabah, bütün engelleri kaldırmak ve eğim üreme tankının bir ucunda sığ bir alan yaratmak için perdeler. Zebra balığı kesin gelişimsel evreleme sağlamak için 10 dk aralıklarla embriyolar toplama, çiftleşmek için izin verin. Petri kapları içine E3B orta ve nazikçe yıkayın embriyolarını kullanarak bir çay süzgeci ile durulayarak temizleyin yumurta. Kalıcı yetişkin balık dönüntanklar.
- Diseksiyon mikroskop kullanarak, sıralama, sayma, ve herhangi bir, döllenmemiş anormal veya hasarlı embriyolar kaldırmak. Karanlık döngüsü: 14:10 ışık ile 28.5 ° C'de E3B orta ve evde Petri kapları içinde yer embriyolar. Embriyo yoğunluk gelişimini etkileyebilir. 60 x 15 mm tabak içinde bir 100 x 35 mm tabak en fazla 100 embriyolar ve en fazla 50 embriyolar yerleştirin.
- 24 hpf tarafından, 200 uM 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) içeren E3B ile medya değiştirin. PTU pigment oluşumunu önler ve zebra balığı embriyolar ve gelişmiş görüntü netliği için şeffaf larva tutar. DİKKAT: konsantre PTU stok tehlikelidir; E3B + PTU çözüm yaparken eldiven giyin.
- 1 gün sonrası döllenme (DPF), elle ince forseps kullanarak her embriyo koryon çıkarın. Koryon östrojenlerin penetrasyonu etkileyecektir görünmüyor, ancak kaldırma görüntü netliğini artırır. Medyadan chorions kaldırmak için bir ihtiyaç vardır. Not: el Dechorionation için bir alternatif olarak, embriyo toplu che edilebilir11, daha önce tarif edildiği gibi mically, 1 mg / ml pronaz tedavi ile dechorionated.
Embriyoların 2. Kimyasal Arıtma
- İşlemden önceki gün, 1000-kat DMSO konsantrasyonu (ya da uygun bir çözücü) her kimyasal stok çözelti hazırlayın. Örneğin, 10 uM, bisfenol A (BPA) için embriyolar maruz% 100 DMSO içinde bir 10 mM stok solüsyonu BPA hazırlamak. Bu, her bir tedavi muntazam bir DMSO konsantrasyonu sağlar ve DMSO içinde, toksik olmayan bir 1:1000 seyreltme, bir vasıta kontrolü olarak hizmet sağlar. -20 ° C'de Mağaza stok çözümleri Bu protokol için, embriyolar 1 ve 10 uM BPA, 18.5 nM ve 1.85 mcM genistein, 367 nM östradiol (pozitif kontrol) ve araç (% 0.1 DMSO, negatif kontrol) maruz kalacağı.
DİKKAT: BPA ve östradiol gibi kimyasallar tehlikeli ve insan fetus üzerinde zararlı etkileri olabilir. Dikkatle endokrin bozucular Kulp ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. - Tedavi gününde, çözülme hazır kimyasal çözeltiler hazırlanabilir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 1 ml E3B + PTU pipetlenerek ve stok kimyasal çözelti 1 ul ekleyerek 1:1,000 sulandırmak. Vortex şiddetle. Bir vasıta kontrolü olarak E3B + propiltiyourasil'i içine DMSO 1:1000 seyreltin. İşlem yapılmamış bir kontrol olarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 1 mL E3B + PTU kullanın.
- 96 oyuklu bir plakanın her bir geniş çaplı plastik bir transfer pipeti, Petri tabaklarına transfer embriyolar kullanılarak, embriyolar per 3 de, durum başına 3 kuyu. Uzun süreli tedavi sırasında buharlaşmasını önlemek için, plakanın dış satırlar ve sütunlar (satırlar A ve E, kolon 1 ve 12) 'dan embriyolar sayın. Dış kuyu E3B + PTU 300 ul ile doldurulabilir. Uygun plaka kapağı etiketleyin.
- Ince uçlu bir plastik transfer pipet ile her kuyu bulunan ortamı çıkarın. Embriyoların kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışır.
- De karşılık gelen muamele çözeltisinin 200 ul ekleyin. Unde kapağı yerleştirinuygun kuyulara ilave tedaviler sağlamak için bir kılavuz olarak plaka rneath. Vortex her tüp çözelti içinde kimyasal dağıtmak için pipetleme önce. Görsel olarak, her embriyo muamele çözeltisi içinde olduğunu teyit. Embriyolar kuyunun tarafında ise, muamele çözeltisi ile iyice içine yıkamak için temiz bir aktarma pipeti kullanın.
- 28.5 ° C'de inkübatör plaka koyun Embriyolar 72 hpf floresan için analiz edilecektir.
