Semi-automatisert Imaging av Tissue-spesifikk fluorescens i sebrafisk embryo

Summary

Beskrevet her er en protokoll for semi-automatisert avbildning av vev-spesifikk fluorescens i sebrafisk embryo.

Abstract

Sebrafisk embryo er et kraftig verktøy for storskala screening av små molekyler. Transgen sebrafisk som uttrykker fluorescerende reporter proteiner er ofte brukt for å identifisere kjemikalier som modulerer genuttrykk. Kjemiske skjermer som analysen fluorescens i levende sebrafisk er ofte avhengige av dyre, spesialutstyr for høyt innhold screening. Vi beskriver en prosedyre ved hjelp av en standard epifluorescence mikroskop med en motorisert scene til automatisk bildesebrafisk embryo og oppdage vev-spesifikk fluorescens. Ved hjelp av transgene sebrafisk som rapporterer østrogen reseptor aktivitet via uttrykk for GFP, utviklet vi en semi-automatisert prosedyre for å screene for østrogen reseptorligander som aktiverer reporteren i en vev-spesifikk måte. I denne video beskrives fremgangsmåter for arraying sebrafisk embryoer ved 24-48 timer etter befruktning (HPF) i en 96-brønns plate og tilsette små molekyler som binder østrogenreseptorer. På 72-96 HPF, bilder av hver brønn frahele platen summeres automatisk og manuelt kontrollert for vev-spesifikk fluorescens. Denne protokollen demonstrerer evnen til å oppdage østrogener som aktiverer reseptorer i hjerteklaffene, men ikke i leveren.

Introduction

Transgen sebrafisk har blitt utviklet som tillater den direkte visualisering av aktivitet i signalveier, for eksempel fibroblast vekstfaktorer ^1, retinsyre ² og østrogener ^3, levende embryoer. Slike muliggjør screening for kjemikalier som forurolige signalveier (analysert som endring i fluorescens-intensitet) eller på grunn av kjemikalier som modulerer signalering i en vev-spesifikk måte (endring i fluorescens lokalisering) ^4.. Automatisert bildeopptak øker gjennomstrømningen av kjemiske skjermer dramatisk ^5,6. Skjermer som automatisk analysen fluorescens i levende sebrafisk ofte er avhengige av dyre, spesialisert utstyr. Såkalt høy-innhold screening gir fordelen av høy oppløsning, kvantitativ bildebehandling, men på bekostning av å bruke spesialiserte plate lesere utstyrt for konfokalmikroskopi ^7,8. Målet med denne metoden er å automatisk analyse vev-spesifikk fluorescens i sebrafisk embryoi en 96-brønns plate ved hjelp av en standard epifluorescence mikroskop. Tissue-spesifikk fluorescens kan skilles ved hjelp av denne teknikken, og kan være en rimelig tilnærming for laboratorier som ikke har tilgang til spesialiserte platelesere eller høyt innhold screening utstyr.

I denne protokollen, bruker vi automatisert å påvise vevsspesifikk østrogen reseptor (ER) agonister i levende sebrafisk på tre dager etter befruktning (DPF). Den transgene linjen Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 inneholder fem tandem østrogen respons element DNA-sekvenser (ERE) oppstrøms av grønt fluorescerende protein (GFP) ^tre. I fravær av ligand, grunnleggende krav er normalt inaktive. Ligandbinding utløser en konformasjonsendringen, slik reseptorer å binde ERE DNA og regulere transkripsjon ^ni. 5xERE: GFP fisk kan brukes til å screene kjemiske biblioteker for ER-modulatorer, og kan brukes til å screene miljømessig vannprøver for østrogen forurensninger.

Protocol

MERK: Denne protokollen ble godkjent av University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Care og bruk komité.

