Summary
Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.
Abstract
Embrioni di zebrafish sono un potente strumento per lo screening su larga scala di piccole molecole. Zebrafish transgenico che esprimono proteine reporter fluorescenti sono spesso utilizzati per identificare le sostanze chimiche che modulano l'espressione genica. Schermi chimici che saggio fluorescenza in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate per lo screening ad alto contenuto. Descriviamo una procedura utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard con un palco motorizzato per l'immagine automaticamente embrioni di zebrafish e rilevare la fluorescenza tessuto-specifica. Utilizzando zebrafish transgenico che segnala l'attività del recettore degli estrogeni attraverso l'espressione di GFP, abbiamo sviluppato una procedura semi-automatica per schermare per ligandi del recettore degli estrogeni che attivano il giornalista in maniera tessuto-specifica. In questo video si descrivono le procedure per arraying embrioni di zebrafish a 24-48 ore dopo la fecondazione (HPF) in una piastra a 96 pozzetti e l'aggiunta di piccole molecole che legano i recettori degli estrogeni. A 72-96 hpf, immagini di ogni bene dal'intera piastra vengono raccolte automaticamente e controllato manualmente per fluorescenza tessuto-specifica. Questo protocollo dimostra la capacità di rilevare estrogeni che attivano i recettori in valvole cardiache ma non nel fegato.
Introduction
Zebrafish transgenici sono stati sviluppati che consentono la visualizzazione diretta di attività in vie di segnalazione, quali fattori di crescita dei fibroblasti 1, acido retinoico 2 e 3 estrogeni, in embrioni vivi. Tali strumenti consentono di screening per sostanze chimiche che perturbano vie di segnalazione (dosati come cambiamento di intensità di fluorescenza) o per le sostanze chimiche che modulano segnalazione in modo tessuto-specifico (cambiamento di localizzazione fluorescenza) 4. La cattura delle immagini automatica aumenta il throughput di schermi chimici drammaticamente 5,6. Schermi che la fluorescenza saggio automaticamente in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate. Cosiddetto screening ad alto contenuto offre il vantaggio di alta risoluzione, imaging quantitativo ma a costo di usare lettori di piastre specializzati attrezzati per microscopia confocale 7,8. L'obiettivo di questo metodo è quello di dosaggio fluorescenza automaticamente tessuto-specifica in embrioni di zebrafishin una piastra a 96 pozzetti utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. Fluorescenza tessuto-specifica può essere distinto con questa tecnica e può essere un approccio ragionevole per i laboratori che non hanno accesso ai lettori di piastre specializzati o apparecchiature ad alto contenuto di screening.
In questo protocollo, utilizziamo l'imaging automatizzato per rilevare il recettore degli estrogeni tessuto-specifica (ER) agonisti in zebrafish vivo in tre giorni dopo la fecondazione (dpf). La linea transgenica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 tandem risposta estrogenica elemento sequenze di DNA (ERE) a monte della proteina fluorescente verde (GFP) 3. In assenza di ligando, ER sono normalmente inattive. Legame del ligando innesca un cambiamento conformazionale, che permette recettori legano il DNA ERE e regolano la trascrizione 9. 5xERE: pesce GFP possono essere usati per lo screening librerie chimiche per modulatori ER e possono essere usati per lo screening campioni di acqua ambientale per contaminanti estrogenici.
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Protocol
NOTA: Questo protocollo è stato approvato dalla University of Alabama a Birmingham Institutional Animal Care ed uso comitato.
1. Allevamento Zebrafish e collezioni Egg
- Tre giorni prima di iniziare esposizioni chimiche, montare vasche di allevamento con divisori per maschi e femmine separati. Riempire ogni metà serbatoio con acqua sistema di acquacoltura. Utilizzando una rete, trasferire Tg (5xERE: GFP) i pesci c262/c262 a vasche di allevamento, mettendo 2 maschi e 3 femmine in ciascun serbatoio separato da un divisorio. Mettere un coperchio su ogni serbatoio e l'etichetta con la data e le tensioni da attraversare.