96 oyuklu plakalar içinde Embriyolar 3. Otomatik Görüntüleme
- Her bir oyuğa, 4 mg / ml tricaine 10 ul ekleyerek embriyolar anestezisi.
NOT: önce görüntüleme embriyolar anestezisi. 24-96 hpf, zebra balığı kendiliğinden hareket ve görüntü çekimi sırasında değişen ışık kaynağına bir irkilme tepkisi gösterirler. Embriyoların anestezi görüntüleme sırasında hareket azaltır. - Motorlu aşamasında 96 oyuklu plaka yerleştirin ve sahne kalibre edin. Zeiss Zen Mavi mikroskopi Automati için 2011 yazılımı kullanmave kontrol, numune taşıyıcı seçeneğini seçin ve çukurlu 96 seçin. kalibre seçin. Sahne kalibre adım adım yönergeleri izleyin.
NOT: Bu adımdan sonra kiremit düğmesini işaretini kaldırın etmeyin. Fayans düğmesi işaretli ise, kalibrasyon ayarları kaybolabilir ve 96-plaka yeniden kalibre edilmesi gerekir. - Ayarı (BF), 10x objektif ve aydınlık kullanarak, bir pozitif kontrol embriyo tespit ve floresan sinyal kamerayı doyurarak değil emin, BF ve GFP kanallar için uygun pozlama ayarlarını. Tek embriyo odaklanın ve toplam 3 Z-bölümleri, yukarıda bir görüntü 50 mikron ve mevcut odak düzleminin altında bir 50 um elde etmek için mikroskop programlamak.
NOT: Farklı dokular farklı odak düzlemleri işgal Çünkü her zebrabalıkları görüntüleri odak kalp ve karaciğer ile yakalanan için, bu sağlayacaktır. - GFP ve BF channe kullanarak bir kiremitli bir görüntü elde etmek için yazılım parametrelerini ayarlayınls. Satın alma sekmesi altında, gelişmiş ayarları seçin. Seç karo bölgeler, daha sonra fayans. Daire iyi seçeneği seçin.
NOT: Fayans her oyuğa bileşik bir görüntü oluşturmak için kullanılır. Tek bir alan-of-view her iyi sadece küçük bir kısmını yakalar. Fayans fonksiyonu otomatik olarak tüm kuyunun bir kompozit görüntü oluştururken, alanlar-görünümü her kuyudan birden fazla bitişik yakalayabilir. Her kompozit görüntü tek bir kuyudan birkaç düzine bireysel görüntüleri içeren nerede, otomatik olarak plaka başına 96 kompozit görüntüler yakalamak mümkündür. - Taşıyıcıyı seçmek ve faktör% 90 doldurun. % 90 dolgu faktörü belirlemek, her bir kuyunun alanının% 90, kompozit görüntüde görülebilir olacağı seçilmiş kuyucuklara birden fazla çekim olacaktır.
Not: dolgu faktörü seçilirken, bir diyagramdır, görüntülenecek olan alanı temsil görüntülenecektir. Kuyunun alanını içerecek bir yüzdesini seçinbu deney için uygundur. - Seçenekleri altında, istenilen örtüşme miktarını seçin.
NOT: Tek bir temsili görüntü için birlikte fayans Dikiş zaman,% 5-10 bir örtüşme görüntüleri arasında düzgün bir dikiş sağlar. Görüntü dikiş gereksiz Ancak,% 0 örtüşme kullanarak görüntüleme süresini azaltacaktır. % 90 dolgu faktörü ve% 5 üst üste kullanılarak, tek bir kuyunun bir kompozit görüntü 59 tek tek görüntü oluşur. - Görüntüleme başlayın. Mikroskop görüntüleri otomatik olarak kazanacaklardır.
- Elle doku-spesifik floresan için de her kompozit görüntüler (Şekil 1) inceleyin.
- NOT: Bu kimyasal maruziyet öncesinde deneysel tedavi kuyuları gözlemleyerek çalıştı onaylamak için pozitif kontrol ile başlamak en iyisidir.
96 oyuklu bir plaka içerisinde Embriyolar 4. Manual Resim yakalama
NOT: sonuçlarını onaylamak ac için 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanmak içinquire daha detaylı görüntüleri manuel (Şekil 2).
- Ayarı (BF), 20x objektif ve aydınlık kullanarak, bir pozitif kontrol embriyo tespit ve floresan sinyal kamerayı doyurarak değil emin, uygun BF ve GFP kanalları için pozlama ayarlarını.
- Elle tek tek embriyo ve yakalama görüntüleri tespit.