En. Sebrafisk rogn Samlinger

1. Tre dager før du begynner kjemiske eksponeringer, montere avl tanker med skillevegger til separate menn og kvinner. Fyll hver tank halvveis med akvakultur system vann. Ved hjelp av et nett, overføre Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 fisk til avl tanker, plassere to hanner og tre hunner i hver tank atskilt med en skillevegg. Sett lokk på hver tank og merk med dato og stammer som skal krysses.
2. Følgende morgen, fjerne alle barrierer og tilt forvirrer å skape et grunt område i den ene enden av avl tank. Tillat sebrafisk til å pare seg, samle embryoer på 10 min intervaller for å sikre presis utviklings iscenesettelse. Rene egg ved å skylle gjennom en tesil hjelp E3B medium og forsiktig strakt embryoer inn petriskåler. Returner voksen fisk til permanenttanker.
3. Ved hjelp av en dissekere mikroskop, sortere, telle, og fjern eventuelle ugjødslede, unormale eller skadde embryoer. Plasser embryoer i petriskåler i E3B medium og huset ved 28,5 ° C med en 14:10 lys: mørke-syklusen. Embryo tetthet kan påvirke utviklingen. Plasser ikke mer enn 100 embryoer i en 100 x 35 mm fatet og ikke mer enn 50 embryoer i en 60 x 15 mm fatet.
4. Av 24 HPF, erstatte medier med E3B inneholder 200 mikrometer 1-fenyl 2-thiourea (PTU). PTU hindrer pigmentdannelse og holder sebrafisk embryo og larver transparent for forbedret bildeklarhet. FORSIKTIG: konsentrert PTU lager er farlig; Bruk hansker når du gjør E3B + PTU løsning.
5. På en dag etter befruktning (DPF), manuelt fjerne chorion fra hvert embryo ved hjelp av fine tang. Den chorion ser ikke ut til å påvirke gjennomtrengning av østrogener, men fjerning forbedrer bildeklarhet. Det er ikke nødvendig å fjerne chorions fra media. MERK: Som et alternativ til manuell dechorionation, grupper av embryoer kan chemically dechorionated ved anvendelse av 1 mg / ml pronase behandlingen, som tidligere beskrevet ^11.

2. Kjemisk behandling av embryo

1. Dagen før behandlingen, forberede stamløsninger av hver kjemisk ved 1000 gangers konsentrasjon i DMSO (eller passende løsningsmiddel). For eksempel, for å eksponere embryoer til 10 mikrometer bisfenol A (BPA), forberede en 10 mM BPA stamløsning i 100% DMSO. Dette sikrer ensartet DMSO-konsentrasjonen i hver behandling og gir en ikke-toksisk 1:1.000 fortynning av DMSO for å tjene som en bærer-kontroll. Butikk lager løsninger ved -20 ° C. For denne protokollen vil embryoene bli utsatt for en uM og 10 uM BPA, 18,5 nM og 1,85 uM genistein, 367 nM estradiol (positiv kontroll) og kjøretøyet (0,1% DMSO, negativ kontroll).
   FORSIKTIG: Kjemikalier som BPA og østradiol er farlig og kan ha skadelige effekter på menneskefostre. Håndter hormonforstyrrende med forsiktighet og alltid bruke riktig personlig verneutstyr.
2. På dagen for behandling, forberedt tine lager kjemiske løsninger. Fortynne 1:1.000 ved å pipettere 1 ml E3B + PTU inn i en 1,5 ml mikro rør og legge en ul lager kjemisk løsning. Vortex kraftig. Fortynne DMSO 1:1.000 inn E3B + PTU som et kjøretøy kontroll. Bruk 1 mL E3B + PTU i et 1,5 ml mikrosentrifugerør i en ubehandlet kontroll.
3. Ved hjelp av en stor boring plast overføringspipetten, overføre embryoer fra petriskåler i hver brønn av en 96-brønns plate, tre embryoer per brønn, tre brønner per tilstand. For å hindre fordamping under langvarig behandling, utelate embryoer fra ytre rader og kolonner av platen (rader A og E, kolonne 1 og 12). Ytre brønnene kan fylles med 300 mL av E3B + PTU. Merke plate lokket på riktig måte.
4. Ta ut mediet fra hver brønn med en fin tippet plast overføringspipetten. Arbeid raskt for å unngå uttørking embryoene.
5. Tilsett 200 ul av behandlingsoppløsningen inn i tilsvarende godt. Sett lokket underneath platen som en veiledning for å sikre tilførsel av behandlingene i de riktige brønner. Vortex hvert rør forut for pipettering for å fordele kjemikaliet i løsningen. Bekreftet visuelt hver embryo i behandlingsoppløsningen. Hvis embryoer er på siden av brønnen, brukes en ren overføring pipette for å vaske dem inn i brønnen med behandlingsoppløsningen.
6. Sett platen i inkubator ved 28.5 ° C. Embryoet vil bli analysert for fluorescens ved 72 HPF.

