Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish
Summary
Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.
Abstract
Embrioni di zebrafish sono un potente strumento per lo screening su larga scala di piccole molecole. Zebrafish transgenico che esprimono proteine reporter fluorescenti sono spesso utilizzati per identificare le sostanze chimiche che modulano l'espressione genica. Schermi chimici che saggio fluorescenza in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate per lo screening ad alto contenuto. Descriviamo una procedura utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard con un palco motorizzato per l'immagine automaticamente embrioni di zebrafish e rilevare la fluorescenza tessuto-specifica. Utilizzando zebrafish transgenico che segnala l'attività del recettore degli estrogeni attraverso l'espressione di GFP, abbiamo sviluppato una procedura semi-automatica per schermare per ligandi del recettore degli estrogeni che attivano il giornalista in maniera tessuto-specifica. In questo video si descrivono le procedure per arraying embrioni di zebrafish a 24-48 ore dopo la fecondazione (HPF) in una piastra a 96 pozzetti e l'aggiunta di piccole molecole che legano i recettori degli estrogeni. A 72-96 hpf, immagini di ogni bene dal'intera piastra vengono raccolte automaticamente e controllato manualmente per fluorescenza tessuto-specifica. Questo protocollo dimostra la capacità di rilevare estrogeni che attivano i recettori in valvole cardiache ma non nel fegato.
Introduction
Zebrafish transgenici sono stati sviluppati che consentono la visualizzazione diretta di attività in vie di segnalazione, quali fattori di crescita dei fibroblasti 1, acido retinoico 2 e 3 estrogeni, in embrioni vivi. Tali strumenti consentono di screening per sostanze chimiche che perturbano vie di segnalazione (dosati come cambiamento di intensità di fluorescenza) o per le sostanze chimiche che modulano segnalazione in modo tessuto-specifico (cambiamento di localizzazione fluorescenza) 4. La cattura delle immagini automatica aumenta il throughput di schermi chimici drammaticamente 5,6. Schermi che la fluorescenza saggio automaticamente in zebrafish vivo spesso si basano su costosi, attrezzature specializzate. Cosiddetto screening ad alto contenuto offre il vantaggio di alta risoluzione, imaging quantitativo ma a costo di usare lettori di piastre specializzati attrezzati per microscopia confocale 7,8. L'obiettivo di questo metodo è quello di dosaggio fluorescenza automaticamente tessuto-specifica in embrioni di zebrafishin una piastra a 96 pozzetti utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. Fluorescenza tessuto-specifica può essere distinto con questa tecnica e può essere un approccio ragionevole per i laboratori che non hanno accesso ai lettori di piastre specializzati o apparecchiature ad alto contenuto di screening.
In questo protocollo, utilizziamo l'imaging automatizzato per rilevare il recettore degli estrogeni tessuto-specifica (ER) agonisti in zebrafish vivo in tre giorni dopo la fecondazione (dpf). La linea transgenica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 tandem risposta estrogenica elemento sequenze di DNA (ERE) a monte della proteina fluorescente verde (GFP) 3. In assenza di ligando, ER sono normalmente inattive. Legame del ligando innesca un cambiamento conformazionale, che permette recettori legano il DNA ERE e regolano la trascrizione 9. 5xERE: pesce GFP possono essere usati per lo screening librerie chimiche per modulatori ER e possono essere usati per lo screening campioni di acqua ambientale per contaminanti estrogenici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice per automaticamente immagine di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish. Il protocollo è stato sviluppato utilizzando un Zeiss Axio Observer. Z1 con Zen software Blu 2011, ma la tecnica può essere adattata utilizzando qualsiasi microscopio invertito con un palco motorizzato e software di controllo del microscopio in grado di eseguire piastrelle per creare immagini composite. Dotare un microscopio invertito con una fase motorizzato può fornire una pratica a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Susan Farmer e il personale della struttura di ricerca zebrafish UAB per la cura zebrafish. Finanziamenti erogati dai fondi di start-up del Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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