NOT: pozlama ayarları pozitif kontrol embriyo için seçildikten sonra, ayarları değiştirmek yok. Her bir görüntü muntazam koşullar altında yakalanır gibi bu floresan yoğunluğunun bir karşılaştırma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bir 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğinden bileşik görüntüleri gösterir. Her kompozit görüntü% 5 görüntü bindirme ile 59 ayrı görüntü oluşur. Canlı Zebrafish de her biri içinde rastgele odaklı, henüz biz karaciğer kalp floresan ayırt edebiliyoruz unutmayın. Zebra balığı aydınlık görsel yönünü belirlemek ve morfolojik anormallikleri (Şekil 1 A ve 1 C) görselleştirmek için referans olarak yararlıdır. 10x objektif kullanılarak otomatik görüntüleme kimyasallar ekran ve daha yüksek büyütmede manuel değerlendirmeyi gerektirecek belirlemek için kullanılır. Şekil 2 daha detaylı bir analiz için bir 20x uzun çalışma mesafesi objektif ile çekilen görüntüleri gösterir. Bu görüntüler mikroskop aşamasından plaka çıkarmadan, Şekil 1 de gösterilen otomatik tarama hemen sonra alınmıştır. 20x objektif kullanılarak, kalbinde floresan tam kalp val lokalize olabilirves (Şekiller 2C-2F). Bazen, embriyoların yönelim görüntüleri yakalamak için alt-optimal olabilir ve belirsiz sonuçlara yol açabilir. Kuyunun başına 3 zebrafish yerleştirerek ve üçlü olarak her tedavi (protokol adım 2.3) gerçekleştirerek doğru floresan görselleştirmek için birden fazla fırsatlar sunar.
.. Şekil 1. Otomatik kompozit görüntüleme kalp kapakçıkları ve karaciğer aydınlık (A, C) ve floresan doku-spesifik floresan ortaya koymaktadır (B, DH) Tg görüntüleri (5xERE: GFP) 2 gün de belirtilen kimyasallar ile tedavi c262/c262 embriyolar Mesajı fertilizasyon (DPF) ve 3 dpf'e görüntülendi. Her panel,% 5 ile 59 tek tek görüntülerin oluşan tek bir kuyu (bileşik bir görüntüsünü gösterir96 oyuklu bir plaka üst üste gelir). A ve B,% 0.1 DMSO (taşıt kontrol) inkübe embriyolar GFP-negatif. CH, embriyolar 100 ng / ml 17β-estradiol (E2), 1.85 uM genistein (gen) ile inkübe , ya da kalp kapakçığı (oklar) ve karaciğer (ok uçları) 10 uM BPA sergi floresan, 18.5 nM gen veya 1 iM BPA sergi kalp kapakçıkları floresan değil karaciğer ile tedavi embriyolar. B ', bir paneli B. D kutulu bölgeden tek larva dijital büyütülmüş görüntü' böylece panel D kutulu bölgesinden dijital büyütülmüş görüntü, ve. = 500 mikron Ölçek çubuğu. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, zebra balığı embriyolar otomatik görüntü dokuya özel floresan için basit bir yöntem tarif edilir. Protokol, bir Zeiss Axio Observer kullanılarak geliştirilmiştir. Z1 Zen Blue 2011 yazılım ile, ancak teknik kompozit görüntüler oluşturmak için fayans gerçekleştirebilirsiniz motorlu bir sahne ve mikroskop kontrol yazılımı ile herhangi bir ters mikroskop kullanılarak adapte edilebilir. Motorlu bir sahne ile ters bir mikroskop donatılması yüksek içerik tarama için özel ekipman satın alma için pratik, daha az pahalı bir alternatif sağlayabilir. Motorlu aşamaları aşamasında mikroskop ve kalite marka ve modeline bağlı olarak, birkaç bin ABD doları onbinlerce değişir.
Protokol içinde birkaç önemli adım vardır. Bazı kimyasallar böylece tedavi sırasında karanlıkta embriyolar inkübe için yararlı olabilir, ışığa karşı duyarlıdır. Zebrafish embriyolar kuruma duyarlıdır. Bu nedenle, kimyasal içincal riski, bir günden fazla süren buharlaşmaya (protokol adım 2.3) sınırlamak için ortam ile 96 oyuklu plaka kenarları boyunca kuyu doldurmak için çok önemlidir.
Bu aşama dikkatlice (protokol adım 3.2) kalibre sağlamak için de önemlidir. Yaygın bir hata tamamen plakasını güvence olmadan sahneye plaka yerleştirmektir. Sahne hareket Bu durumda, sahnede plakanın pozisyonu bazı kuyular tüm kısmen veya görüntülü neden olabilir, hangi değiştirebilirsiniz. Arka arkaya birkaç görüntüleme levhaları, bu sürece plakalar aynı üreticinin ve tüm yönlerde aynı aşamada yerleştirilir gibi, her plaka için sahne yeniden kalibre etmek için mutlaka gerekli değildir.