Tre. Automated Imaging av embryo i 96-brønners plater

1. Anesthetize embryoer ved tilsetning av 10 ul av 4 mg / ml Tricaine til hver brønn.
   MERK: Anesthetize embryoer før bildebehandling. På 24-96 HPF, sebrafisk vise spontan bevegelse og en skremmeeffekt til skiftende lyskilde under bildetagning. Anesthetizing embryoer reduserer bevegelse under bildebehandling.
2. Plasser 96-brønns plate i den motoriserte scenen og kalibrere scenen. Bruke Zeiss Zen Blå 2011 programvare for mikros automatiskpå og kontroll, velge eksempel carrier alternativet og velge multiwell 96. Velg kalibrere. Følg trinnvise instruksjonene for å kalibrere scenen.
   MERK: Ikke fjern merket fliser knappen etter dette trinnet. Hvis flisene knappen ikke er avmerket, kan kalibreringsinnstillingene gå tapt, og 96-brønns plate må kalibreres på nytt.
3. Ved hjelp av en 10x objektiv og lysfelt (BF) innstilling, identifisere en positiv kontroll embryo og sette eksponeringsinnstillinger hensiktsmessig for BF og GFP kanaler, noe som gjør at fluorescens-signalet ikke er mette kameraet. Fokusere på et enkelt embryo og programmere mikroskop for å skaffe 3 totalt Z-seksjoner, ett bilde 50 mikrometer over og en 50 mikrometer under dagens fokusplanet.
   MERK: Fordi ulike vev okkupere ulike fokus fly, vil dette sikre at for hver sebrafisk bildene er tatt med hjertet og leveren i fokus.
4. Sett programvare parametere for å skaffe seg en flislagt bilde med GFP og BF channels. Under fanen oppkjøpet, kan du velge avansert oppsett. Velg fliser regioner, deretter fliser. Velg sirkelen godt alternativ.
   MERK: Flis brukes til å lage et sammensatt bilde av hver brønn. Et enkelt felt-of-view fanger opp bare en liten del av hver brønn. Flislegging Funksjonen kan automatisk fange flere tilstøtende felt-of-view fra hver brønn, og skaper et sammensatt bilde av hele godt. Det er derfor mulig å automatisk fange 96 sammensatte bilder per plate, hvor hver sammensatte bildet inneholder flere dusin enkeltbilder fra en enkelt brønn.
5. Velg transportør og fylle faktor 90%. Valg av fyllingsfaktor på 90% vil fange opp flere bilder av de valgte brønner, for eksempel at 90% av arealet til hver brønn vil være synlig i det sammensatte bildet.
   MERK: Ved valg av fyllfaktor, vil et diagram som vises som representerer området som skal avbildes. Velg en prosentandel som vil omfatte det området av brønnsom er hensiktsmessig for eksperimentet.
6. Under alternativer, velger du hvor mye overlapping ønsket.
   MERK: Når du sy sammen fliser for en enkelt representant bilde, en overlapping på 5-10% gir en jevn søm mellom bildene. Men hvis bildet søm er unødvendig, vil bruke en 0% overlapp redusere bilde tid. Ved hjelp av 90% fyllfaktor og 5% overlapping, et sammensatt bilde av en enkelt brønn består av 59 enkeltbilder.
7. Begynn bildebehandling. Mikroskopet vil automatisk hente bilder.
8. Manuelt inspisere sammensatte bilder fra hver brønn for vev-spesifikk fluorescens (figur 1).
9. MERK: Det er best å starte med den positive kontrollen for å bekrefte at kjemisk eksponering jobbet før observere eksperimentelle behandlings brønner.

4. Manuell Image Capture av embryo i 96-brønners plate

MERK: For å bekrefte resultatene, bruker en 20x lang arbeidsavstand mål å actets mer detaljerte bilder manuelt (figur 2).

1. Ved hjelp av en 20x objektiv og lysfelt (BF) innstilling, identifisere en positiv kontroll embryo og sette eksponeringsinnstillinger for BF og GFP kanaler på riktig måte, noe som gjør at fluorescens-signalet ikke er mette kameraet.
2. Identifisere individuelle embryoer og ta bilder manuelt.
   MERK: Når har blitt valgt eksponeringsinnstillingene for den positive kontroll embryo, ikke endrer innstillingene. Dette tillater en sammenligning av fluorescens-intensitet som hvert bilde blir fanget opp under ensartede betingelser.

