Semi-automatisert Imaging av Tissue-spesifikk fluorescens i sebrafisk embryo
Summary
Beskrevet her er en protokoll for semi-automatisert avbildning av vev-spesifikk fluorescens i sebrafisk embryo.
Abstract
Sebrafisk embryo er et kraftig verktøy for storskala screening av små molekyler. Transgen sebrafisk som uttrykker fluorescerende reporter proteiner er ofte brukt for å identifisere kjemikalier som modulerer genuttrykk. Kjemiske skjermer som analysen fluorescens i levende sebrafisk er ofte avhengige av dyre, spesialutstyr for høyt innhold screening. Vi beskriver en prosedyre ved hjelp av en standard epifluorescence mikroskop med en motorisert scene til automatisk bildesebrafisk embryo og oppdage vev-spesifikk fluorescens. Ved hjelp av transgene sebrafisk som rapporterer østrogen reseptor aktivitet via uttrykk for GFP, utviklet vi en semi-automatisert prosedyre for å screene for østrogen reseptorligander som aktiverer reporteren i en vev-spesifikk måte. I denne video beskrives fremgangsmåter for arraying sebrafisk embryoer ved 24-48 timer etter befruktning (HPF) i en 96-brønns plate og tilsette små molekyler som binder østrogenreseptorer. På 72-96 HPF, bilder av hver brønn frahele platen summeres automatisk og manuelt kontrollert for vev-spesifikk fluorescens. Denne protokollen demonstrerer evnen til å oppdage østrogener som aktiverer reseptorer i hjerteklaffene, men ikke i leveren.
Introduction
Transgen sebrafisk har blitt utviklet som tillater den direkte visualisering av aktivitet i signalveier, for eksempel fibroblast vekstfaktorer 1, retinsyre 2 og østrogener 3, levende embryoer. Slike muliggjør screening for kjemikalier som forurolige signalveier (analysert som endring i fluorescens-intensitet) eller på grunn av kjemikalier som modulerer signalering i en vev-spesifikk måte (endring i fluorescens lokalisering) 4.. Automatisert bildeopptak øker gjennomstrømningen av kjemiske skjermer dramatisk 5,6. Skjermer som automatisk analysen fluorescens i levende sebrafisk ofte er avhengige av dyre, spesialisert utstyr. Såkalt høy-innhold screening gir fordelen av høy oppløsning, kvantitativ bildebehandling, men på bekostning av å bruke spesialiserte plate lesere utstyrt for konfokalmikroskopi 7,8. Målet med denne metoden er å automatisk analyse vev-spesifikk fluorescens i sebrafisk embryoi en 96-brønns plate ved hjelp av en standard epifluorescence mikroskop. Tissue-spesifikk fluorescens kan skilles ved hjelp av denne teknikken, og kan være en rimelig tilnærming for laboratorier som ikke har tilgang til spesialiserte platelesere eller høyt innhold screening utstyr.
I denne protokollen, bruker vi automatisert å påvise vevsspesifikk østrogen reseptor (ER) agonister i levende sebrafisk på tre dager etter befruktning (DPF). Den transgene linjen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 inneholder fem tandem østrogen respons element DNA-sekvenser (ERE) oppstrøms av grønt fluorescerende protein (GFP) tre. I fravær av ligand, grunnleggende krav er normalt inaktive. Ligandbinding utløser en konformasjonsendringen, slik reseptorer å binde ERE DNA og regulere transkripsjon ni. 5xERE: GFP fisk kan brukes til å screene kjemiske biblioteker for ER-modulatorer, og kan brukes til å screene miljømessig vannprøver for østrogen forurensninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en grei metode for å automatisk bilde vev-spesifikk fluorescens i sebrafisk embryoer. Protokollen ble utviklet ved hjelp av en Zeiss Axio Observer. Z1 med Zen Blå 2011-programvare, men teknikken kan tilpasses ved hjelp av noen invertert mikroskop med en motorisert scene og mikroskop kontroll programvare som kan utføre flislegging å lage sammensatte bilder. Utstyre en invertert mikroskop med en motorisert stadium kan gi et praktisk, rimeligere alternativ til å kjøpe spesialisert utstyr f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Susan Farmer og de ansatte på UAB sebrafisk forskningsanlegg for sebrafisk omsorg. Finansiering fra oppstart midler fra Institutt for farmakologi og toksikologi.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35mm paltes | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricane methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl – 17.2 grams KCl – 0.76 grams CaCl2-2H2O – 2.9 grams MgSO4-7H2O – 4.9 grams or MgSO4 – 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150mls 2% methylene blue 100μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
- Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
- Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
- Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
- Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