Otomatik görüntü fayans parametreleri (protokol adım 3.5) ayarlarken, her bir çoğunluğu iyi görüntülü olmasını sağlamak. 3 dpf'e ve yaşlı at, Zebra balığı larvaları wel kenarlarına yakın kendilerini konumlandırmak için eğilimindedirl, bu nedenle% 90 dolgu faktörü, her çukurun kenarları görüntülenebilmektedir sağlamak için önerilir. Bununla birlikte, dolgu faktörü daha fazla görüntü elde etmek için daha büyük bir zaman.
Bu çözünürlüğü artırmak için kompozit görüntülerde bir dikiş algoritması gerçekleştirmek mümkündür. Bir dikiş algoritması gerçekleştirilir edilecekse, o zaman% 5-10 görüntü üst üste (protokol adım 3.6) eklemek için döşeme parametrelerini ayarlamak. Örtüşme ne kadar yüksekse, dikiş algoritması daha iyi performans. Bazı durumlarda,% 10 bindirme dikiş daha yüksek bir büyütme objektif kullanılarak daha da görselleştirme gerektirmeyen analiz için bir bilgi görüntü üretmek için izin verebilir. Ancak, daha uzun süre görüntü toplama fazla resim gibi, alacak örtüşme de başına Çekilecek. % 0 bir örtüşme görüntü alma süresini azaltmak için ve floresan ışık pozlama ve photobleaching en aza indirmek için kullanılabilir. Bu durumda, 20x objecti kullanılan bazı kuyuların daha ayrıntılı görüntülerini yakalamakA.Ş. (Şekil 2).
Bu protokol için görüntü yakalama zamanı deney parametrelerinin bağlıdır. Bu protokol parametreleri kullanarak görüntü elde etme (% 90 dolgu faktörü,% 5 örtüşme, üç çekilen görüntü başına z-kesitler ve GFP kanal için 50 msn ve aydınlık kanal için 1 milisaniye bir pozlama süresi) üç dakika elli saniye sürer kuyu başına. Bu nedenle, üç saat elli dakikada 60 kuyu taranması mümkündür. Bu, gün başına 180 kuyu ya da üç kopya halinde 60 benzersiz bileşiklerin taranması için uygundur.
Bu protokol, doku spesifik floresan için otomatik görüntüleme sağlar ancak çeşitli sınırlamalar vardır. Widefield floresan görüntüleme çok yüksek içerik tarama teknikleri kullanılan konfokal görüntüleme çözünürlüğü yoksun. Ayrıca, floresans kantitasyon dolayı da iyi içinde her zebrabalıkları yönlenmesine yüksek değişkenlik zordur. Bu üniforma altında zebrafish görüntüleme ile önlenebilecekyönlendirme koşulları, kalıplar kullanılarak ya da mikro-homojen yönelimleri 5,10 içine zebra balığı embriyolar kuvvet kuyucuklu örneğin. Görüntü elde etme süresi 180 günde elenebilmektedir kuyu sayısı. Günde 180 kuyu Eleme manuel görüntüleme üzerinde önemli bir gelişmedir sınırlar. Ancak, tipik yüksek verimlilik yöntemleri günde 10.000 kuyuların ortalama ekran değil, karmaşık ve pahalı iş istasyonları gerektirebilir.
Bu protokol kolayca ters bir widefield floresan mikroskop ile laboratuvarlar tarafından adapte edilebilir, yüksek içerik tarama için pratik, daha az pahalı bir alternatif temsil eder. Burada tarif edilen bir görüntüleme yöntemi büyük ölçüde örnek hazırlama hızı ve kolaylığını da iyileştirir dikkatli bir şekilde monte edilmiş ya da yönlendirilmiş edilmemiştir embriyolarda dokuya özel floresans analizi sağlar. Kompozit görüntüler referans için arşivlenir. Bu protokol, yüksek verimli tarama, O sağlamak için geliştirilmiştirkimyasal kütüphaneler ve çevresel su örneklerinden f dokuya özel östrojen reseptörü ligandları. Seçenek olarak ise, bu görüntüleme protokol dokuya spesifik aktivitesi için herhangi bir flüoresan raportör taranması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir maddi çıkarları var.
Acknowledgments
Biz Susan Çiftçi ve Zebra balığı bakımı için UAB Zebrafish araştırma tesisi çalışanlarına teşekkür ederiz. Farmakoloji ve Toksikoloji Bölümü start-up fonları tarafından Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm plates | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17.2 grams KCl - 0.76 grams CaCl2-2H2O - 2.9 grams MgSO4-7H2O - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150 ml 2% methylene blue 100 μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
- Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
- Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
- Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
- Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).