Representative Results

Figur 1 viser sammensatte bilder fra individuelle brønner i en 96-brønns plate. Hver sammensatt bilde er sammensatt av 59 enkeltbilder med 5% bilde overlapper hverandre. Legg merke til at den levende sebrafisk er orientert tilfeldig innenfor hver brønn, men vi er i stand til å skille fluorescens i hjertet fra leveren. Lysfelt bilder er nyttige som referanser for å vurdere sebrafisk orientering og visualisere morfologiske abnormaliteter (Tall 1A og 1C). Automatisert bildebehandling ved hjelp av et 10x objektiv brukes til å screene kjemikalier og finne ut hvilke garanterer manuell vurdering på et høyere forstørrelse. Figur 2 viser bilder tatt med et 20x lang arbeidsavstand mål for mer detaljerte analyser. Disse bildene ble tatt direkte etter den automatiserte scan avbildet i figur 1 uten å fjerne platen fra objektbordet. Ved hjelp av en 20x objektiv, kan fluorescens i hjertet være nøyaktig lokalisert til hjertet valves (Tall 2C-2F). Innimellom kan det orientering av embryoene være sub-optimal for å ta bilder, og kan føre til tvetydige resultater. Plassere tre sebrafisk per brønn og utfører hver behandling i tre eksemplarer (protokoll trinn 2.3) gir flere muligheter til å visualisere fluorescens nøyaktig.

. Figur 1 Automatisert sammensatt bildebehandling avslører vev-spesifikk fluorescens i hjerteklaffer og lever Lysfelt (A, C) og lysrør (B, DH) bilder av Tg (5xERE: GFP). ^C262/c262 embryoer behandlet med angitte kjemikalier på to dager etter befruktning (DPF) og avbildes på tre dpf. Hvert panel viser et sammensatt bilde av en enkelt brønn (sammensatt av 59 enkeltbilder med 5%overlapping) fra en 96-brønns plate. A og B, Embryoer inkubert i 0,1% DMSO (kontroll over kjøretøyet) er GFP-negative. CH, inkubert med 100 ng / ml 17β-østradiol (E2), 1,85 uM genistein (gen) Embryoer , eller 10 mikrometer BPA utstillings fluorescens i hjerteklaffene (piler) og lever (pilspisser), embryoer behandlet med 18,5 nM gen eller en mikrometer BPA utstillings fluorescens i hjerteklaffene, men ikke lever. B ', digitalt forstørret bilde av en enkelt larve fra eske-regionen i panel B. D', digitalt forstørret bilde av innrammet område av panel D, og ​​så videre. Scale bar = 500 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

.. g> Fig. 2. Detaljert visualisering av GFP-positive hjerteklaffer Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 embryoer som er utsatt for kjemikalier er angitt i 96-brønns plate (se figur 1) ble fotografert manuelt ved høyere forstørrelse, som tillater visualisering av GFP i de atrioventrikulærklaffer (piler) og aorta ventiler (pilspisser) i hjertet. B, D fluorescens og lysfelt bilder slått sammen. Alle bilder er lateral view, anterior til venstre, dorsal til toppen. Scale bar = 50 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver en grei metode for å automatisk bilde vev-spesifikk fluorescens i sebrafisk embryoer. Protokollen ble utviklet ved hjelp av en Zeiss Axio Observer. Z1 med Zen Blå 2011-programvare, men teknikken kan tilpasses ved hjelp av noen invertert mikroskop med en motorisert scene og mikroskop kontroll programvare som kan utføre flislegging å lage sammensatte bilder. Utstyre en invertert mikroskop med en motorisert stadium kan gi et praktisk, rimeligere alternativ til å kjøpe spesialisert utstyr for høyt innhold screening. Motorisert stadier variere fra flere tusen til titusener av amerikanske dollar, avhengig av merke og modell av mikroskopet og kvaliteten på scenen.

Det er flere viktige skritt i protokollen. Enkelte kjemikalier er lysfølsomme, og dermed kan det være fordelaktig å inkubere embryoer i mørket i løpet av behandlingen. Sebrafisk embryo er følsomme for uttørking. Derfor, for kjemiskcal eksponering varte i mer enn én dag er det avgjørende å fylle brønnene langs kantene av 96-brønns plate med mediet for å begrense fordampning (protokoll trinn 2.3).

