Zebrafish भ्रूण में ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति की अर्द्ध स्वचालित इमेजिंग
Summary
Zebrafish भ्रूण में ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति की अर्द्ध स्वचालित इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल यहाँ है वर्णित है.
Abstract
Zebrafish भ्रूण छोटे अणुओं की बड़े पैमाने पर प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish अक्सर जीन अभिव्यक्ति मिलाना कि रसायन की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है. लाइव zebrafish में प्रतिदीप्ति परख कि रासायनिक स्क्रीन अक्सर उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए महंगा, विशेष उपकरणों पर भरोसा करते हैं. हम एक मोटर चालित चरण स्वतः छवि zebrafish भ्रूण के साथ एक मानक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक प्रक्रिया का वर्णन है और ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति का पता लगाने. GFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से एस्ट्रोजन रिसेप्टर गतिविधि की रिपोर्ट है कि ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग करना, हम एक ऊतक विशेष ढंग से रिपोर्टर को सक्रिय कि एस्ट्रोजन रिसेप्टर ligands के लिए स्क्रीन के लिए एक अर्द्ध स्वचालित प्रक्रिया विकसित की है. इस वीडियो में हम एक 96 अच्छी तरह से थाली में 24-48 घंटे के बाद निषेचन (HPF) पर zebrafish भ्रूण arraying और एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स कि बाँध छोटे अणुओं को जोड़ने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. 72-96 HPF में, प्रत्येक की छवियों को अच्छी तरह सेपूरी थाली स्वचालित रूप से एकत्र और मैन्युअल ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति के लिए निरीक्षण कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल नहीं बल्कि जिगर में हृदय वाल्व में रिसेप्टर्स को सक्रिय कि एस्ट्रोजेन का पता लगाने की क्षमता को दर्शाता है.
Introduction
ट्रांसजेनिक zebrafish ऐसे fibroblast वृद्धि 1, retinoic एसिड 2 कारकों और जीने भ्रूण में, 3 एस्ट्रोजेन के रूप में रास्ते संकेतन में गतिविधि के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देते हैं कि विकसित किया गया है. इस तरह के उपकरण (प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन के रूप में assayed) संकेत दे रास्ते उपद्रव कि रसायनों के लिए या एक ऊतक विशेष ढंग से 4 (प्रतिदीप्ति स्थानीयकरण में परिवर्तन) में संकेत मिलाना कि रसायनों के लिए स्क्रीनिंग सक्षम. स्वचालित छवि पर कब्जा नाटकीय रूप से 5,6 रासायनिक स्क्रीन के throughput बढ़ जाती है. लाइव zebrafish में स्वचालित रूप से परख प्रतिदीप्ति अक्सर महंगा, विशेष उपकरणों पर निर्भर है कि स्क्रीन. तथाकथित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग उच्च संकल्प, मात्रात्मक इमेजिंग लेकिन confocal माइक्रोस्कोपी 7,8 के लिए सुसज्जित विशेष थाली पाठकों के उपयोग की लागत में से लाभ प्रदान करता है. इस पद्धति का लक्ष्य zebrafish भ्रूण में स्वचालित रूप से परख ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति हैएक मानक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में. ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति इस तकनीक का उपयोग प्रतिष्ठित किया जा सकता है और विशेष थाली पाठकों या उच्च सामग्री स्क्रीनिंग उपकरणों के लिए उपयोग की कमी है कि प्रयोगशालाओं के लिए एक उचित दृष्टिकोण हो सकता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम 3 दिनों के बाद निषेचन (DPF) में ऊतक विशेष एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) रहते zebrafish में एगोनिस्ट पता लगाने के लिए स्वचालित इमेजिंग का उपयोग करें. ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (5xERE: GFP) c262/c262 हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के अपस्ट्रीम 5 मिलकर एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्व डीएनए अनुक्रम (ERE) शामिल 3. Ligand के अभाव में, नेताओं सामान्य रूप से निष्क्रिय हैं. Ligand बाध्यकारी रिसेप्टर्स ERE डीएनए बाँध और प्रतिलेखन 9 को विनियमित करने की इजाजत दी, एक गठनात्मक परिवर्तन हो सके. 5xERE: GFP मछली ईआर modulators के लिए रासायनिक पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और estrogenic contaminants के लिए पर्यावरण के पानी के नमूनों की छानबीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण में स्वतः छवि ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति के लिए एक सरल विधि का वर्णन. प्रोटोकॉल एक Zeiss Axio प्रेक्षक का उपयोग कर विकसित किया गया था. Z1 जेन ब्लू 2011 सॉफ्टवेयर के साथ, लेकिन तकनीक समग्र चित्र ब?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सुसान किसान और zebrafish देखभाल के लिए UAB zebrafish अनुसंधान सुविधा के कर्मचारियों को धन्यवाद. औषध विज्ञान और विष विज्ञान विभाग की ओर से शुरू हुआ धन द्वारा प्रदान की धन.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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