- La mattina seguente, rimuovere tutte le barriere e inclinazione deflettori per creare una zona poco profonda ad una estremità della vasca di allevamento. Lasciare zebrafish per accoppiarsi, la raccolta di embrioni a intervalli di 10 min per assicurare precisione messa in scena dello sviluppo. Uova Clean di risciacquo attraverso un colino da tè con E3B medio e embrioni filo delicatamente in piastre di Petri. Ritorno pesci adulti di permanenteserbatoi.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, ordinare, contare, e rimuovere gli embrioni non fecondate, anomali o danneggiati. Luogo embrioni in piastre di Petri in E3B medio e casa a 28,5 ° C con 14:10 di luce: ciclo scuro. Densità embrione può influenzare lo sviluppo. Mettere non più di 100 embrioni in un piatto mm 100 x 35 e non più di 50 embrioni in un piatto mm 60 x 15.
- Entro il 24 hpf, sostituire il supporto con E3B contenente 200 mM 1-fenil 2-tiourea (PTU). PTU previene la formazione di pigmenti e mantiene embrioni di zebrafish e larve trasparenti per una migliore chiarezza di immagine. ATTENZIONE: concentrato PTU magazzino è pericoloso; indossare i guanti quando si effettua soluzione E3B + PTU.
- Al 1 ° giorno dopo la fecondazione (dpf), rimuovere manualmente il corion da ogni embrione utilizzando una pinza sottile. Il corion non sembra influenzare la penetrazione degli estrogeni, tuttavia rimozione migliora la nitidezza delle immagini. Non vi è alcuna necessità di rimuovere chorions dal supporto. NOTA: In alternativa alla dechorionation manuale, lotti di embrioni possono essere Chémically dechorionated usando 1 mg / ml pronasi trattamento, come descritto in precedenza 11.
2. Trattamento chimico di embrioni
- Il giorno prima del trattamento, preparare soluzioni madre di ogni prodotto chimico in concentrazione di 1.000 volte in DMSO (o solvente appropriato). Ad esempio, per esporre embrioni per 10 pM bisfenolo A (BPA), preparare una soluzione madre BPA 10 mM in 100% DMSO. Questo assicura concentrazione DMSO uniforme in ogni trattamento e permette una 1:1000 diluizione non tossico di DMSO per servire come un controllo del veicolo. Le soluzioni Negozio di archivi a -20 ° C. Per questo protocollo, embrioni saranno esposti a 1 mM e 10 mM BPA, 18,5 nM e 1,85 pM genisteina, 367 nM di estradiolo (controllo positivo) e il veicolo (0,1% DMSO, controllo negativo).
ATTENZIONE: Sostanze chimiche come il BPA e estradiolo sono pericolosi e possono avere effetti deleteri sul feto umano. Maneggiare interferenti endocrini con cura e usare sempre un equipaggiamento di protezione personale. - Il giorno del trattamento, disgelo preparato archivi soluzioni chimiche. Diluire 1:1.000 pipettando 1 ml E3B + PTU in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e l'aggiunta di 1 ml di soluzione madre chimica. Vortex vigorosamente. Diluire DMSO 1:1000 in E3B + PTU come un controllo del veicolo. Utilizzare 1 mL E3B + PTU in una provetta da 1,5 ml come un controllo non trattato.
- Usando una grande pipetta di plastica foro, trasferimento di embrioni da piastre di Petri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, 3 embrioni per pozzetto, 3 pozzi per ogni condizione. Per evitare l'evaporazione durante il trattamento prolungato, omettere embrioni da righe e colonne esterne della piastra (righe A ed E, colonne 1 e 12). Pozzi esterni possono essere riempiti con 300 ml di E3B + PTU. Etichettare il coperchio piatto in modo appropriato.
- Rimuovere i supporti da ogni pozzetto con una multa a punta pipetta di trasferimento di plastica. Lavorare velocemente per evitare di seccare gli embrioni.
- Aggiungere 200 ml di soluzione di trattamento in corrispondenti bene. Mettere il coperchio underneath la piastra come guida per garantire aggiunta di trattamenti nei pozzetti appropriati. Vortex ogni provetta prima di pipettare di distribuire il prodotto chimico in soluzione. Visivamente confermare ogni embrione è nella soluzione di trattamento. Se gli embrioni sono sul lato del pozzo, utilizzare una pipetta pulita per lavarli nel pozzetto con la soluzione di trattamento.
- Porre la piastra in incubatore a 28,5 ° C. Gli embrioni saranno analizzate per fluorescenza a 72 HPF.
