组织特异性荧光的斑马鱼胚胎半自动成像
Summary
这里描述的是一种协议，组织特异性荧光的斑马鱼胚胎半自动化成像。
Abstract
斑马鱼的胚胎是一个强大的工具，用于小分子的大规模筛选。表达荧光报告蛋白的转基因斑马鱼经常被用来鉴定调节基因表达的化学品。化工屏幕，测定荧光活斑马鱼往往依赖于昂贵，专用设备高内涵筛选。我们描述了使用标准的落射荧光显微镜的过程与电动载物台自动图像斑马鱼胚胎和检测组织特异性的荧光。利用转基因斑马鱼是通过GFP的表达报道雌激素受体的活性，我们开发了一种半自动化的程序来筛选雌激素受体的配体激活的记者在一个组织特异性方式。在这段视频中，我们描述了在96孔板排列斑马鱼胚胎在24-48小时后受精（HPF），并补充说，结合雌激素受体的小分子过程。在72-96个高倍视野，每个图像以及从整个板被自动收集并手动检查组织特异性荧光。该协议表明，检测雌激素激活受体在心脏瓣膜，但不能在肝脏的能力。
Introduction
转基因斑马鱼已经开发了允许活动的直接可视化在信号通路，如成纤维细胞生长因子1，视黄酸2和雌激素3，在活的胚胎。这些工具使筛选任何干扰信号传导途径的化学品（如测定变化的荧光强度），或者该调制信号以组织特异性的方式（在荧光定位变化）4化学品。自动图像捕捉提高化学屏幕吞吐量大幅5,6。屏幕在现场斑马鱼自动检测荧光往往依赖于昂贵的专门设备。所谓高内涵筛选提供了高解析度，定量成像，但在使用专门的平板阅读器配备的共聚焦显微镜7,8的成本效益。该方法的目标是自动地检测组织特异性荧光在斑马鱼胚胎在使用标准的落射荧光显微镜用96孔板中。组织特异性的荧光可以使用这种技术来区分，可能是缺乏获得专门的平板阅读器或高内涵筛选设备实验室一个合理的方法。
在这个协议中，我们使用自动成像技术来检测组织特异性雌激素受体（ER）在活斑马鱼激动剂3天受精后（DPF）。转基因品系的Tg（5xERE：GFP）c262/c262包含5个串联的雌激素反应元件的DNA序列（ERE）的绿色荧光蛋白（GFP）的上游侧3。在没有配体时，预期结果通常无效。配体结合触发的构象变化，使受体结合ERE DNA和调节转录9。 5xERE：GFP的鱼可以用来筛选ER调节剂的化学库，可用于筛选环境水样的雌激素污染物。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议描述了一个简单的方法来自动图像组织特异性的荧光斑马鱼胚胎。该协议是使用蔡司Axio上观察发展。 Z1的禅蓝2011软件，但该技术可以使用任何倒置显微镜电动载物台和显微镜控制软件，可以进行平铺，以创建复合图像调整。装备倒置显微镜具有机动阶段可以提供一个实用，更便宜的替代品购买专用设备，高内涵筛选。电动载物台的范围从几千元到数万美元，这取决于在舞台上的显微镜和?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢苏珊农民和UAB的斑马鱼研究设施的斑马鱼护理的工作人员。从药理学和毒理学部提供的启动资金资助。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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