Det er også viktig å sørge for at scenen er nøye kalibrert (protokoll trinn 3.2). En vanlig feil er å plassere platen på stadium uten å sikre platen helt. I dette tilfelle kan platen posisjon på scenen endres når fasen beveger seg, noe som kan føre til at noen brønner som skal avbildes delvis eller ikke i det hele tatt. Ved avbildning av flere plater etter hverandre, er det ikke absolutt nødvendig å kalibrere fasen for hver plate, så lenge platene er av samme fabrikat og er alle plassert i den fasen i identiske orienteringer.

Når du stiller inn de automatiske bilde flislegging parametere (protokoll trinn 3,5), sikre at et flertall av hver brønn vil bli fotografert. På tre dpf og eldre, sebrafisk larver tendens til å posisjonere seg nær kantene av well, er derfor en 90% fyllfaktor anbefales for å sikre at kantene av hver brønn vil bli visualisert. Imidlertid, jo høyere fyllfaktor i lengre tid for bildeopptak.

Det er mulig å utføre en søm algoritme på sammensatte bilder for å forbedre oppløsningen. Hvis en søm algoritme som skal utføres, og deretter sette flislegging parametere for å inkludere en 5-10% bilde overlapping (protokoll trinn 3.6). Jo høyere overlapping, desto bedre blir ytelsen av sømmen algoritmen. I noen tilfeller kan en 10% overlapping tillater søm for å produsere et informativt bilde for analyse som ikke krever videre visualisering ved hjelp av en høyere forstørrelse objektiv. Men, jo større overlapping lengre bildet oppkjøpet vil ta, så flere bilder vil bli fanget per brønn. En overlapping av 0% kan benyttes for å redusere bildefangsten og for å minimalisere eksponering fluorescerende lys og fotobleking. I dette tilfellet, fange opp mer detaljerte bilder av utvalgte brønner ved hjelp av en 20x objektivtve (figur 2).

Image Capture tid for denne protokollen vil avhenge av parametere for eksperimentet. Image oppkjøpet ved hjelp av parametrene i denne protokollen (90% fyllingsgrad, 5% overlapping, tre z-seksjoner pr tatt bilde og en eksponeringstid på 50 msek for GFP kanalen og en msek for lysfelt kanal) tar tre minutter og femti sekunder per brønn. Derfor er det mulig å screene 60 brønner i tre timer og femti minutter. Det er mulig å screene 180 brønner per dag, eller 60 unike sammensetninger i tre eksemplarer.

Denne protokollen tillater automatisert bildebehandling for vev spesifikk fluorescens, men har flere begrensninger. Widefield fluorescens bildebehandling mangler oppløsningen av confocal bildebehandling brukes i mange high-innhold screening teknikker. I tillegg er fluorescens kvantifisering vanskelig på grunn av høy variabilitet i retningen av hver sebrafisk innenfor en brønn. Dette kunne vært unngått ved bildesebrafisk under jevntorienteringsforhold, for eksempel ved hjelp av muggsopp eller mikroplater med brønner som tvinger sebrafisk embryo i uniform orientering ^5,10. Bildeinnlastingen tid begrenser antall brønner som kan bli screenet per dag til 180. Screening 180 brønner per dag er en betydelig forbedring i forhold til manuell bildebehandling. Men, kan typiske høy gjennomstrømning metoder skjerm gjennomsnittlig 10.000 brønner per dag, men krever komplekse og dyre arbeidsstasjoner.

Denne protokollen er en praktisk, mindre kostbart alternativ til høyt innhold screening som lett kan tilpasses ved laboratorier med en invertert Vidvinkel fluorescens mikroskop. Det avbildningsmetode som er beskrevet her gjør det mulig for analyse av vev-spesifikk fluorescens i embryoer som ikke har vært tilfreds montert eller orientert, noe som drastisk forbedrer hastigheten og enkel prøvepreparering. Sammensatte bilder kan arkiveres for referanse. Denne protokollen ble utviklet for å tillate høy gjennomstrømming screening of vevsspesifikke østrogen reseptorligander fra kjemiske biblioteker og miljøvannprøver. Alternativt kan dette avbildningsprotokoll benyttes for å screene en hvilken som helst fluorescerende reporter for vev-spesifikk aktivitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water