3. Automated Imaging di embrioni in piastre con 96 pozzetti
- Anestetizzare embrioni aggiungendo 10 ml di 4 mg / ml tricaine a ciascun pozzetto.
NOTA: Anestetizzare gli embrioni prima di imaging. A 24-96 hpf, zebrafish esporre movimento spontaneo e una risposta ad uno stimolo alla fonte di luce che cambia durante l'acquisizione delle immagini. Anestetizzante embrioni riduce il movimento durante l'imaging. - Posizionare la piastra a 96 pozzetti in fase motorizzato e calibrare lo stadio. Utilizzando Zeiss Zen Blu software 2011 per la microscopia automaticamentesu e controllo, selezionare l'opzione porta-campioni e selezionare multiwell 96. Selezionare Calibra. Seguire le istruzioni graduali per calibrare il palco.
NOTA: Non deselezionare il pulsante di piastrelle dopo questo passaggio. Se il pulsante piastrelle è deselezionata, le impostazioni di calibrazione possono essere persi e la piastra a 96 pozzetti dovranno essere ricalibrato. - Utilizzando un obiettivo 10x e il campo chiaro (BF) impostazione, identificare un embrione controllo positivo e configurare le impostazioni di esposizione appropriato per BF e canali GFP, facendo in modo che il segnale di fluorescenza non è saturare la fotocamera. Concentrarsi su un unico embrione e programmare il microscopio per acquisire 3 totali Z-sezioni, una immagine 50 pm sopra e una 50 micron sotto il piano focale corrente.
NOTA: Poiché i vari tessuti occupano diversi piani focali, questo farà sì che per ogni immagine zebrafish vengono catturate con il cuore e il fegato a fuoco. - Impostare i parametri del software per acquisire un'immagine in maiolica con GFP e BF channels. Nella scheda di acquisizione, selezionare la configurazione avanzata. Selezionare le regioni piastrelle, poi le piastrelle. Scegli l'opzione cerchio bene.
NOTA: Piastrelle viene utilizzato per creare un'immagine composita di ogni bene. Un campo di vista singolo cattura solo una piccola parte di ogni pozzetto. La funzione di segmentazione in grado di catturare automaticamente aerei adiacenti da ciascun pozzetto campi di vista, creando un'immagine composita di tutto il bene. È quindi possibile catturare automaticamente 96 immagini composite per piastra, dove ogni immagine composita contiene diverse decine di immagini singole di un singolo pozzetto. - Selezionare vettore e fattore di riempimento del 90%. Selezione di un fattore di riempimento del 90% di catturare immagini multiple dei pozzetti scelti in modo che il 90% della superficie di ciascun pozzetto sarà visibile nell'immagine composita.
NOTA: Quando si seleziona fattore di riempimento, un diagramma verrà visualizzato rappresentante l'area da acquisire. Selezionare una percentuale che includerà la zona del pozzoche è appropriato per l'esperimento. - In Opzioni, selezionare la quantità di sovrapposizione desiderato.
NOTA: Quando cucire insieme le piastrelle per una singola immagine rappresentativa, una sovrapposizione di 5-10% consente una cucitura uniforme tra le immagini. Tuttavia, se l'immagine cuciture è inutile, con una sovrapposizione 0% ridurrà il tempo di imaging. Uso 90% fattore di riempimento e 5% di sovrapposizione, un'immagine composita di un singolo pozzetto consiste di 59 immagini singole. - Inizia imaging. Il microscopio acquisirà automaticamente le immagini.
- Ispezionare manualmente immagini composite di ogni pozzetto per fluorescenza tessuto-specifico (Figura 1).
- NOTA: E 'meglio iniziare con il controllo positivo per confermare che l'esposizione chimica ha lavorato prima di osservare i pozzi trattamento sperimentale.
4. Manuale Acquisizione Immagine di embrioni in piastra a 96 pozzetti
NOTA: Per confermare i risultati, utilizzare un obiettivo 20x lunga distanza di lavoro a corrente alternataquaderno immagini più dettagliate manualmente (Figura 2).
- Utilizzando un obiettivo 20x e il campo chiaro (BF) impostazione, identificare un embrione controllo positivo e configurare le impostazioni di esposizione per i canali BF e GFP in modo appropriato, facendo in modo che il segnale di fluorescenza non è saturare la fotocamera.
- Identificare le singole embrioni e catturare immagini manualmente.
NOTA: Una volta che le impostazioni di esposizione sono state selezionate per l'embrione controllo positivo, non modificare le impostazioni. Questo consente un confronto dell'intensità di fluorescenza come ogni immagine viene catturata in condizioni uniformi.
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Representative Results
La Figura 1 mostra immagini composite di singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Ogni immagine composita è composto di 59 immagini singole con 5% immagine sovrapposizione. Si noti che il zebrafish vivo sono orientati in modo casuale all'interno di ogni bene, ma siamo in grado di distinguere la fluorescenza nel cuore dal fegato. Immagini Brightfield sono utili come riferimenti per valutare l'orientamento zebrafish e visualizzare anomalie morfologiche (Figure 1A e 1C). Imaging automatico utilizzando un obiettivo 10x è usata per selezionare chimici e determinare quale garantisce valutazione manuale con un ingrandimento maggiore. Figura 2 mostra le immagini catturate con un obiettivo lunga distanza di lavoro 20x per un'analisi più dettagliata. Queste immagini sono state scattate subito dopo la scansione automatizzata illustrato nella figura 1 senza rimuovere la piastra dal palco microscopio. Utilizzando un obiettivo 20x, la fluorescenza nel cuore può essere localizzato proprio a val cuoreves (Figure 2C-2F). Occasionalmente, l'orientamento degli embrioni può essere sub-ottimale per catturare le immagini e può portare a risultati ambigui. Posizionamento 3 zebrafish per bene e l'esecuzione di ogni trattamento in triplice copia (protocollo step 2.3) offre molteplici possibilità di visualizzare con precisione la fluorescenza.
. Figura 1 Automated Imaging composito rivela fluorescenza tessuto-specifica delle valvole cardiache e del fegato Brightfield (A, C) e fluorescenti (B, DH) le immagini di Tg (5xERE: GFP). Embrioni c262/c262 trattati con sostanze chimiche indicate a 2 giorni dopo fecondazione (dpf) e ripreso alle 3 dpf. Ogni pannello mostra un'immagine composita di un singolo bene (composta da 59 singole immagini con il 5%sovrapposizione) da una piastra a 96 pozzetti. A e B, embrioni incubate nello 0,1% DMSO (controllo del veicolo) sono GFP-negativi. CH, embrioni incubati con 100 ng / ml 17β-estradiolo (E2), 1,85 micron genisteina (gen) , o 10 mM BPA mostra fluorescenza nelle valvole cardiache (frecce) e del fegato (punte di freccia), embrioni trattati con 18,5 nM gen o 1 micron BPA mostra fluorescenza valvole cardiache, ma non il fegato. B ', immagine ingrandita digitalmente di una singola larva dalla regione scatola in pannello B. D', immagine ingrandita digitalmente da regione scatola del pannello D, e così via. Barra della scala = 500 micron. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice per automaticamente immagine di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish. Il protocollo è stato sviluppato utilizzando un Zeiss Axio Observer. Z1 con Zen software Blu 2011, ma la tecnica può essere adattata utilizzando qualsiasi microscopio invertito con un palco motorizzato e software di controllo del microscopio in grado di eseguire piastrelle per creare immagini composite. Dotare un microscopio invertito con una fase motorizzato può fornire una pratica alternativa meno costosa per l'acquisto di attrezzature specializzate per lo screening ad alto contenuto. Fasi motorizzate variano da alcune migliaia a decine di migliaia di dollari, a seconda della marca e del modello del microscopio e della qualità del palco.
Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo. Alcune sostanze chimiche sono sensibili alla luce, quindi può essere utile per incubare gli embrioni nel buio durante il trattamento. Embrioni di zebrafish sono sensibili alla disidratazione. Pertanto, per chimicocal esposizioni dura più di un giorno è fondamentale per riempire i pozzetti lungo i bordi della piastra a 96 pozzetti con mezzi per limitare l'evaporazione (protocollo punto 2.3).
E 'anche importante assicurare che la fase è attentamente calibrata (protocollo passo 3.2). Un errore comune è quello di mettere il piatto sul palco senza garantire completamente la piastra. In questo caso, la posizione della piastra sulla scena può cambiare quando la fase muove, che potrebbe causare alcuni pozzetti essere ripreso parzialmente o per niente. Quando l'imaging diversi piatti in successione, non è assolutamente necessario ricalibrare la fase per ciascuna piastra, purché le piastre sono dello stesso produttore e sono tutti posizionati nella fase in orientamenti identici.
Quando si impostano i parametri di segmentazione automatizzate immagine (protocollo step 3.5), assicurarsi che la maggioranza di ogni pozzetto sarà ripreso. A 3 dpf e anziani, larve di zebrafish tendono a posizionarsi in prossimità dei bordi del WELl, quindi un fattore di riempimento del 90% è raccomandato per assicurare che i bordi di ciascun pozzetto saranno visualizzate. Tuttavia, maggiore è il fattore di riempimento più lungo è il tempo di acquisizione dell'immagine.
È possibile eseguire un algoritmo di cucitura sulle immagini composite per migliorare la risoluzione. Se un algoritmo di cucitura deve essere eseguito, quindi impostare parametri di segmentazione per includere un'immagine sovrapposizione 5-10% (protocollo punto 3.6). Maggiore è la sovrapposizione, migliori sono le prestazioni dell'algoritmo cucitura. In alcuni casi, una sovrapposizione del 10% può consentire cuciture per produrre un'immagine informativo per analisi che non richiede ulteriore visualizzazione utilizzando un obiettivo ingrandimento maggiore. Tuttavia, maggiore è la sovrapposizione più lunga acquisizione immagine assume, come più immagini sarà catturato per pozzetto. Una sovrapposizione dello 0% può essere utilizzato per ridurre il tempo di acquisizione dell'immagine e ridurre al minimo l'esposizione alla luce fluorescente e photobleaching. In questo caso, catturare le immagini più dettagliate di selezionare i pozzetti con un objecti 20xve (Figura 2).
Immagine tempo di acquisizione per questo protocollo dipenderà dai parametri dell'esperimento. Acquisizione delle immagini utilizzando i parametri di questo protocollo (90% fattore di riempimento, 5% di sovrapposizione, tre z-sezioni per immagine catturata e un tempo di esposizione di 50 msec per il canale GFP e 1 msec per il canale campo chiaro) batte tre minuti e 50 secondi per pozzetto. Pertanto, è possibile schermare 60 pozzetti in tre ore e cinquanta minuti. E 'fattibile per lo screening di 180 pozzi al giorno, o 60 composti unici in triplice copia.
Questo protocollo permette l'imaging automatico per tessuti fluorescenza specifica ma presenta diverse limitazioni. Widefield fluorescenza manca la risoluzione del confocale utilizzato in molte tecniche di screening ad alto contenuto. Inoltre, fluorescenza quantificazione è difficile a causa della elevata variabilità nella orientamento di ogni zebrafish all'interno di un pozzo. Questo potrebbe essere evitato l'imaging zebrafish in uniformecondizioni di orientamento, per esempio utilizzando stampi o micropiastre con pozzi che costringono embrioni di zebrafish in orientamenti uniformi 5,10. Il tempo di acquisizione dell'immagine limita il numero di pozzetti che possono essere proiettati al giorno a 180. Screening 180 pozzetti al giorno è un miglioramento significativo rispetto di imaging manuale. Tuttavia, i metodi tipici high throughput possono schermare una media di 10.000 pozzetti al giorno ma richiedono workstation complessi e costosi.
Questo protocollo rappresenta una pratica, meno costosa di screening ad alto contenuto che può essere facilmente adattato da laboratori con un microscopio a fluorescenza invertito widefield. Il metodo di imaging qui descritto permette l'analisi di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni che non sono stati accuratamente montato o orientato, che migliora drasticamente la velocità e la facilità di preparazione dei campioni. Immagini composite possono essere archiviate per riferimento. Questo protocollo è stato sviluppato per consentire ad alta produttività di screening of tessuto-specifici ligandi del recettore degli estrogeni di librerie chimiche e campioni di acqua ambientale. In alternativa, questo protocollo di imaging potrebbe essere utilizzato per schermare qualsiasi reporter fluorescente per l'attività tessuto-specifica.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Susan Farmer e il personale della struttura di ricerca zebrafish UAB per la cura zebrafish. Finanziamenti erogati dai fondi di start-up del Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm plates | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17.2 grams KCl - 0.76 grams CaCl2-2H2O - 2.9 grams MgSO4-7H2O - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150 ml 2% methylene blue 100 μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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